方法文章

使用荧光和放射性示踪剂制造和标记微气泡

DOI：

10.3791/67431

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  , 
1Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Medicine, University of Toronto, 4Department of Medical Biophysics, University of Toronto

本文内容

摘要

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该协议概述了脂质微泡的制造和兼容的一锅微泡放射性标记方法，该方法具有免纯化 >95% 的标记效率，可保留微泡物理化学特性。该方法对不同的脂质微泡配方有效，并且可以定制以产生放射性和/或荧光微泡。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微泡是脂质外壳、充满气体的颗粒，已经从血管超声造影剂演变为革命性的癌症治疗平台。当与治疗性聚焦超声 （FUS） 结合使用时，它们可以安全、局部地克服生理障碍（例如血脑屏障），将药物输送到其他无法接近的癌症（例如胶质母细胞瘤和胰腺癌），并治疗神经退行性疾病。微泡 FUS 的治疗库正在朝着新的方向发展，包括协同联合放疗、多模态成像以及从微泡壳进行一体化药物加载和递送。

用放射性示踪剂标记微气泡是建立这些扩展的治疗诊断能力的关键。然而，现有的微气泡放射性标记策略依赖于已知会扰乱微气泡物理化学性质的纯化方法，使用短寿命放射性同位素，并且并不总是产生稳定的螯合物。总的来说，这导致微泡放射成像的准确性和肿瘤放射性同位素递送的效率变得模糊。

该协议描述了一种新的一锅法、免纯化的微气泡标记方法，该方法在实现 >95% 放射性同位素螯合效率的同时保留了微气泡的物理化学性质。它用途广泛，可成功应用于具有不同酰基脂质链长度、电荷和螯合剂/探针（卟啉、DTPA、DiI）组成的定制和商业微泡配方。它可以在研磨的微气泡制造过程中自适应地应用于预制的微气泡配方，具有荧光和多模态荧光/放射性特性的模块化可定制性。因此，这种灵活的方法可以生产定制的、可追溯的（放射性、荧光或放射性/荧光活性）多模态微泡，这些微泡可用于推进机制、成像和治疗性微泡-FUS 应用。

引言

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微泡是微米级的超分子治疗诊断剂，其气芯由蛋白质、聚合物或在大多数情况下由脂质壳稳定（图 1A）。当注射到血液中时，微气泡在其气芯溶解之前，会在几分钟之内保持可被超声波检测到的气/液界面 1,2。因此，微泡的首次临床用途是作为实时超声成像造影剂3。治疗性聚焦超声 （FUS） 的发明扩展了微泡临床用途。当受到低频 FUS 刺激时，微泡振荡并产生有针对性的、可调的机械力，范围从瞬时血管通透到局灶性组织消融 4,5。因此，在过去的 20 年里，微泡-FUS 已被探索用于血脑屏障 （BBB） 开放、肿瘤（例如胰腺癌、脑癌和肝转移性癌症）药物和成像探针递送、神经退行性疾病治疗和癌症消融 6,7,8,9,10,11。

微气泡的治疗诊断学武器库继续朝着新的和令人兴奋的方向发展。传统的微泡 FUS 递送应用依赖于治疗或成像货物与商业微泡的共同给药。通过了解微泡壳/生物相互作用，探索定制的非商业微泡配方，以及生成将货物直接加载到微泡壳上的一体化治疗诊断微泡，增强微泡-FUS 递送能力的兴趣日益浓厚 12,13,14。事实上，大约 40% 的脂质微泡药物递送研究使用这种加载壳的微泡15。除了成像和药物递送之外，微泡-FUS 还显示出增强癌症放疗16 的前景，并通过声动力学疗法激活其他良性贝壳负载药物的抗肿瘤作用17,18。

