需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

1.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67431

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Medicine, University of Toronto, 4Department of Medical Biophysics, University of Toronto

本文内容

摘要

本方案概述了脂质微泡的制备方法，以及一种兼容的“一锅法”微泡放射性标记技术，该方法标记效率超过>95%，无需纯化步骤，且能保持微泡的理化特性。该方法适用于多种不同的脂质微泡配方，可根据需要定制，以制备放射性标记和/或荧光标记的微泡。

摘要

微泡是具有脂质外壳的充气颗粒，已从血管超声造影剂发展为革命性的癌症治疗平台。当与治疗性聚焦超声（FUS）结合使用时，微泡可安全且局部地克服生理屏障（例如血脑屏障），将药物递送至原本难以触及的癌症病灶（如胶质母细胞瘤和胰腺癌），并用于治疗神经退行性疾病。微泡-FUS的治疗手段正朝着新的方向发展，包括与放射治疗的协同联合应用、多模态成像技术，以及从微泡外壳实现一体化的药物装载与递送。

使用放射性示踪剂标记微泡是建立这些扩展性诊疗功能的关键。然而，现有的微泡放射性标记策略依赖于已知会干扰微泡理化特性的纯化方法，使用半衰期较短的放射性同位素，且并不总能实现稳定的螯合。这些因素共同导致了微泡放射成像准确性以及肿瘤部位放射性同位素递送效率的不确定性。

本方案描述了一种新型的一锅法、无需纯化的微泡标记方法，可在实现>95% 放射性核素螯合效率的同时，保持微泡的理化性质。该方法具有良好的通用性，可成功应用于不同酰基脂质链长度、电荷以及螯合剂/探针（卟啉、DTPA、DiI）组成的定制型和商业化微泡制剂。该方法既可在从头制备微泡的过程中灵活应用，也可用于已制备好的微泡制剂，实现荧光及多模态荧光/放射性性质的模块化定制。因此，这种灵活的方法能够制备出可追踪的（放射性、荧光或放射/荧光双活性）定制化多模态微泡，有助于推动微泡-聚焦超声（FUS）在机制研究、成像和治疗应用中的发展。

引言

微泡是一种微米级的超分子诊疗剂，其核心为气体，外层由蛋白质、聚合物或多数情况下的脂质壳包裹以维持稳定图1A）。当注入血液后，微泡可维持气/液界面，在其气体核心溶解前的数分钟内可通过超声检测到1,2因此，微泡的首次临床应用是作为实时超声成像的对比剂3治疗性聚焦超声（FUS）的发明拓展了微泡的临床应用。在低频FUS刺激下，微泡发生振荡，产生从短暂的血管通透性增加到局部组织消融等一系列可调控的靶向机械力4,5因此，在过去20年中，微泡联合聚焦超声（microbubble-FUS）已被用于血脑屏障（BBB）开放、肿瘤（如胰腺癌、脑瘤及肝转移性癌症）的药物和成像探针递送、神经退行性疾病治疗以及肿瘤消融。6,7,8,9,10,11.

微泡诊疗工具的发展正不断朝着新颖而令人振奋的方向推进。传统的微泡-聚焦超声（FUS）递送应用依赖于在给予治疗剂或成像载荷的同时联合使用商用微泡。目前，人们日益关注通过深入理解微泡壳层与生物体之间的相互作用、探索定制的非商用微泡配方，以及开发将载荷直接负载于微泡壳层上的一体化诊疗型微泡，来增强微泡-FUS的递送能力12,13,14。事实上，约40%的脂质微泡药物递送研究采用了此类壳层负载型微泡15。除了成像和药物递送外，微泡-FUS在增强癌症放射治疗效果方面也展现出潜力16，并可通过声动力疗法激活原本无害的壳层负载试剂的抗肿瘤作用17,18。

通过在微泡外壳上标记放射性示踪剂，可更战略性地推进微泡在癌症应用中的传统与拓展方向。在一体化载药微泡领域，此类放射性标记能够：1）实现对载药微泡外壳在靶向与非靶向组织中生物分布的金标准定量评估；2）建立药代动力学结构-活性关系，从而指导微泡组分的最优选择，以最大化靶向递送效率；3）为一体化载药系统的战略性、合理化的影像引导应用与治疗规划提供依据（例如组织靶点类型、剂量测定、药物选择以减轻非靶向安全性问题，以及相较于传统联合治疗模式的效用评估）。15,19在临床前阶段，对微泡壳层去向的深入理解也有助于阐明微泡-聚焦超声（FUS）更广泛的作用机制。例如，已有研究表明，微泡壳层中的脂质向靶细胞转移可影响FUS介导的声孔效应12,20因此，理解并优化这种转递过程可为涉及声孔效应的临床前及临床微泡-聚焦超声治疗提供重要依据（体外 转染、药物递送、肿瘤消融、辐射增敏和声动力治疗20,21,22,23,24,25). 双模超声与放射成像设施还可实现仅使用单一显像剂即可对聚焦超声血管开放及治疗过程进行监测（例如血脑屏障开放动力学），而无需采用传统的双显像剂设计26同理，脂质微泡的放射性标记可作为一种一体化单剂微泡-FUS/放射治疗替代方案，取代微泡-FUS与放射性药物共递送平台。27.

微泡的不稳定性为这类标记带来了不容忽视的挑战。目前所有已有的放射性标记策略均受限于已知会影响微泡稳定性和尺寸的纯化方法，其中一些方法还存在标记效率低下和标记不稳定的问题28,29,30,31,32。纯化步骤的要求还导致实验流程更加耗时。结合使用半衰期较短的放射性同位素（例如 18F t1/2 1.8 h28,29，99mTc t1/2 6 h32，68Ga t1/2 1 h31），这会导致因放射性同位素衰变而产生的效率损失，并限制放射性成像和治疗规划的时间窗口。总体而言，这些局限性可能导致获得的放射性成像时间缩短且缺乏代表性、药代动力学数据不准确，以及肿瘤部位放射性同位素递送效率低下。

本研究通过利用卟啉强大的稳定金属螯合能力，克服了上述局限性。卟啉是一类有机杂环大分子，具有高度共轭的平面环结构和一个可容纳多种金属的中心配位位点。其中包括半衰期较长的放射性同位素铜-64（t1/2 12.7 h），该同位素可用于正电子发射断层扫描（PET）和γ计数分析33。当与脂质骨架偶联时，卟啉可被快速整合至超分子结构中，并高效、稳定地螯合铜-64，同时保持未标记母体颗粒的原有特性，且在血清中具有良好的稳定性33,34。此外，卟啉本身具有荧光活性，在纳米和微米颗粒中可发生模块化的自猝灭现象，当颗粒破裂时荧光得以恢复；这一特性为PET和γ计数提供了互补的检测手段，有助于实现整体和显微水平上的壳层命运分析（图1A）15。

通过使用卟啉-脂质作为螯合剂，利用这些特性开发出一种新型的一步法、无需纯化的微泡放射性标记方法（图1B，C) 克服了现有微泡放射性标记方法相关局限性的技术。该方案实现了 >95% 的铜-64螯合效率，无需标记后纯化，且保持微泡的理化性质。可轻松整合到脂质微泡激活前的“自下而上”制备过程中。图1B）。该方法具有多功能性，可成功应用于不同酰基脂质链长度（C16至C22）、电荷类型（中性与阴离子）及卟啉脂质组成（1 mol%、10 mol%、30 mol%）的定制化或商业化微泡制剂，生成兼具放射性和荧光活性的微泡。其适应性还可拓展至卟啉以外的分子。该“一锅法”方案可经修改，使用其他市售的螯合剂（如二乙烯三胺五乙酸（DTPA）-脂质）和荧光染料（如DiI）。此外，也可通过“掺入”（spiking）策略对预先制备的微泡制剂进行标记。因此，该方法可实现定制化、可追踪（放射性、荧光性或双模放射/荧光活性）微泡的制备，有助于推动微泡-聚焦超声（FUS）在机制研究、成像及治疗应用中的发展。下述方案详细说明了脂质微泡的制备、一锅法放射性标记的操作流程、必要的放射性标记效率及理化性质表征，以及可能的方案优化。

