利用非病毒型睡美人转座子系统构建靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

摘要

我们概述了一种利用非病毒型“睡美人”转座子系统制备靶向真菌病原体的嵌合抗原受体-自然杀伤（CAR-NK）细胞的转染方案。为评估抗原特异性激活情况，我们将工程化细胞与Aspergillus fumigatus菌丝管进行共培养，并检测干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平。

摘要

基于嵌合抗原受体（CAR）的细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著疗效。近年来，这些疗法正被开发用于传染病的治疗，但针对真菌感染的研究仍较为有限。为了确定最佳靶点并优化细胞治疗产品，我们建立了一种工程化嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）的方法，并评估了其对真菌刺激的反应。本文介绍了一种利用非病毒型“睡美人”转座子系统生成针对真菌靶点的CAR-NK细胞的简便且稳健的方法。将NK-92细胞共转染编码高活性转座酶SB100X的微型环状DNA（MC）载体以及质粒编码的CAR转座子。转染效率通过流式细胞术在1周后进行评估。在功能检测前，利用磁珠激活细胞分选技术富集表达外源基因的细胞，并继续培养1周。为评估抗原特异性激活情况，将工程化细胞与Aspergillus fumigatus菌丝管共培养至少6小时，随后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测分泌的干扰素-γ（IFN-γ）浓度。

引言

Aspergillus fumigatus（A. fumigatus）是一种广泛存在的真菌，普通人每天会吸入约100至1,000个分生孢子¹。在患有获得性或先天性免疫缺陷的患者中（例如正在接受化疗或患有白血病的患者），A. fumigatus 可引起严重的侵袭性曲霉病。全球每年有超过20万人感染曲霉病。尽管已使用抗真菌药物（如唑类衍生物）进行预防和治疗，但死亡率仍介于30%至95%之间^2,3。此外，此类治疗具有显著的副作用，且已有7%的A. fumigatus培养株对唑类药物产生耐药性⁴。

嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞疗法在治疗恶性疾病方面已显示出临床疗效，并在对抗侵袭性曲霉病等感染性疾病中取得了有前景的临床前结果^5,6,7,8我们先前描述的靶向细胞壁中某种蛋白的Af-CAR-T细胞 A. fumigatus 菌丝在临床前模型中已显示出良好的效果⁶.

移植物抗宿主病、细胞因子释放综合征和神经毒性的风险降低，使得CAR-NK细胞成为针对急性感染的即用型（"off-the-shelf"）治疗方案中一种有价值的CAR-T细胞替代选择⁹。此外，自然杀伤（NK）细胞已被证实在外抗真菌免疫应答中发挥关键作用。当受到A. fumigatus刺激时，NK细胞会分泌IFN-ɣ等细胞因子以及CCL-3和CCL-4等趋化因子，并释放细胞毒性颗粒^10,11。

NK-92细胞系是自然杀伤细胞遗传工程的常用来源，具有在相对简单的培养条件下快速增殖和扩增的优势¹²多项临床前研究已证实，经CAR转导的NK-92细胞在治疗血液系统肿瘤和实体瘤方面具有治疗潜力。目前正在进行多项临床试验，以评估其安全性、有效性及潜在的临床应用价值 "现成的" 细胞治疗¹³.

在自然杀伤（NK）细胞中实现高效的转染效率和稳定的外源基因表达具有挑战性。尽管病毒方法可实现较高的转染效率，但存在插入突变导致继发性肿瘤发生的风险^9,14。新一代的“睡美人”（Sleeping Beauty, SB）转座子载体提供了一种安全、高效且经济可行的稳定基因转移系统，克服了病毒载体及瞬时非病毒基因递送方法的局限性¹⁵。

因此，本方案概述了一种生成Af-CAR-NK-92细胞的新型方法，该细胞有望作为 "即用型" 治疗危及生命的侵袭性曲霉病患者的一种治疗选择。该方法的有效性体现在经刺激后IFN-ɣ的产量显著增加 A. fumigatus 菌丝

方案

此处描述的所有实验均须在无菌条件下进行。本方案中，我们展示了两种条件：（I）不含DNA的模拟转染，作为对照；（II）使用先前描述的Af-CAR⁶进行CAR转染。Af-CAR质粒在CAR下游包含一段截短的表皮生长因子受体（EGFRt）序列，将用作转染标记物（补充图S1）。每种条件下均需要4 × 10⁶个NK-92细胞。