通过使用放射性示踪剂标记微泡壳，可以在战略上推进微泡癌应用中的这些传统和扩展方向。在多合一载货微气泡领域，这种放射性标记 1） 有助于对这些负载的微泡壳的靶上和靶外生物分布进行金标准定量评估，2） 得出药代动力学结构-活性关系，为微泡组合物的最佳选择提供信息，以最大限度地提高靶点递送，以及 3） 指导战略性和适当的图像引导应用和治疗计划（例如，组织靶标的类型， 剂量测定、减轻脱靶安全问题的药物选择、与传统联合治疗范式相比的实用性）多合一载货系统15,19。在临床前阶段，对微泡壳命运的这种理解也可以阐明更广泛的微泡-FUS 作用机制。例如，脂质从微泡壳转移到靶细胞已被证明会影响启用 FUS 的超声12,20。因此，了解和优化这种转移可以为涉及超声的临床前和临床微泡 FUS 疗法（体外转染、药物递送、肿瘤消融、放射增敏和声动力学疗法）提供信息20,21,22,23,24,25).双超声和放射成像设施还将从单一药物而不是传统的双药设计中实现 FUS 血管开放和治疗监测（例如，BBB 开放动力学）26。同样，脂质微泡放射性标记可以作为微泡-FUS + 放射性药物共同递送平台的一体化单药微泡-FUS/放射治疗替代方案27。

微气泡的脆弱性是这种标记的一个不小的挑战。所有现有的放射性标记策略都受到已知会干扰微泡稳定性和大小的纯化方法的限制，而有些策略还具有无效和不稳定的放射性标记 28,29,30,31,32。纯化要求也会导致方案更长。结合使用短寿命放射性同位素（例如，18F t1/2 1.8 h，28,29 99mTc t1/2 6 h，3268Ga t1/2 1 h31），这造成了与放射性同位素衰变相关的效率低下，并限制了放射成像和治疗计划的时间框架。总的来说，这些限制有可能获得缩短且不具代表性的放射成像、不准确的药代动力学数据和低效的肿瘤放射性同位素递送。  

在本报告中，通过利用卟啉强大而稳定的金属螯合能力，克服了这些限制。卟啉是有机的杂环大分子，具有高度共轭的平面环和可以容纳多种金属的中央配位点。这包括寿命较长的放射性同位素，如铜-64 （t1/2 12.7 h）、一种具有正电子发射断层扫描 （PET） 的放射性药物，以及 γ计数可行性33。当与脂质骨架偶联时，卟啉可以很容易地掺入超分子结构中，随后用铜 64 标记，具有速度、高螯合效率和血清稳定性，同时保持母体未标记颗粒的性质33,34。此外，卟啉具有荧光活性，在纳米和微粒中具有模块化自淬灭作用，在颗粒破碎时恢复;PET 和 γ 计数的补充读数，有助于进行体壳和微观壳命运分析（图 1A）15。

通过使用卟啉脂质作为螯合剂，这些特性被用来生成一种新的一锅法、免纯化的微气泡放射性标记方法（图 1B、C），该方法克服了与现有微气泡放射性标记方法相关的限制。该方案实现了 >95% 的铜-64 螯合效率，不需要标记后纯化，并保留了微泡的物理化学特性。在脂质微泡活化之前，它可以很容易地集成到脂质微泡的“磨碎”制造中（图 1B）。它用途广泛，可成功应用于具有不同酰基脂质链长度（C16 至 C22）、电荷（中性和阴离子）和卟啉脂质组成（1 mol%、10 mol%、30 mol%）的定制和商业微泡配方，产生具有放射性和荧光活性的微泡。它的适应性也可以延伸到卟啉之外。一锅法方案可以修改为使用替代的市售螯合剂（例如，五乙酸二乙烯三胺 （DTPA） - 脂质）和荧光团（例如，DiI）。它还可以通过“加标”方法进行改性，以标记预制的微气泡配方。因此，该方法能够生产定制的、可追溯的（放射性、荧光或双重放射性/荧光活性）微泡，可用于推进机械、成像和治疗性微泡-FUS 应用。下面的协议概述了脂质微泡的制造、一锅法放射性标记协议的应用、必要的放射性标记和物理化学性质表征以及可能的修改。

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图 1：微泡制造和放射性标记方案。 （A） 卟啉脂质，以焦啉-a-脂质的形式，在该方案中用作多模式螯合剂。作为与铜 64 （i） 螯合的单体，它具有 PET 和成像功能。其荧光以颗粒形式（微泡 （ii） 及其溶解后纳米后代 （iii））淬灭，并通过颗粒破碎 （iv） 未淬灭。（B） 本报告中描述的脂质膜水合/激活方案，用于从头开始生成脂质微气泡，以及 （C） 脂质悬浮液形成和微气泡激活之间的一锅法放射性标记整合。此图经 Rajora 等人 15 许可改编。 请单击此处查看此图的较大版本。