卟啉脂质微泡形成示意图；荧光、超声、放射性标记过程设置。
图1：微泡制备及放射性标记方案。（A）以焦脱镁叶绿酸-a-脂质形式存在的卟啉脂质在本方案中作为多模态螯合剂。作为与铜-64螯合的单体（i），其具备正电子发射断层扫描（PET）及成像能力。其荧光在颗粒形态下（微泡（ii）及其溶解后产生的纳米后代（iii））被淬灭，而在颗粒破裂后（iv）恢复荧光。（B）本报告所述的脂质膜水合/活化方案，用于从头开始生成脂质微泡；（C）在脂质悬浮液形成与微泡活化之间整合一步法放射性标记。该图经Rajora等15许可改编。请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 试剂的准备

  1. 制备醋酸铵缓冲液（0.1 M，pH 5.5）
    1. 使用分析天平，称取770.8 mg醋酸铵至称量纸上。将称好的样品转移至一个洁净的250 mL玻璃烧杯中。
    2. 用刻度移液管量取90 mL双蒸水（ddH2O），加入烧杯中。放入搅拌子，并将烧杯置于磁力搅拌器上，搅拌至醋酸铵完全溶解。搅拌速度应使溶液形成轻微漩涡，但不发生飞溅。
    3. 根据仪器说明书，使用pH 4和pH 7标准缓冲液校准pH计。校准完成后，将pH探头插入醋酸铵缓冲液中。
    4. 向溶液中加入104 µL乙酸，搅拌至溶解后测定pH值。
      注意：此时pH值应接近5.5。
    5. 使用微量移液器，以5–10 µL为增量，逐次加入10 N氢氧化钠（若缓冲液过碱，则使用盐酸）调节缓冲液pH值。每次加入后充分搅拌并测量pH值，必要时重复操作。记录所加入碱或酸的总体积。
    6. 加入适量ddH2O，使缓冲液总体积达到100 mL。
      注意：例如，若在pH调节过程中使用了45 µL的10 N氢氧化钠，则需向烧杯中加入9.851 mL ddH2O（100 mL [目标体积] - 90 mL [步骤1.1.2] - 0.104 mL [步骤1.1.4] - 0.045 mL [步骤1.1.5] = 9.851 mL）。
    7. 在将缓冲液转移至带盖储存容器前，最后充分搅拌一次。
    8. 按照仪器说明书清洁pH计。
      警告：浓的氢氧化钠水溶液和盐酸可能引起皮肤刺激，操作时应佩戴手套。
  2. 制备水合缓冲液（PGG）
    1. 用注射器吸取磷酸盐缓冲液（PBS），并在末端安装孔径为0.2 µm的聚醚砜注射器滤器。将PBS过滤至一个洁净的带盖塑料离心管中。
      注意：只要膜材料与PBS和醋酸铵兼容，也可使用其他膜材料（例如聚偏二氟乙烯）的0.2 µm孔径注射器滤器。
    2. 使用微量移液器，按照8:1:1的体积比将过滤后的PBS、丙二醇和甘油混合，制成水合缓冲液（也称为PGG）。在加入丙二醇和甘油时，吸取试剂后应缓慢将移液器吸头外表面残留的液滴擦拭干净，再缓慢将试剂加入PBS中。此时PBS中会出现清晰的丝状黏性浑浊现象。
      注意：建议先用p1000移液器将PBS加入离心管，再依次加入丙二醇和甘油，因为后两种试剂黏度较高。吸取时应缓慢操作，直至移液器吸头内液体完全停止流动，且在移出试剂瓶时避免吸入空气。理想情况下应使用带有体积刻度的移液器吸头，以便选择与刻度对应的试剂体积（例如，配制1 mL或5 mL PGG时，分别使用吸头上的0.1 mL或0.5 mL刻度，以确认丙二醇和甘油已完全吸取）。擦拭移液器吸头表面时，切勿擦拭吸头开口处，仅可擦拭侧面。
    3. 将移液器吸头浸入溶液中反复吹打，直至试剂均匀溶解。注意避免引入气泡。
    4. 为确保水合缓冲液充分混匀，盖紧离心管后缓慢上下翻转混匀。切勿涡旋振荡。
    5. 在不超过1000 × g 的条件下离心20–30秒（最低温度4 °C，最高室温），以去除肉眼不可见的气泡。
  3. 制备水合/放射性标记缓冲液（AA-PGG）
    1. 参照步骤1.2.1，分别使用注射器滤器对0.1 M、pH 5.5的醋酸铵缓冲液（来自步骤1.1）和PBS进行过滤，并收集至不同的离心管中。
    2. 使用p1000微量移液器，按照5:3:1:1的体积比（醋酸铵缓冲液 : PBS : 丙二醇 : 甘油），依次将过滤后的醋酸铵缓冲液、过滤后的PBS、丙二醇和甘油加入离心管中。参照步骤1.2.2–1.2.5的操作说明进行吸取、混合和离心，制备AA-PGG。
  4. 即时薄层色谱（iTLC）洗脱液
    1. 称取不超过0.1 g的乙二胺四乙酸（EDTA），转移至带盖小瓶中。用ddH2O溶解，配制成2% w/v的EDTA溶液（例如，50 mg EDTA加入2.5 mL ddH2O）。
    2. 将2% w/v EDTA溶液与步骤1.1制备的醋酸铵缓冲液按9:1的体积比（90% EDTA溶液，10%醋酸铵缓冲液）混合。盖紧瓶盖，储存所得的iTLC洗脱液。

2. 脂质膜的形成

注意：本实验方案概述了形成一种脂质膜的方法，其组成模拟了市售微泡Definity®，其中卟啉脂质取代了宿主脂质，并占总脂质的30 mol%。然而，该放射性标记方案可适用于多种不同的脂质配方（如C16、C18、C22碳链长度，中性或阴离子电荷，以及不同摩尔比例的卟啉脂质）。随附的补充电子表格（补充文件1）提供了所述及其他配方的计算过程、组成成分、质量及储备液体积。除卟啉脂质——焦脱镁叶绿酸-a-脂质（pyro-lipid）外，所有脂质均可商业获得，其合成方法已有详细报道35,36。