1. NK-92 细胞的培养

1. 转染前一至两天，配制新鲜细胞培养基，成分如下：75% (v/v) α-MEM 培养基（含核苷）+ 12.5% (v/v) 热灭活胎牛血清（FBS）+ 12.5% (v/v) 热灭活马血清 + 2 mM L-谷氨酰胺。
2. 将至少 10⁷ 个 NK-92 细胞重悬，细胞密度为 5 × 10⁵ 个细胞/mL。
3. 向细胞悬液中加入白细胞介素-2（IL-2），终浓度为 150 UI/mL。
4. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿化培养箱中培养。
   注：IL-2 也可使用终浓度为 5 ng/mL。

2. 非病毒转染

1. 在显微镜下检查细胞质量。细胞呈簇状悬浮且背景清晰，表明细胞培养状态良好。
2. 在6孔板中，每孔每种条件加入2 mL细胞培养基。将培养板置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中。
   注意：抗生素可能降低转染后的细胞活力。培养基中应避免使用抗生素。
3. 计数细胞，并使用（例如台盼蓝染色法）检测细胞活力。
4. 将8 × 10⁶个NK-92细胞转移至15 mL锥底离心管中。以200 × g离心5分钟，加速度和减速度均设为3。后续所有离心步骤均使用此程序。
5. 离心过程中，准备两个1.5 mL离心管。将Af-CAR的DNA（8 µg质粒DNA和4 µg SB100X微型环状DNA，表1）移入其中一管。另一管不加DNA，作为Mock对照。
6. 离心结束后，轻柔弃去上清液，并向含有细胞的离心管中加入最多15 mL预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。
7. 离心（步骤2.4）。
8. 离心过程中，为每种条件准备一个转染系统用管，每管加入3 mL电转缓冲液。将第一管放入移液器工作站中。
9. 离心结束后，轻柔弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于200 µL重悬缓冲液中（每4 × 10⁶细胞使用100 µL）。
   注意：避免细胞在重悬缓冲液中停留超过15–30分钟，否则会降低细胞活力和转染效率。
10. 将100 µL细胞悬液分别加入两个反应管中，轻轻混匀。
    注意：移液时避免产生气泡，气泡会导致电弧放电，进而引起细胞死亡。
11. 使用转染系统移液器吸取第一个反应管中的DNA-细胞混合液，并将移液器垂直插入移液器工作站中的转染管内。
    注意：确保移液器吸头安装到位。
12. 设置第一次电击参数为1,650 V，脉冲时间为20 ms，然后按下启动。
13. 第一次电击完成后，设置第二次电击参数为500 V，脉冲时间为100 ms，按下启动。
14. 电击完成后，缓慢将移液器从工作站中取出，并立即将细胞转移至已准备好的培养板的一个孔中，该孔内含有2 mL预热的细胞培养基（参见步骤2.2）。轻柔地以环形方式晃动培养板，确保细胞均匀分布。
15. 对于Mock样本，从不含DNA的反应管中取100 µL细胞悬液（参见步骤2.9），使用新的离心管和新的移液器吸头，重复步骤2.11至步骤2.14的操作。
16. 将培养板置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中培养。
17. 培养30分钟后，加入IL-2，使其终浓度为150 UI/mL。

3. 使用流式细胞术检测转染效率

1. 细胞每隔一天培养并传代一次，一周后，取每种条件下 1-5 × 10⁵ 个细胞至聚苯乙烯圆底试管中。
2. 加入 1 mL 缓冲液（PBS + 0.5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA）洗涤细胞，离心后弃去上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于 50 µL 缓冲液中，加入 1 µL 7-AAD 以检测死细胞。
4. 加入 5 µL anti-tEGFR-Alexa fluor 647 抗体，用于标记转染的细胞。
5. 在 4 °C 下孵育 20 分钟。
6. 洗涤细胞（参见步骤 3.2）。
7. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 缓冲液中。
8. 使用流式细胞仪检测样品。
   注意：若转染效率不理想，可继续进行目的基因表达细胞的富集。