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方案

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1. 试剂的制备

  1. 制备乙酸铵缓冲液（0.1 M，pH 5.5）
    1. 使用分析天平，称取 770.8 mg 乙酸铵到称量纸上。将称取的量转移到干净的 250 mL 玻璃烧杯中。
    2. 将 90 mL 双蒸水 （ddH2O） 加入烧杯中，通过刻度移液管测量。加入搅拌棒，将烧杯放在磁力搅拌板上，使乙酸铵溶解。以产生轻微涡旋的速度搅拌，但不会产生溶液飞溅。
    3. 根据仪器说明，使用 pH 4 和 7 的标准液校准 pH 计。校准后，将 pH 探头插入乙酸铵缓冲液中。
    4. 向溶液中加入 104 μL 乙酸，搅拌溶解，并测量 pH 值。
      注意：此时 pH 值应接近 5.5。
    5. 使用微量移液管以 5-10 μL 的增量添加 10 N 氢氧化钠（如果缓冲液变得太碱性，则加入盐酸），以调节缓冲液的 pH 值。搅拌，测量 pH 值，并根据需要重复。记下添加的碱/酸的体积。
    6. 加入足够体积的 ddH2O 以制备总共 100 mL 的缓冲液。
      注：例如，如果在 pH 值调节过程中使用 45 μL 10 N 氢氧化钠，则向烧杯中加入 9.851 mL ddH2O（100 mL [目标体积] - 90 mL [步骤 1.1.2] - 0.104 mL [步骤 1.1.4] - 0.045 mL [步骤 1.1.5] = 9.851 mL）。
    7. 在将缓冲液转移到带盖的储存容器之前，将其彻底搅拌最后一次。
    8. 按照仪器说明清洁 pH 计。
      注意：浓氢氧化钠和盐酸水溶液会引起皮肤反应，应戴手套处理。
  2. 准备水合缓冲液 （PGG）
    1. 将磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 吸入注射器中，并在末端配备聚醚砜 0.2 μm 孔径注射器过滤器。将 PBS 过滤到干净的塑料带盖离心管中。
      注：只要膜与 PBS 和乙酸铵兼容，就可以使用替代膜材料（例如聚偏二氟乙烯）的 0.2 μm 孔径针式过滤器。
    2. 通过微量移液管将过滤后的 PBS、丙二醇和甘油以 8：1：1 的体积比例混合，制成水合缓冲液（也称为 PGG）。添加丙二醇和甘油时，吸出并擦去移液器吸头表面残留的丙二醇或甘油液滴，然后将试剂缓慢移液到 PBS 中。在 PBS 中可以看到清晰的细绳状粘稠浊度。
      注：建议使用 p1000 微量移液器先将 PBS 加入离心管中，然后加入丙二醇和甘油，因为后两种试剂是粘性的。因此，应通过微量移液器缓慢吸出它们，直到移液器吸头中不再看到液体运动，并且当移液器吸头从试剂中取出时不会吸入空气。理想情况下，应使用带有容量标记的微量移液器吸头来选择与此类标记一致的试剂体积（例如，制备 1 mL 或 5 mL PGG，并分别使用微量移液器吸头上的 0.1 mL 或 0.5 mL 标记来观察丙二醇和甘油的完全吸液）。擦拭微量移液器吸头表面时，请勿擦拭吸头开口处，只能擦拭侧面。
    3. 使用移液器吸头在溶液中上下移液，直到试剂均匀溶解。小心不要将任何气泡引入溶液中。
    4. 为了进一步确保水合缓冲液的完全混合，请盖上离心管并缓慢上下旋转。不要涡旋。
    5. 以低于 1000 x g 的速度旋转试管 20-30 秒（最低温度 4 °C，最大 RT）以去除无法观察到的气泡。
  3. 准备水合/放射性标记缓冲液 （AA-PGG）
    1. 按照步骤 1.2.1 将针式过滤器 0.1 M、pH 5.5 乙酸铵缓冲液（来自步骤 1.1）和 PBS 放入单独的试管中。
    2. 通过 p1000 微量移液器将过滤后的乙酸铵缓冲液、过滤的 PBS、丙二醇和甘油混合到 5：3：1：1 乙酸铵缓冲液中的离心管中：PBS：丙二醇：甘油体积比按所列顺序排列。按照步骤 1.2.2-1.2.5 的吸液、混合和离心说明制备 AA-PGG。
  4. 瞬效薄层色谱 （iTLC） 淋洗液
    1. 称取至 0.1 g 乙二胺四乙酸 （EDTA） 并转移至加盖样品瓶中。溶解在 ddH2O 中，以制备 2% w/v 的 EDTA 溶液（例如，对于 50 mg EDTA，添加 2.5 mL ddH2O）。
    2. 将 2% w/v EDTA 溶液与步骤 1.1 中的乙酸铵缓冲液以 9：1 v/v 的比例（90% EDTA 溶液、10% 乙酸铵缓冲液）混合。盖上并储存所得的 iTLC 淋洗液。