  1. 使用补充文件1，根据所需脂质膜的数量确定每种脂质所需的总质量。
  2. 在分析天平上称量一个空的0.5 dram玻璃小瓶。
    注意：灰尘会影响微泡的成功形成。因此，若小瓶储存时未加盖，请用加压空气吹入小瓶以去除任何灰尘或颗粒物。
  3. 将1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）称量至称量纸上。
    注意：称取的质量应根据步骤2.1计算结果，并额外增加0.5–1 mg，以补偿后续操作中可能的样品损失。
  4. 将DPPC转移至已称重的玻璃小瓶中，并重新称重以确定小瓶内脂质的质量。该方法有助于更轻松地将脂质转移至玻璃小瓶，减少脂质粉末的损失或洒落，并提高脂质质量测量的准确性。
  5. 对其他脂质重复步骤2.2至2.4：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]（DPPE-mPEG）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸（DPPA）和C16焦脂质。
    注意：如果焦脂质无法以可称量的粉末形式获得，而是以薄膜或未知量的分装形式存在，则可将其溶解于氯仿中配制成储备液，其浓度可通过在甲醇中测定紫外-可见吸收值，利用比尔-朗伯定律计算得出，方法如前所述35。
  6. 使用微量移液器或玻璃注射器，在玻璃试管中配制以下有机溶剂和溶液：1）氯仿，2）9:1 v/v 氯仿:甲醇，3）65:35:8 氯仿:甲醇:ddH2O。对于第三种溶液，按以下顺序移取组分并混合：ddH2O、甲醇，最后是氯仿。
    警告：甲醇和氯仿具有健康危害性，易燃且易挥发。请佩戴护目镜、手套和实验服，并在通风橱中操作。
  7. 使用补充文件1计算配制脂质储备液所需的有机溶剂/溶液体积，并选择适当容量的玻璃注射器。
    注意：该体积应使储备液浓度对应每张膜使用15–100 µL储备液分装量，可方便地用25–100 µL玻璃微量注射器准确量取。
  8. 用氯仿冲洗玻璃注射器三次，并反复推动活塞以干燥注射器。
  9. 根据步骤2.7中的电子表格计算结果，使用清洁的玻璃注射器将有机溶剂/溶液量取并加入各个脂质小瓶中，以形成脂质储备液。将焦脂质溶于氯仿（除非如步骤2.5注释所述已预先溶解），DPPC和DPPE-mPEG溶于9:1 v/v 氯仿:甲醇，DPPA溶于65:35:8 氯仿:甲醇:ddH2O。若使用同一支玻璃注射器进行所有添加操作，每次更换脂质前需彻底冲洗并干燥。
    注意：若所选配方不含DPPA或其C18链长变体，则焦脂质、宿主PC脂质和PEG脂质均可溶于氯仿。
  10. 盖上小瓶盖并涡旋振荡。
  11. 通过玻璃微量注射器，将计算体积的脂质储备液加入新的0.5 dram玻璃小瓶（成膜小瓶）中。加入第一种脂质储备液时，将针尖插入小瓶底部中央，并缓慢推注以避免液体溅至瓶壁。后续添加时，将针尖置于液面上方，并轻触瓶壁以去除末端液滴，确保针头不接触下方液体。
    注意：若发生交叉污染，应在每次添加脂质之间冲洗并干燥玻璃注射器。若需制备多张膜，在添加过程中应将成膜小瓶和储备液小瓶均盖上盖子，以尽量减少溶剂挥发。
  12. 手动轻轻旋转小瓶，保持直立状态以混匀内容物。避免液体溅至瓶壁。
  13. 打开瓶盖（妥善保存盖子），并将氮气管插入小瓶顶部空间。调节氮气流速，使液面产生轻微可见扰动，但不得形成漩涡或溅出液体。
  14. 插入氮气管后立即涡旋小瓶。从低速开始，调节至足以形成漩涡但溶剂上升高度不超过瓶底1 cm为宜。避免溶剂溅出。随着溶剂蒸发，缓慢且连续地提高涡旋速度，维持溶剂高度直至所有液体完全蒸发。最终在小瓶底部三分之一区域形成一层均匀的薄膜。
  15. 将小瓶放入配有真空装置的干燥器中，在真空条件下继续干燥8–72小时。用铝箔包裹小瓶（除开口外）或整个干燥器。
    注意：本方案可在此处暂停。后续步骤可在成膜干燥后进行，或在氩气环境中密封（使用Parafilm），于-20 °C冰箱中保存成膜，最长可达1个月；若保持干燥，可保存更长时间。

3. 脂质膜水化

注意：如果使用微泡 体外 或 体内在步骤3.3至5.4中，除非另有说明，应使用无菌移液器吸头、离心管、注射器和针头。

  1. 从真空环境中取出薄膜，或若为冷冻保存，则使其升温至室温。
  2. 取一个 250 mL 烧杯，加入水并加热至 70–80 °C。
  3. 将水浴超声仪预热至 69 °C。
  4. 用微量移液器将 1 mL AA-PGG（步骤 1.3）沿脂质膜小瓶内壁缓慢加入，避免产生气泡。
    注意：制备非螯合对照组或仅含荧光标记的微泡时，应使用 PGG（步骤 1.2）替代 AA-PGG。
  5. 将瓶盖部分覆盖小瓶开口，留出足够空间插入全氟丙烷（PFP）导管。将 PFP 通入小瓶顶空液面上方 20 秒，使液体明显扰动但不飞溅。切勿将 PFP 直接通入溶液中。随后盖紧瓶盖。
    注意：若气体流速和通气时间充足，小瓶表面将开始感觉变凉。
  6. 将小瓶下半部分浸入 70–80 °C 水浴中 1 分钟。然后在 69 °C 的水浴超声仪中至少超声 30 秒，直至脂质膜在 AA-PGG 中均匀分散。避免产生气泡或提前激活微泡形成（提前激活会在脂质悬液中出现乳白色或浑浊区域）。必要时擦拭小瓶表面，以便更清楚地判断是否仍有未溶解的脂质残留。
    注意：若在超声 1 分钟后脂质膜仍未水合，需重新将其置于 70–80 °C 水浴中加热，并再次超声处理。
  7. 当脂质膜完全均匀悬浮后，再次加热 1 分钟，并额外超声 30 秒。
  8. 擦拭小瓶外壁，使其自然冷却至室温（约 5–10 分钟）。
  9. 按照步骤 3.5 的方法，重新用 PFP 填充小瓶顶空，盖紧瓶盖，并用 Parafilm 封住瓶盖边缘。
    注意：本实验流程可在此处暂停，最迟可在 8 小时内恢复操作。

4. 放射性标记

注意：对于未螯合的对照或仅含荧光的微泡，请跳至方案第5节。

警告：除非另有说明，否则本方案的步骤 4.4–4.6 必须在放射性实验室中进行。64CuCl2 具有放射性危害，可通过皮肤接触、吸入或摄入导致多系统毒性。操作时应尽可能在通风橱内使用带橡胶尖端的镊子间接处理。操作过程中须穿戴防护实验服、个人指环和胸章剂量计，并佩戴双层手套。确保在2英寸铅屏蔽条件下操作64CuCl2。必要时，应将其置于铅包容器中运输。使用后须对废物容器进行屏蔽，并进行污染操作检测。