4. 通过磁性激活细胞分选（MACS）富集表达转基因的细胞

注意：为了获得最佳结果，建议从 8-10 × 10⁶ 个细胞开始实验。所有离心步骤均在 4 °C 下进行。

1. 按照步骤 3.2 所述配制缓冲液。在 15 mL 圆底离心管中，用缓冲液将细胞稀释至浓度为 1–2 × 10⁶/100 µL。
2. 每 1–2 × 10⁶ 个细胞加入 1 µL 抗 EGFRt-生物素抗体，轻轻旋转混匀离心管，确保溶液均匀分布。
3. 在 4 °C 下孵育 25 分钟，然后用缓冲液加满至 10 mL。
4. 离心，弃去上清液。
5. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 8 µL 冷缓冲液。
6. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 2 µL 抗生物素磁珠。
7. 在 4 °C 下孵育 15 分钟。
8. 用缓冲液加至 10 mL 进行洗涤。
9. 离心，弃去上清液，并将细胞重悬于 500 µL 缓冲液中。
10. 将 LS 柱置于 MACS 磁铁上，并用 3 mL 缓冲液洗涤。
11. 待缓冲液完全流经柱子后，立即加入细胞悬液。
12. 用 3 mL 缓冲液洗涤柱子 3 次。
13. 将柱子从磁铁上取下，放入一个洁净的 15 mL 圆底离心管中。
14. 向柱中加入 5 mL 缓冲液，使用推杆尽快将 EGFR 阳性细胞洗脱下来。
15. 将细胞培养数天后，通过流式细胞术检测分选效率。

5. 功能测试

注意：进行接下来的实验时，请准备并使用以下培养基：RPMI + 20% FBS。

1. 第1天 - 接种Aspergillus fumigatus分生孢子
   1. 在培养基中制备浓度为2.5 × 10⁵ 个分生孢子/mL的A. fumigatus分生孢子悬液。
   2. 在96孔培养板中，每孔加入100 µL分生孢子悬液，于25 °C孵育16小时。
      注意：孵育结束后，分生孢子将开始萌发（图1）。
2. 第2天 - 与CAR NK-92细胞共培养
   1. 用培养基将Mock组和Af-CAR NK-92细胞洗涤2次。
   2. 以效应细胞与靶细胞比例为2:1的条件进行共培养，每孔加入含5 × 10⁴ 个细胞的100 µL培养基（图2）。
   3. 阳性对照组每孔加入1 ng PMA和100 ng离子霉素溶于100 µL培养基中；仅含培养基的细胞作为阴性对照。
   4. 将培养板置于37 °C、加湿的CO₂培养箱中孵育至少6小时。
   5. 以300 × g离心5分钟。
   6. 收集每孔100 µL上清液，避免触碰孔底；将上清转移至反应管中。
      注意：确保仅吸取上清液，避免吸取生长的真菌。如有疑问，可增加一次离心步骤。
   7. 按照试剂盒说明书进行IFN-ɣ ELISA检测，或立即将样品储存于-80 °C待用。

结果

生成Af-CAR NK-92细胞的整个过程，包括转染、恢复、富集和扩增，大约需要14天。转染后，细胞每两天传代一次。在转染后第2天首次传代时，细胞活力可能会下降。通常，细胞在转染后第4天恢复并开始增殖，倍增时间为48小时。

恢复后，检测转染效率，预期可达10-20%（代表性结果见图3）。通过MACS富集EGFR阳性细胞，可使Af-CAR NK-92细胞的比例提高至95%以上（代表性结果见图4）。

功能检测使用Af-CAR细胞比例超过95%的培养物。在此实验中，我们将细胞与A. fumigatus菌丝管共培养6小时，并检测IFN-ɣ的分泌作为细胞活化的标志。如图5所示，与对照NK-92细胞（均值 = 75.6 ± 19.5 pg/mL）相比，Af-CAR细胞表现出显著更高的细胞因子分泌水平（均值 = 340.6 ± 86.5 pg/mL），表明Af-CAR细胞的活化程度显著增强（p值 = 0.03）。

图1：烟曲霉的芽管。孵育16小时后A. fumigatus的显微镜图像。可见芽管/短菌丝均匀分布于孔周围。比例尺 = 400 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：Aspergillus fumigatus 菌丝与 NK-92 细胞的共培养。共培养的显微图像。NK-92 细胞形成细胞簇，并与 A. fumigatus 菌丝接触。比例尺 = 400 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