2. 脂质膜的形成

注：该程序概述了脂质膜的形成，其成分模拟商业微泡 Definity®，其中卟啉脂质取代宿主脂质并构成总脂质的 30 mol%。然而，放射性标记方案可应用于不同的脂质制剂（C16、C18、C22 链长、中性或阴离子电荷、不同的卟啉脂质摩尔组成）。附上补充电子表格（补充文件 1），其中提供了所述配方和其他配方的计算、成分、质量和库存量。除卟啉脂质、焦啉脂质 （pyropheophorbide-a-lipid） 外，所有脂质均可在市场上买到，其合成已在前面详细描述过 35,36。

  1. 使用 补充文件 1，根据所需的薄膜数量确定每种脂质所需的总质量数。
  2. 在分析天平上称量一个空的 0.5 dram 玻璃样品瓶。
    注意：灰尘会干扰微气泡的成功形成。因此，将加压空气吹入样品瓶中，以去除未加盖储存的任何灰尘/颗粒。
  3. 称取 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DPPC） 到称重纸上。
    注：称量的质量应从步骤 2.1 中获取，外加 0.5-1 mg，以考虑后续步骤中样品处理过程中的任何损失。
  4. 将 DPPC 转移到称重的玻璃样品瓶中，然后重新称重以确定样品瓶中的脂质质量。该工艺可以更轻松地将脂质转移到玻璃瓶中，减少脂质粉末损失/溢出，并更准确地测量脂质质量。
  5. 对其他脂质重复步骤 2.2 至 2.4：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000] （DPPE-mPEG）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸 （DPPA） 和 C16 焦磷酸脂质。
    注：如果焦释脂质不是可称量的粉末形式，而是未知数量的薄膜或等分试样，则可以将其溶解在氯仿中以形成储备液，其浓度可以通过使用比尔-朗伯定律在甲醇中的紫外-可见光吸光度测量来计算，如前所述35。
  6. 使用微量移液器或玻璃注射器在玻璃试管中制备以下有机溶剂和溶液：1） 氯仿，2） 9：1 v/v 氯仿：甲醇，以及 3） 65：35：8 氯仿：甲醇：ddH2O。最后，移液管组分并按以下顺序混合：ddH2O、甲醇，然后是氯仿。
    注意：甲醇和氯仿对健康有害，易燃且易挥发。佩戴护目镜、手套和实验服，并使用通风橱。
  7. 使用 补充文件 1 计算制备脂质储备液所需的有机溶剂/溶液的体积，并选择适当体积的玻璃注射器。
    注：该体积产生的储备液浓度应与每层薄膜 15-100 μL 储备液等分试样体积相对应，可以使用 25-100 μL 玻璃微升注射器轻松测量。
  8. 用氯仿冲洗玻璃注射器三次。来回泵送柱塞以干燥注射器。
  9. 根据步骤 2.7 中的电子表格计算，通过清洁的玻璃注射器测量有机溶剂/溶液并将其添加到各个脂质瓶中，以形成脂质储备。将焦糖脂溶于氯仿中（除非已经按照步骤 2.5 注释溶解），DPPC 和 DPPE-mPEG 溶于 9：1 v/v 氯仿中：甲醇和 DPPA 溶于 65：35：8 氯仿：甲醇：ddH2O。如果使用相同的玻璃注射器进行所有添加，请在每种脂质之间冲洗并干燥。
    注：如果所选配方不含 DPPA 或其 C18 链长变体，则焦磷酸脂质、宿主 PC 脂质和 PEG 脂质都可以溶解在氯仿中。
  10. 盖上样品瓶并涡旋。
  11. 通过玻璃微升注射器将计算体积的脂质溶液储备液添加到新的 0.5 dram 玻璃样品瓶（薄膜样品瓶）中。对于第一种脂质储备液，将针尖插入样品瓶的底部中心并缓慢插入，以避免溅到样品瓶壁上。对于后续添加，将针尖直接放在液位上方并触摸样品瓶的侧面，以去除任何最后一滴，以免针头暴露在下面的液体中。
    注：发生污染时，在脂质添加之间冲洗并擦干玻璃注射器。如果制备多个薄膜，请在两次添加之间盖上薄膜和储备样品瓶，以尽量减少溶剂蒸发。
  12. 在直立位置手动轻轻旋转样品瓶以混合内容物。避免将任何溶液溅到样品瓶壁上。
  13. 打开盖子（存放盖子）并将氮气管插入样品瓶的顶部空间。调整氮气流量，在液体表面造成轻微的可见干扰，但没有任何漏斗或飞溅。
  14. 插入氮气管后立即涡旋样品瓶。以足以形成漏斗的低速开始，溶剂从样品瓶底部上升不超过 1 cm。避免溶剂飞溅。当溶剂蒸发时，缓慢且不停顿地增加涡旋速度，保持溶剂高度，直到所有液体蒸发。结果将是一层薄膜涂布在样品瓶的下三分之一处。
  15. 将小瓶放入配备真空的干燥器中，继续在真空下干燥薄膜 8-72 小时。用铝箔盖住样品瓶（开口除外）或干燥器。
    注意：协议可以在此处暂停。下一步可以在薄膜干燥后进行，或者可以将薄膜在氩气下储存，用封口膜密封，在 -20 °C 冰箱中保存长达 1 个月，如果保持干燥，则保存时间更长。