  1. 制备一种 60 °C 在装有磁力搅拌子的玻璃烧杯或大型结晶皿中准备水浴。使用带温度控制的加热/搅拌板，并将热探针插入水中，调节搅拌速度至形成微弱但可见的漩涡。
  2. 转移一个密封的小瓶，其中含有 64CuCl2 使用带橡胶尖端的镊子将0.1 N HCl中的样品转移至活度计。
    注意：订购时 64CuCl2，要求将其溶解于5-20 µL 0.1 N HCl。较低的体积对于保持微泡产率至关重要。
  3. 记录剂量校准仪测得的铜-64活度及测量时间。使用镊子取走小瓶，并将其放入铅容器中。
  4. 将记录的体积所对应的活性进行分配 64CuCl2 获得 MBq·mL-1 值
  5. 打开第3.9步中的脂质悬浮液管盖，并将其固定在样品瓶架中。
  6. 打开盖子 64CuCl2 小瓶，并用镊子固定。
  7. 微量移液器吸取一定体积的 64CuCl2 溶液，其放射活性为 40–250 MBq，转移至脂质悬浮液中。确保移液枪头完全浸入悬浮液内，推入后反复吹打，以确保完全转移 64CuCl2.
    注意：试剂的用量 64CuCl2 添加的量将取决于放射性标记微泡的预期用途以及剂量校准器的灵敏度。用于纵向（注射后长达48小时）PET成像和血液采样 体内 在小鼠中，建议的最小剂量分别为220 MBq和50 MBq。
  8. 同时封闭脂质悬浮液和 64CuCl2 小瓶
  9. 使用平头橡胶尖镊子，手动上下翻转放射性脂质悬浮液至少5次，以轻柔混匀 64CuCl2 通过悬液时避免振荡或摔落离心管，避免气泡产生。
  10. 当瓶体正置时，轻轻弹击瓶盖，同时保持悬液稳定，以使滞留在瓶盖内的液体沉降至瓶底。小心地将瓶盖部分打开，插入带有18 G针头的PFP管路。按照步骤3.5，向瓶内顶空充入PFP气体20秒。盖紧瓶盖，并用Parafilm密封。
  11. 使用活度计测量小瓶的放射性活度，并记录时间。
    注意：如果转移至小瓶的活性不足，请重复步骤 4.5–4.11，并加入适量的额外体积 64CuCl2.
  12. 将小瓶放入泡沫小瓶架中，推入至小瓶下半部分暴露于热源。将支架置于搅拌器中 60 °C 水浴加热1小时。
  13. 在螯合反应进行的同时，准备iTLC板。佩戴新的手套，将玻璃纤维层析纸裁剪成1 cm × 8 cm的条状。将条状纸条在高温下处理 80 °C 玻璃干燥箱
    注意：此步骤可在非放射性实验室中进行。
  14. 孵育1小时后，将4.12步骤中的样品管从加热设备中取出，并用纸巾擦拭管口边缘。
  15. 使用带橡胶尖头的镊子手动上下旋转小瓶，使瓶壁上的冷凝液重新凝结回脂质悬浮液中。
  16. 将小瓶保持直立，固定住管体的同时轻弹瓶盖。移除封口膜，并擦拭瓶盖周围，以去除残留的水浴液。
  17. 小心打开小瓶盖，吸取1-2 µL 脂质悬液。将悬液点样于iTLC试纸底部中央上方1 cm处，并重新盖紧小瓶。待斑点干燥。
    注意：为确保准确性，每种放射性标记的脂质悬液对应的每个反应混合物应至少点样2个iTLC板并进行展开。
  18. 微量移液器 200 µL 将1.4步制备的iTLC洗脱液加入至10 mL试管底部。将试管置于铅容器中。将点样后的iTLC条放入试管，使条带展开至洗脱液前沿距条带上缘约1 cm处。
  19. 使用镊子取下已展开的iTLC试纸条。将试纸条垂直持握，在γ计数器上方将其剪成三段，分别落入与推盖匹配的5 mL圆形塑料管中，确保每一段试纸条直接落入对应的试管内。将推盖插入三个试管中。
  20. 测量含有铜-64标记条带的试管以及一个空盖控制管在γ计数器中的放射活性，并记录每分钟计数（cpm）。从其他读数中减去控制管的放射活性，以校正本底放射活性。
    注意：试纸条底部三分之一（片段1）的校正读数与脂质悬浮颗粒螯合的铜-64相关。中间部分（片段2）含有游离铜-64的条带 64非超分子形式的铜-吡咯-脂质螯合物。上层部分（片段3）主要含有游离的铜-64。
  21. 通过公式 1 计算放射化学纯度。
    纯度百分比公式，方程；实验分析中校正每分钟计数（CPM）的计算。     （公式 1）
    注意：如果第1块的cpm值明显过低（例如，低于或相当于第2块或第3块），或任何读数超过γ计数器的非线性/饱和阈值，应点样更小体积或稀释后的等分试样（1-2 µL用于iTLC的放射性标记悬浮液的量。
  22. 确保每种脂质悬液的两条iTLC试纸测得的放射化学纯度均≥94%方可继续。若未达到，需继续加热脂质悬液 60 °C 并通过iTLC每30分钟监测一次螯合反应。
  23. 打开放射性标记脂质悬浮液小瓶的瓶盖，用微量移液器吸取 8.89 µL 加入1 N NaOH至悬浮液中，用移液器吹打混匀，以完全转移碱液并中和悬浮液。盖紧小瓶，用镊子手动旋转使其倒置/复位，然后轻轻敲击瓶盖。
  24. 按照步骤4.10，用PFP填充顶空，加盖并用Parafilm密封。

5. 微泡激活与分离

  1. 使用机械振荡器以4530 rpm的速度活化脂质悬浮液45秒，生成乳白色的微泡悬浮液。将小瓶静置，被动冷却至室温，约10分钟。所得乳白色悬浮液随时间逐渐分为两层。
    注意：激活后，小瓶内容物应呈乳白色。激活后悬液较澄清表明激活不成功，其可能原因将在后续章节中讨论。
  2. 恢复至室温后，轻轻翻转小瓶以重新悬浮微泡悬液。将小瓶置于平坦表面，静置2分钟后再进行倾倒，以获得所需的微泡群体，具体如下：
    1. 使用1 mL塑料注射器配18 G针头，通过抽吸并推注空气的方式对注射器/针头进行排气。在2分钟时间点，迅速打开小瓶盖，一次性动作打破Parafilm封口膜。
    2. 吸取400-550 µL 避免吸入上层含有较大非目标微泡群体的泡沫层，从瓶底收集目标微泡群体。
      注意：如有需要，可将离心管倾斜至一侧，以收集末端液体至注射器中，避免吸取上层泡沫状/较轻的液层。
  3. 小心擦拭针头边缘，去除任何泡沫状污染物，并将分离的微泡悬液转移至微量离心管中。轻轻盖上管盖（切勿突然开合管盖）。此即为最终的放射性标记微泡工作悬液。
  4. 测量最终微泡产物在活度计中的放射性活度并记录时间。将该数值除以第5.2步中倾出的悬液体积，得到 MBq·mL-1 根据具体应用需求计算注射体积的数值。
    注意：放射性标记的微泡现已准备好使用，第6节的操作可在24小时内进行。有关这些放射性标记微泡的注射与追踪方法的信息 在体 通过多模态（超声、PET、荧光）成像，参见 Rajora 等人15.

6. 验证放射性标记效率

  1. 通过轻柔吹打或倒置试剂瓶重悬微泡悬液。
    注意：切勿对微泡工作产品进行涡旋振荡。涡旋振荡会导致微泡悬液失稳。
  2. 加入10-200 µL 将放射性标记的悬液加入0.5 mL、分子量截留值（MWCO）为30,000的离心过滤装置中。若使用体积 <200 µL，加入ddH₂O2O 至滤波单元以构成总 200 µL 体积。将滤器单元放入适配的微量离心管中，并盖上管盖。
    注意：在进行任何应用之前，应单独开展放射性标记测试 体外 或 体内 建议使用放射性标记的微泡以确保实验方案成功完成。在此情况下，应使用较大体积（例如， 200 µL）可在本步骤中使用。当后续将该方案用于治疗时，应先准备治疗所需的体积/注射剂，然后尽早使用剩余的放射性标记微泡悬液进行第6节操作。
  3. 12,000 × g 离心 10 分钟 g 室温下
    注意：微型离心机周围应设有铅屏蔽。
  4. 用剪刀剪断微量离心管与管盖之间的连接部分。
    1. 将盖子放入已标记为“caps”的20 mL 闪烁瓶中。将滤膜装置转移至新的微量离心管（管2）中。
    2. 将装有上清液的第一支微量离心管放入已标记为“tube 1”的20 mL 闪烁瓶中。加入 200 µL ddH₂O2O 至 2 号管中的滤膜装置。
  5. 将2号管中的滤器单元在12,000 x g条件下离心 g 室温下
  6. 重复步骤 6.4 和 6.5。将 2 号管的管盖加入装有 1 号管管盖的“管盖”闪烁小瓶中。将 2 号管放入一个新的 20 mL 闪烁小瓶中。
  7. 剪下第三个微量离心管的管盖，并按照步骤6.4将其放入标记为“caps”的小瓶中。将滤过装置转移至一个新标记为“unit”的20 mL 闪烁瓶中，确保管3中的上清液保留在原管内，不随装置转移至“unit”瓶中。若发现滤过装置边缘有液滴，应将其重新放回管3中，盖上管盖，离心10 s。随后将管3放入一个新的20 mL 玻璃闪烁瓶中。
  8. 盖上5个闪烁瓶（1号管、2号管、3号管、瓶盖和组件）。准备一个空的、带盖的20 mL闪烁瓶作为空白对照。
  9. 在γ计数器上测量6个闪烁瓶中的铜-64放射性活度。从其他样品瓶的放射性活度中扣除空白瓶的放射性活度。使用公式2计算放射性标记/螯合效率。
    效率计算公式，用于定量分析的效率百分比方程。    （公式 2）
    注意：如果单位cpm过低（例如，低于或相当于本底管的读数），或任何读数超过γ计数器的非线性/饱和阈值，应将闪烁小瓶置于铅容器中存放最多4天，使放射性活度衰减至阈值以下，然后重新测量。