图 3：通过转染标志物 EGFR 染色评估转染效率。 在电穿孔后的第 5 天，对 NK-92 细胞进行 7-AAD 和抗 EGFR 染色。结果显示了一次代表性实验的结果，分别为（A）对照组和（B）Af-CAR NK-92 细胞。左列为细胞大小与细胞颗粒度的散点图；门控设定在 NK-92 细胞上。通过 7-AAD 标记排除死细胞（第二列）。活细胞中 EGFR⁺ 细胞的百分比显示在第三列。缩写：EGFR = 表皮生长因子受体；7-AAD = 7-氨基放线菌素 D；CAR = 嵌合抗原受体。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：表达外源基因的NK-92细胞富集后细胞表面染色结果。 左侧显示Mock细胞，右侧显示Af-CAR-NK细胞。红色直方图代表未染色细胞，蓝色直方图代表相应染色细胞。门控设在EGFR⁺细胞上；数值表示阳性细胞的百分比。缩写：EGFR = 表皮生长因子受体；CAR = 嵌合抗原受体。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：烟曲霉菌丝激活的自然杀伤细胞的细胞因子分泌。图中显示了Af-CAR细胞与Mock细胞在与真菌共培养6小时后，通过ELISA检测的IFN-ɣ分泌结果。数据为三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。使用GraphPad Prism 10软件通过Welch's t-检验计算P值，* p < 0.05。缩写：NK = natural killer；IFN-ɣ = interferon gamma；CAR = chimeric antigen receptor；ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay。请点击此处查看该图的放大版本。

	名称	公司	储存浓度	参考文献
转座酶	SB100X Mini Circle	PlasmidFactory	1 µg/µL	19
转座子	Af-CAR 质粒	本实验室制备	1 µg/µL	6

表1：本实验方案中使用的DNA。

补充图 S1：Af-CAR 转座子的质粒图谱： 质粒载体的示意图及 CAR 转座子的设计。缩写：EF1 = 延伸因子-1α 启动子；ORI = 细菌复制起点；LIR = 左侧反向重复序列；RIR = 右侧反向重复序列；Cyto = 胞内区；Tm = 跨膜区。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案提供了一种简单且可靠的方法，利用非病毒型Sleeping Beauty转座子系统制备靶向真菌病原体的CAR-NK细胞。该方法可实现大片段转基因的稳定且永久性插入，从而支持细胞扩增以获得后续分析所需的足够数量细胞^14,16。

影响转染成功的关键因素包括细胞数量和活力、脉冲强度 和持续时间，以及DNA的质量和数量¹⁷。在开始实验前必须评估细胞的健康状态，确保细胞活力至少达到90%。研究表明，提高脉冲强度可增强细胞群体的转染效率，但这种方法也可能导致细胞活力显著下降。当细胞数量过多而DNA的量或质量有限时，成功摄取质粒的细胞数量可能不足¹⁷。然而，高浓度的DNA已被证明具有细胞毒性，会降低细胞活力¹⁸。

既往研究虽已实现较高的转染效率，但仅专注于瞬时蛋白表达¹⁷。相比之下，我们的实验方案可确保外源基因的稳定整合。为解决转染效率低的问题，我们采用了对成功转染细胞进行富集的策略，最终获得约95%的CAR表达细胞。然而，该步骤使生产周期延长至约1周。若需缩短生产时间，可将转座子DNA以微环（minicircle）形式递送，此举可提高转染效率，并可能省去富集步骤¹⁹。尽管如此，由于需要留出细胞恢复与增殖的时间，生产周期无法缩短至<1周。