7. 微泡的理化表征

注意：除非实验室配备有专门用于放射性样品处理的设备，否则微泡的理化表征必须使用非放射性“冷”铜螯合样品进行。这种“冷”标记有助于评估微泡产率，而微泡产率对于确定特定应用中所用微泡剂量至关重要。此外，还可通过与未螯合的对照微泡进行比较，以确保放射性标记过程不会改变微泡的原有性质。此类“冷”标记及相关理化表征应在放射性标记微泡应用前完成，并可在需要调整放射性标记方案时作为反馈依据（见讨论部分）。

  1. “冷”铜微泡标记
    1. 根据步骤4.7中加入脂质悬浮液的64CuCl2溶液体积、脂膜中卟啉的摩尔百分比组成以及64CuCl2产品说明书中提供的比活度，计算放射性标记过程中实现的金属与卟啉的近似摩尔比。示例计算见补充文件1。
    2. 按照本方案的第1–3节操作。
    3. 用0.1 N HCl配制0.1 mg·mL-1的CuCl2溶液。
    4. 根据步骤7.1.1的计算结果，用微量移液器将适量体积的CuCl2溶液加入脂质悬浮液中，并盖紧小瓶。
    5. 旋转小瓶使CuCl2与脂质悬浮液混合，用PFP填充顶空，密封后按照步骤4.9、4.10和4.12进行加热。操作小瓶时无需使用橡胶镊子。
    6. 1小时后，将小瓶从加热装置中取出，擦干外壁，让其冷却至室温。
    7. 中和脂质悬浮液，混合，用PFP填充顶空并密封，操作同步骤4.23和4.24。
    8. 激活微泡悬浮液，并按步骤5.1–5.3倾倒获得工作产物。
  2. 微泡粒径分析
    注意：微泡粒径分析应在激活后立即进行。若需评估工作悬浮液的稳定性，应每隔30分钟重复一次样品制备和测量。通常，1–2小时的时间窗口可代表微泡工作悬浮液在激活后使用或给药的实际时间段。稳定性测量的目的是确保在此时间段内微泡的粒径和产量保持稳定，从而使从工作溶液中给予的所有处理含有相似的微泡群体。
    1. 开启库尔特计数器（CC），使用编辑SOP工具设置以下参数：30 µm孔径，0.6–18 µm粒径范围，孔径电流400–600 µA，前置放大器增益4–8，400个通道，每次运行前后冲洗，体积分析，样品体积5 µL。
    2. 通过0.2 µm介质真空过滤装置过滤CC电解液。将电解液容器及另一个用于样品制备的容器装满。
    3. 背景测量：向10 mL一次性比色皿中加入10 mL过滤后的电解液，运行基线测量。确保计数低于400。若超出，需冲洗仪器。
    4. 样品测量
      1. 向新的比色皿中加入10 mL过滤后的电解液。通过手动反复倒置重悬微泡悬浮液。从瓶底中心吸取5 µL样品。擦拭移液器吸头边缘（除开口外），并将样品直接插入已准备好的电解液中。
      2. 上下吹打以完全转移悬浮液。用移液器吸头轻轻搅动电解液，直至微泡悬浮液的“丝状”物完全分散。
    5. 在CC上测量样品（每种分析物测量两次）。
      注意：对于微泡浓度为1–5 × 109 微泡·mL-1的样品，5 µL的样品体积通常合适。根据具体的CC仪器设置以及样品微泡产量是否超出上述范围，可能需要调整该样品体积。
  3. 共聚焦成像
    注意：应在微泡粒径分析后立即进行共聚焦成像，并在微泡稳定性保持的时间范围内完成，具体参见步骤7.2的注释。
    1. 重悬微泡悬浮液，取1–5 µL转移至玻璃载玻片中央。小心地将盖玻片覆盖在微泡悬浮液滴上，避免夹入气泡。悬浮液将在盖玻片下扩散。
    2. 使用油浸物镜在60倍放大下对微泡进行成像。获取明场图像以及633 nm激发/640–765 nm发射条件下的荧光图像。叠加明场与荧光图像。
      注意：当探针均匀整合于微泡壳层中时，所有可见颗粒的壳层上应出现重叠的荧光信号。
  4. 荧光光谱法
    注意：荧光光谱测量可在微泡激活后24小时内进行。
    1. 按先前描述的方法配制1% Triton X-10035。
    2. 在首次测量前15–30分钟开启荧光分光光度计。
    3. 使用石英比色皿，以410 nm激发波长和600–800 nm发射波长范围测量1% Triton X-100的荧光光谱。选择通过参考检测器信号归一化信号的选项（通常称为S1/R1）。
      注意：Triton X-100在移液时容易产生气泡。因此，转移至比色皿时仅需压至移液器第一停点。
    4. 每次样品间用甲醇冲洗比色皿，并用加压空气吹干。
    5. 将6 mL 1% Triton X-100转移至15 mL离心管中。重悬微泡悬浮液，用微量移液器吸取1 µL。除开口外，擦拭吸头边缘，将样品转移至已准备好的1% Triton X-100中，上下吹打完成转移。涡旋混合后转移至石英比色皿。
      注意：根据仪器灵敏度和非线性饱和阈值，调整样品与1% Triton X-100的比例。
    6. 使用步骤7.4.3的参数测量该样品。此测量对应“破裂”颗粒。
    7. 使用PBS重复步骤7.4.3–7.4.6。此测量对应“完整”颗粒。
    8. 分别使用1% Triton X-100和PBS的测量值对破裂和完整样品的光谱进行基线校正。
    9. 通过公式3计算淬灭效率（QE），使用PBS中完整样品（FPBS）和1% Triton X-100中（FTx）的积分基线校正荧光信号：
      量子效率公式图，QE=(1-(积分比))×100%，光学吸收计算。    （公式3）
  5. 紫外-可见光谱法
    注意：光谱测量可在微泡激活后72小时内进行。
    1. 在室温下使用浴式超声仪对微离心管中的微泡悬浮液等分试样进行超声处理，直至悬浮液变为透明。这可减少光谱分析过程中的散射效应。
    2. 在首次测量前10分钟开启分光光度计。选择0.25 nm的扫描间隔和200–800 nm的采集范围。启用基线扣除功能。
    3. 使用1 cm光程的石英比色皿进行测量。每次测量之间用甲醇冲洗比色皿，并用加压空气吹干。
    4. 获取甲醇的基线测量值。
    5. 涡旋处理已超声并呈透明的微泡悬浮液，取10–50 µL转移至含有200–1000 µL甲醇的微离心管中。确保使用洁净的玻璃微量注射器测量并加入甲醇体积。涡旋混合以获得“破裂”样品。
      注意：样品稀释倍数取决于卟啉负载效率和摩尔百分比组成。对于30 mol%吡咯脂质组成的微泡，20倍稀释是合适的。
    6. 采集紫外-可见吸收光谱。
    7. 使用PBS代替甲醇，重复步骤7.5.4至7.5.6。
      注意：可使用微量移液器测量PBS体积，无需使用玻璃微量注射器。

8. 实验方案的修改

  1. 替代螯合剂
    1. 按照第2节步骤制备脂质膜，将吡咯脂质替换为其他脂质偶联铜螯合剂（例如，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-二乙烯三胺五乙酸（铵盐），以下简称DTPA-脂质）。使用 补充文件 1 计算所需的质 量和储备液体积。
      注意：可能需要测试替代螯合剂的不同摩尔组成，以确定其上限浓度，超过该浓度则无法生成高产率的稳定微泡。
    2. 按照第3至第6节步骤制备并表征放射性标记的微泡。
    3. 按照步骤 7.1 至 7.3 对“冷”铜螯合微泡进行表征。仅需获取明场共聚焦显微镜图像以评估颗粒形态。若替代螯合剂具有荧光性，则除步骤 7.4 和 7.5 外，还需在相应的激发和发射波长下进行共聚焦显微镜观察。
  2. 替代荧光团
    1. 按照第2节步骤制备脂质膜，将吡咯脂质替换为其他脂质偶联或嵌入型荧光染料（如DiI）。使用 补充文件 1 计算所需的质 量和储备液体积。
      注意：可能需要测试不同摩尔比例的替代荧光染料，以确定超过该上限后无法生成高产率稳定微泡的临界点。
    2. 按照第3节操作，但使用PGG替代AA-PGG。
    3. 完成步骤 5.1 至 5.3 以及步骤 7.2 至 7.5。
  3. “加标”法：标记预先形成的微泡脂质悬浮液
    1. 按照第2节方法制备原卟啉-脂质膜，仅使用吡咯-脂质，不添加其他脂质成分。参考 补充文件 1 用于焦磷酸脂质的定量。
    2. 根据第3节，使用100-200 µL 使用AA-PGG（若无需放射性标记则使用PGG）1 mL，代替1 mL水化缓冲液。
    3. 将全部热解脂质悬液转移至预先制备的脂质微泡悬液中。
    4. 用PFP填充顶空，加热并超声处理悬浮液，并按照步骤3.4至3.9在PFP气氛下密封。监测热致脂质悬浮液在预制脂质微泡悬浮液中的分散情况，并持续进行加热/超声处理循环，直至完全分散。
      注意：如果使用隔膜密封的商用微泡试剂瓶，可通过注射器/针头将热解脂质悬浮液注入瓶中，无需用全氟戊烷（PFP）重新填充瓶内顶空。
    5. 进行放射性标记（见下文步骤8.3.5.1）、活化、分离（见下文注释）及相关表征，具体操作参见第4至第7节。
      1. 另一种方法是首先对水合的焦磷酸酯类脂质悬浮液进行放射性标记，然后监测 >94% 放射化学纯度，用 1 N NaOH 中和（根据用于水合热解脂质膜的 AA-PGG 体积调整 NaOH 体积），然后按照步骤 8.3.3 将放射性标记的热解脂质悬浮液加入预先制备的微泡脂质悬浮液中。
        注意：仅当后续采用分离步骤去除脂质水合过程中产生但未被整合入微泡的亚微米多层囊泡时，才可使用此改良方法制备荧光标记或多模态放射性标记微泡。详见讨论部分。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

制备放射性标记微泡时的关键可量化结果是放射化学纯度和放射性标记效率。本方案分别采用薄层色谱法（iTLC）和经过验证的离心程序对这两项指标进行表征。图2A显示，在模拟商用微泡的配方中，当载体脂质被1 mol%、10 mol%或30 mol%的吡咯脂质取代时，平均放射化学纯度和标记效率均达到或超过95%。其中，1 mol%和10 mol%吡咯脂质配方需要更高浓度的脂质悬浮液（0.15 mL vs 1 mL）才能达到上述数值。本方案实现的高放射化学纯度和螯合效率，使得标记后无需进行纯化步骤。

对于由C16、C18和C22链长脂质组成且整体表面电荷为中性或阴离子的替代配方，这一现象同样成立（图2B）。这些变体以30 mol%的焦磷酸脂质组分进行装载，该比例基于先前确定的上限，可维持平均微泡尺寸及可接受的微泡产率（>1 × 109 微泡·mL-1，以及限制 >8 µm 在最大化热脂质及其可激活荧光与金属螯合能力的同时生...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

目前的脂质微泡放射性标记方案可实现>95% 的放射化学纯度、>95% 的螯合效率，并在无需任何标记后纯化的前提下保留微泡的理化性质。这些成果是以往现有标记方法所未能达到的。由于省去了纯化步骤，放射性核素（本例中为铜-64）可更快投入使用，从而减少因放射性衰变导致的无效活度损失。微泡性质的保持，结合铜-卟啉螯合物已知的稳定性33，更能确保后续的放射性成像或治疗所反映的是目标微泡的特性，而非游离放射性核素或经纯化处理后改变性质的微泡群体的特性。

本方案也是首个整合了并行的"冷"标记与关键表征技术的方法，以确保微泡理化性质的保留。事实上，这是首个对微泡的尺寸、产率和稳定性进行系统表征的放射性标记微泡方案。理解这些性质对于放射性标记微泡的应用至关重要。必须掌握微泡的尺寸、气体体积和产率，才能确定微泡的剂量，而剂量又直接影响微泡-聚焦超声（FUS）治疗的安全性和有效性。例如，微泡-FUS 血脑屏障（BBB）开放存在微泡剂量/气体体积的上限，超过该限值可能导致FUS后出血和炎症，带来安全隐患

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢多伦多安大略省大学健康网络时空靶向与辐射反应放大（STTARR）项目的 Deborah Scollard 和 Teesha Komal 提供的技术服务与指导。我们还感谢 Mark Zheng 和 Alex Dhaliwal 博士在共聚焦显微镜实验期间提供的技术协助，以及多伦多安大略省先进光学显微镜设施提供的相关设备。我们谨此致谢以下资助机构：加拿大卫生研究院、特里·福克斯研究所、加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大创新基金会、玛格丽特公主癌症基金会、加拿大研究主席计划、麦克劳克林中心、范尔奖学金计划、安大略省研究生奖学金计划、加拿大前列腺癌基金会以及彼得伯勒 K. M. 亨特慈善基金会。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
64CuCl2华盛顿大学医学院，马林克罗特放射学研究所N/A小体积订购<10 µL) 溶于 0.1 N HCl
乙酸 任何公司≥ 95% 纯度
铝箔任何公司
乙酸铵任何公司纯度： ≥ 98%
分析天平任何公司可测量至 0.1 mg
超声波清洗机任何公司可加热至69 oC
CC光圈 - 30微米贝克曼库尔特A36391颗粒直径范围：0.6–18 μm
CC电解液贝克曼库尔特8546719Isoton II 稀释液
CC 软件贝克曼库尔特Multisizer 4e
离心过滤装置（0.5 mL，30,000 MWCO）及配套的微量离心管MilliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0.5 mL
15 mL 带盖离心管任何公司
氯仿任何公司纯度： ≥ 99.8% 
库尔特计数器贝克曼库尔特B43905Multisizer 4e 库尔特计数器
盖玻片VWR48393081VWR 微型盖玻片
CuCl2任何公司确保未氧化
CuCl2
比色皿-石英，1 cm光程任何公司
比色皿 - 用于CC测量的10 mL塑料比色皿贝克曼库尔特A35471库尔特计数器 Accuvette ST
ddH2O任何公司可通过超纯水净化系统获得
DiI（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）任何公司粉末状
剂量校准仪任何公司能够读取铜-64
DPPA（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸钠盐）Avanti Polar Lipids830855P粉末状
DPPC（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）Avanti Polar Lipids850355P粉末状
DPPE-MPEG（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（铵盐））Avanti Polar Lipids880200P粉末状
DTPA-脂质（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-二乙烯三胺五乙酸（铵盐））Avanti Polar Lipids790106P粉末状
EDTA（乙二胺四乙酸）任何公司
γ计数器任何公司能够读取铜-64
伽马计数管推入式管帽Globe Scientific22-171-66512 mm试管用带法兰插头盖
伽马计数管Sarstedt55.15795 mL，75 x 12 mm，PS
玻璃烧杯 - 250 mL任何公司可耐受高达 100 的温度 oC
玻璃干燥烘箱任何公司可加热至 80 oC
玻璃微量注射器 - 25、50、100、1000 µL任何公司与有机溶剂兼容
20 mL 玻璃闪烁瓶VWR66022-081VWR® 闪烁小瓶，硼硅酸盐玻璃，带螺口盖，含纸浆衬垫
玻璃小瓶 - 0.5 打兰VWR66011-020VWR 小瓶，1/2 dr，带黑色酚醛螺旋盖和聚乙烯覆面纸浆衬垫
甘油Sigma AldrichG7757-1L纯度：  ≥ 99.0% 
刻度移液管/移液枪任何公司
加热/搅拌板配备温度探头以实现自动温度控制
盐酸 - 0.1 N任何公司
iTLC 板安捷伦A120B12 iTLC-SA 色谱纸
实验室组织样本任何公司
培养基真空过滤装置任何公司0.22 微米孔径，PES 膜，500 mL 漏斗容量
甲醇任何公司纯度：  ≥ 99.8%，HPLC 级，符合 ACS 规格
非无菌微量离心管 - 1.5 mL任何公司
无菌微量离心管 - 1.5 mL任何公司
微量移液器 - p1000，p200，p20，p10任何公司确保已校准
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15Superfrost Plus 预清洁载玻片
针头 - 18 G无菌的
Parafilm任何公司
PBSSigma AldrichD8537-500ML不含氯化钙和氯化镁的改良型DPBS，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养
PFPFluoroMedAPF-N40HP纯度：  ≥ 99.8%
PFP 系列任何公司直径1/4英寸的塑料软管，截取约50厘米长
PFP 调节因子SwagelokSS-1RF4 和 SS-4HC-1-4
pH计任何公司
pH 标准液 4 和 7任何公司
p1000、p200、p10 移液器吸头——非无菌任何公司
p1000、p200、p10 移液器吸头——无菌任何公司
1 mL 塑料注射器任何公司无菌的
丙二醇BioShopPRO888.500纯度：  ≥ 99.5%
焦磷酸脂质N/A自制
橡胶头镊子任何公司建议使用细尖头与平头/方头边缘的混合工具
剪刀任何公司
氢氧化钠 - 1 N任何公司
氢氧化钠 - 10 N任何公司
荧光分光光度计任何公司可实现410 nm激发和600-850 nm发射
荧光光谱法软件HoribaFluorEssence
光谱仪任何公司
1 mL 注射器任何公司一次性、塑料、无菌
注射器滤器 - 0.2 微米孔径任何公司膜材料：聚醚砜（PES）或其他适用于乙酸铵/乙酸和磷酸盐缓冲液（PBS）的材料
试管 - 10 mL
Triton X-100任何公司
真空干燥器/真空任何公司
VialmixLantheus Medical Imaging515030-0508在方案中称为机械式试管振荡器
称量纸任何公司为避免产品损失，建议将称量纸裁剪为 3x3 cm 的正方形