鉴于侵袭性曲霉病的急性特征， "现成的" 细胞治疗将具有显著优势。然而，从患者体内分离细胞以及扩增原代细胞所面临的挑战和高昂成本，使得NK-92细胞系成为CAR-NK细胞制备中一种便捷且广受欢迎的选择。²⁰NK-92 细胞通常具有较强的活力，并在 IL-2 存在下快速增殖，可在相对较短时间内获得大量细胞。鉴于这些优势，我们开发了一种对 NK-92 细胞进行基因工程改造的方案，证明了安全转染并制备高纯度 CAR-NK 细胞产品的可行性。尽管该方案可经调整用于制备原代 CAR-NK 细胞，但仍需考虑若干修改，包括优化电穿孔脉冲的次数与强度、所用 DNA 的量，以及建立合适的扩增方案。对该方案的任何修改均需进行充分验证，以确保其有效性。然而，本方案提供了一个基础模板，未来可据此调整用于原代 NK 细胞的实验。

总之，这种用于生成稳定表达Af-CAR的NK细胞的创新转染方案是一种高效且可重复的方法，可用于靶向其他疾病。此外，该方法还可作为一种经济有效的手段，用于筛选针对多种抗原的新型CAR。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 毫升锥底管	Greiner Bio-One	188271	PP，17/120 毫米，CELLSTAR，无菌
50 mL 锥形底离心管	Greiner Bio-One	227270	PP，30/115 毫米，CELLSTAR，无菌
6孔和96孔细胞培养板	康宁生命科学公司	83-3736/ 83-3474	经TC处理的多孔板，平底，表面经处理以促进细胞最佳贴附，经γ射线辐照灭菌，无热原
7-AAD（7-氨基放线菌素D）	BD 生物科学	559925	用于流式细胞术检测中排除非活细胞的即用型核酸染料
Alexa Fluor 647 抗人 EGFR 抗体	Biolegend	352918	克隆 AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure	Miltenyi Biotec	130-105-637	与单克隆小鼠抗生物素抗体偶联的 UltraPure MicroBeads
Aspergillus fumigatus	ATCC	46645
生物圈滤芯提示（20 和 100） μL	Sarstedt	70.3030.365 / 70.3030.275
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich	D8537	无钙、无镁改良型液体，经无菌过滤，适用于细胞培养，内毒素已检测
ELISA MAX Deluxe Set 人IFN-γ	Biolegend	430104
乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）	Sigma-Aldrich	E7889	用于分子生物学，0.5 M in H2O、DNase、RNase、NICKase 和蛋白酶均未检出，0.2 μm 过滤。
FACS 清洁	BD 生物科学	340345
FACS 流式鞘液	BD 生物科学	342003
FACS 清洗液	BD生物科学	340346
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F7524	经无菌过滤，适用于细胞培养，使用前需热灭活
Gibco，最低必需培养基（MEM） α，核苷	赛默飞世尔科技	22571020	酚红、核糖核苷、脱氧核糖核苷、碳酸氢钠
马血清	赛默飞世尔科技	16050122	经无菌过滤，使用前热灭活
人IL-2免疫测定，研究级	Miltenyi Biotec	130-097-742	研究级。ED50 为 ≤0.3 ng/mL，相当于活性为 ≥3 × 106 IU/mg
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	来自凝聚链霉菌（Streptomyces conglobatus），用作细胞因子分泌的阳性对照
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	W368401	用于细胞培养
MACS LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	色谱柱和柱塞，无菌包装
NK-92	DSMZ	ACC 488
Neon 转染系统 100 μL-Kit	赛默飞世尔科技	MPK10096	重悬缓冲液 R，电解缓冲液 E2，100 μL型Neon电穿孔提示，Neon电穿孔管
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P1585-1MG	用作细胞因子分泌的阳性对照
5 mL 聚苯乙烯圆底管	BD生物科学	S-452400	用于流式细胞术
反应管，1.5 mL	Greiner Bio-One	7,26,90,001	聚丙烯，透明，带盖，带刻度。使用前已灭菌。
RPMI 1640 培养基，GlutaMAX	赛默飞世尔科技	72400021	GlutaMax I  酚红，HEPES，无菌过滤
TipOne 1000 μL XL 带刻度滤芯吸头	StarLab	S1122-1730
<强>仪器设备
BD FACSCalibur	BD生物科学
CO2 C60 培养箱	Labotect
Heraeus Multifuge 3SR	赛默飞世尔科技
HydroFLEX 微孔板洗涤仪	Tecan
NanoQuant Infinite M200 Pro	Tecan
Neon 转染系统	Invitrogen
移液器	Eppendorf
Quadro MACS 分离器	Miltenyi Biotec