参考文献

  1. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Mol Imaging Biol. 14 (1), 40-46 (2012).
  2. Kong, W. T., Wang, W. P., Huang, B. J., Ding, H., Mao, F. Value of wash-in and wash-out time in the diagnosis between hepatocellular carcinoma and other hepatic nodules with similar vascular pattern on contrast-enhanced ultrasound. J Gastroenterol Hepatol. 29 (3), 576-580 (2014).
  3. Wilson, S. R., Burns, P. N. Microbubble-enhanced us in body imaging: What role. Radiology. 257 (1), 24-39 (2010).
  4. Hynynen, K., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. Noninvasive mr imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier bbb in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  5. He, W., et al. Enhanced ablation of high intensity focused ultrasound with microbubbles: An experimental study on rabbit hepatic vx2 tumors. Cardiovasc Intervent Radiol. 34 (5), 1050-1057 (2011).
  6. Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in alzheimer's disease using mr-guided focused ultrasound. Nat Commun. 9 (1), 2336(2018).
  7. Burke, C. W., Klibanov, A. L., Sheehan, J. P., Price, R. J. Inhibition of glioma growth by microbubble activation in a subcutaneous model using low duty cycle ultrasound without significant heating. J Neurosurg. 114 (6), 1654-1661 (2011).
  8. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. J Control Release. 243, 172-181 (2016).
  9. Haram, M., Hansen, R., Bouget, D., Myhre, O. F., Davies, C. L., Hofsli, E. Treatment of liver metastases with focused ultrasound and microbubbles in patients with colorectal cancer receiving chemotherapy. Ultrasound Med Biol. 49 (9), 2081-2088 (2023).
  10. Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 9 (1), 321(2019).
  11. Karakatsani, M. E., et al. Focused ultrasound mitigates pathology and improves spatial memory in alzheimer's mice and patients. Theranostics. 13 (12), 4102-4120 (2023).
  12. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the role of lipid transfer in microbubble-mediated drug delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  13. Wang, S., Samiotaki, G., Olumolade, O., Feshitan, J. A., Konofagou, E. E. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  14. Huynh, E., Rajora, M. A., Zheng, G. Multimodal micro, nano, and size conversion ultrasound agents for imaging and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8 (6), 796-813 (2016).
  15. Rajora, M. A., et al. Quantitative pharmacokinetics reveal impact of lipid composition on microbubble and nanoprogeny shell fate. Adv Sci. 11 (4), 2304453(2024).
  16. Leong, K. X., Sharma, D., Czarnota, G. J. Focused ultrasound and ultrasound stimulated microbubbles in radiotherapy enhancement for cancer treatment. Technol Cancer Res Treat. 22, 1-9 (2023).
  17. Li, Y., et al. Ultrasound-triggered release of sinoporphyrin sodium from liposome-microbubble complexes and its enhanced sonodynamic toxicity in breast cancer. Nano Research. 11, 1038-1056 (2017).
  18. Nomikou, N., Fowley, C., Byrne, N. M., Mccaughan, B., Mchale, A. P., Callan, J. F. Microbubble-sonosensitiser conjugates as therapeutics in sonodynamic therapy. Chem Commun. 48 (67), 8332-8334 (2012).
  19. Chakravarty, R., Hong, H., Cai, W. Positron emission tomography image-guided drug delivery: Current status and future perspectives. Mol Pharm. 11 (11), 3777-3797 (2014).
  20. Delalande, A., Leduc, C., Midoux, P., Postema, M., Pichon, C. Efficient gene delivery by sonoporation is associated with microbubble entry into cells and the clathrin-dependent endocytosis pathway. Ultrasound Med Biol. 41 (7), 1913-1926 (2015).
  21. Sheikov, N., Mcdannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound Med Biol. 30 (7), 979-989 (2004).
  22. Conway, G. E., Paranjape, A. N., Chen, X., Villanueva, F. S. Development of an in vitro model to study mechanisms of ultrasound-targeted microbubble cavitation-mediated blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 50 (3), 425-433 (2024).
  23. Hu, S., Zhang, X., Unger, M., Patties, I., Melzer, A., Landgraf, L. Focused ultrasound-induced cavitation sensitizes cancer cells to radiation therapy and hyperthermia. Cells. 9 (12), 2595(2020).
  24. Zhao, C., et al. Synergistically augmenting cancer immunotherapy by physical manipulation of pyroptosis induction. Phenomics. , (2024).
  25. Tachibana, K., Uchida, T., Ogawa, K., Yamashita, N., Tamura, K. Induction of cell-membrane porosity by ultrasound. Lancet. 353 (9162), 1409(1999).
  26. Arif, W. M., et al. Focused ultrasound for opening blood-brain barrier and drug delivery monitored with positron emission tomography. J Control Release. 324, 303-316 (2020).
  27. Da Ros, V., et al. PVA-microbubbles as a radioembolization platform: Formulation and the in vitro proof of concept. Pharmaceutics. 15 (1), 217(2023).
  28. Tartis, M. S., et al. Dynamic micropet imaging of ultrasound contrast agents and lipid delivery. J Control Release. 131 (3), 160-166 (2008).
  29. Willmann, J. K., et al. Targeted microbubbles for imaging tumor angiogenesis: Assessment of whole-body biodistribution with dynamic micro-pet in mice. Radiology. 249 (1), 212-219 (2008).
  30. Ingram, N., et al. Ultrasound-triggered therapeutic microbubbles enhance the efficacy of cytotoxic drugs by increasing circulation and tumor drug accumulation and limiting bioavailability and toxicity in normal tissues. Theranostics. 10 (24), 10973-10992 (2020).
  31. Hernández-Gil, J., et al. Development of 68ga-labelled ultrasound microbubbles for whole-body pet imaging. Chem Sci. 10 (215), 5603-5615 (2019).
  32. Warram, J. M., et al. Biodistribution of p-selectin targeted microbubbles. J Drug Target. 22 (5), 387-394 (2014).
  33. Liu, T. W., Macdonald, T. D., Shi, J., Wilson, B. C., Zheng, G. Intrinsically copper-64-labeled organic nanoparticles as radiotracers. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (52), 13128-13131 (2012).
  34. Rajora, M. A., et al. Tailored theranostic apolipoprotein e3 porphyrin-lipid nanoparticles target glioblastoma. Chem Sci. 8 (8), 5371-5384 (2017).
  35. Yoo, K., Dhaliwal, A., Chen, J., Sheeran, P. S., Zheng, G. Synthesis and characterization of multi-modal phase-change porphyrin droplets. J Vis Exp. 176, e62665(2021).
  36. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  37. Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjug Chem. 25 (4), 796-801 (2014).
  38. Mcmahon, D., Hynynen, K. Acute inflammatory response following increased blood-brain barrier permeability induced by focused ultrasound is dependent on microbubble dose. Theranostics. 7 (16), 3989-4000 (2017).
  39. Bismuth, M., Katz, S., Rosenblatt, H., Twito, M., Aronovich, R., Ilovitsh, T. Acoustically detonated microbubbles coupled with low frequency insonation: Multiparameter evaluation of low energy mechanical ablation. Bioconjug Chem. 33 (6), 1069-1079 (2022).
  40. Kutscher, H. L., et al. Threshold size for optimal passive pulmonary targeting and retention of rigid microparticles in rats. J Control Release. 143 (1), 31-37 (2010).
  41. You, Y., et al. Porphyrin-grafted lipid microbubbles for the enhanced efficacy of photodynamic therapy in prostate cancer through ultrasound-controlled in situ accumulation. Theranostics. 8 (6), 1665-1677 (2018).
  42. Chen, X., Qin, B., Whitehurst, D., Helfield, B., Lavery, L., Villanueva, F. S. Sonodynamic therapy using protoporphyrin ix encapsulated microbubbles inhibits tumor growth. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. , Washington, DC. 1-4 (2017).
  43. Cheng, M. H. Y., et al. Targeted theranostic 111in/lu-nanotexaphyrin for spect imaging and photodynamic therapy. Mol Pharm. 19 (6), 1803-1813 (2022).
  44. Cheng, M. H. Y., Cevallos, A., Rajora, M. A., Zheng, G. Fast, facile, base-free microwave-assisted metallation of bacteriochlorophylls and corresponding high yield synthesis of tookad. J Porphyrins Phthalocyanines. 25 (07n08), 703-713 (2021).
  45. Macdonald, T. D., Liu, T. W., Zheng, G. An MRI-sensitive, non-photobleachable porphysome photothermal agent. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (27), 6956-6959 (2014).
  46. Shao, S., et al. Functionalization of cobalt porphyrin-phospholipid bilayers with his-tagged ligands and antigens. Nat Chem. 7 (5), 438-446 (2015).
  47. Teh, J. H., et al. A kit-based aluminium-[(18)f]fluoride approach to radiolabelled microbubbles. Chem Commun (Camb). 57 (88), 11677-11680 (2021).
  48. Rajora, M. A. Supramolecular Structure-Enabled Delivery of Porphyrin to Glioblastomas Beyond the Blood-Brain Barrier [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2024).
  49. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  50. Dhaliwal, A. Utilizing Porphyrin to Improve Ultrasound-Activated Supramolecular Agent Design for Solid Tumor Delivery [Doctor of Philosophy thesis]. , University of Toronto. (2023).
  51. Kilroy, J. P., Klibanov, A. L., Wamhoff, B. R., Bowles, D. K., Hossack, J. A. Localized in vivo model drug delivery with intravascular ultrasound and microbubbles. Ultrasound Med Biol. 40 (10), 2458-2467 (2014).
  52. Dhaliwal, A., et al. Deep learning for automatic organ and tumor segmentation in nanomedicine pharmacokinetics. Theranostics. 14 (3), 973-987 (2024).
  53. Shakya, G., Cattaneo, M., Guerriero, G., Prasanna, A., Fiorini, S., Supponen, O. Ultrasound-responsive microbubbles and nanodroplets: A pathway to targeted drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 206, 115178(2024).
  54. Honari, A., Merillat, D. A., Bellary, A., Ghaderi, M., Sirsi, S. R. Improving release of liposome-encapsulated drugs with focused ultrasound and vaporizable droplet-liposome nanoclusters. Pharmaceutics. 13 (5), 609(2021).
  55. Barmin, R. A., et al. Polymeric materials for ultrasound imaging and therapy. Chem Sci. 14 (43), 11941-11954 (2023).
  56. Chen, Y., Liang, Y., Jiang, P., Li, F., Yu, B., Yan, F. Lipid/PLGA hybrid microbubbles as a versatile platform for noninvasive image-guided targeted drug delivery. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (45), 41842-41852 (2019).
  57. Barmin, R. A., et al. Engineering the acoustic response and drug loading capacity of pbca-based polymeric microbubbles with surfactants. Mol Pharm. 19 (9), 3256-3266 (2022).
  58. Barrefelt, A. A., et al. Multimodality imaging using SPECT/CT and MRI and ligand functionalized 99mTc-labeled magnetic microbubbles. EJNMMI Res. 3 (1), 12(2013).
  59. Song, R., Hu, D., Chung, H. Y., Sheng, Z., Yao, S. Lipid-polymer bilaminar oxygen nanobubbles for enhanced photodynamic therapy of cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (43), 36805-36813 (2018).
  60. Böhmer, M. R., Chlon, C. H. T., Raju, B. I., Chin, C. T., Shevchenko, T., Klibanov, A. L. Focused ultrasound and microbubbles for enhanced extravasation. J Control Release. 148 (1), 18-24 (2010).
  61. Zhang, S., et al. Compare ultrasound-mediated heating and cavitation between flowing polymer- and lipid-shelled microbubbles during focused ultrasound exposures. J Acoust Soc Am. 131 (6), 4845-4855 (2012).
  62. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  63. Krasnovskaya, O. O., et al. Recent advances in (64)cu/(67)cu-based radiopharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (11), 9154(2023).
  64. Navarro-Becerra, J. A., Borden, M. A. Targeted microbubbles for drug, gene, and cell delivery in therapy and immunotherapy. Pharmaceutics. 15 (6), 1625(2023).
  65. Fan, C. -H., et al. Antiangiogenic-targeting drug-loaded microbubbles combined with focused ultrasound for glioma treatment. Biomaterials. 34 (8), 2142-2155 (2013).
  66. Luo, T., et al. Ultrasound-mediated destruction of oxygen and paclitaxel loaded dual-targeting microbubbles for intraperitoneal treatment of ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 391, 1-11 (2017).
  67. Fix, S. M., et al. Oxygen microbubbles improve radiotherapy tumor control in a rat fibrosarcoma model - a preliminary study. PLoS One. 13 (4), e0195667(2018).
  68. Eisenbrey, J. R., et al. Sensitization of hypoxic tumors to radiation therapy using ultrasound-sensitive oxygen microbubbles. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (1), 88-96 (2018).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

微泡制备微泡标记荧光微泡放射性微泡聚焦超声放射性核素螯合多模态成像脂质微泡γ计数器离心过滤
制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。