3. 脂膜水合

注：如果微泡 在体外 或 体内使用，除非另有说明，否则在步骤 3.3 至 5.4 中使用无菌微量移液器吸头、试管、注射器和针头。

  1. 从真空中取出薄膜，或者如果冷冻储存，请让它加热至 RT。
  2. 在 250 mL 烧杯中装满水，并将水加热至 70-80 °C。
  3. 将水浴超声仪加热至 69 °C。
  4. 沿脂质膜小瓶的边缘微量吸取 1 mL 的 AA-PGG（步骤 1.3），以避免产生气泡。
    注：当制造未螯合的对照或仅荧光的微泡时，使用 PGG（步骤 1.2）而不是 AA-PGG。
  5. 用盖子部分盖住样品瓶开口，留出足够的空间来插入全氟丙烷 （PFP） 管路。将 PFP 流入样品瓶顶部空间，在液体上方 20 秒，使液体受到明显干扰，但不会飞溅。不要将 PFP 直接流入悬浮液中。盖上样品瓶的盖子。
    注意：如果流量的强度和时间足够，样品瓶将开始冷却。
  6. 将样品瓶的下半部分浸入 70-80 °C 水浴中 1 分钟。然后，在 69 °C 浴超声仪中超声处理至少 30 秒，或直到脂质膜均匀分散到 AA-PGG 中。避免产生气泡或过早激活微泡形成（过早激活会在脂质悬浮液中表现为乳白色/混浊区域）。需要时擦拭样品瓶表面，以更好地辨别是否残留任何未悬浮的脂质。
    注：如果脂质膜在超声处理后 1 分钟内未水合，请在 70-80 °C 浴中重新加热，然后重新超声处理。
  7. 一旦脂质膜均匀悬浮，最后一次加热 1 分钟，然后再超声处理 30 秒。
  8. 擦拭小瓶并使其被动冷却至 RT（~5-10 分钟）。
  9. 按照步骤 3.5 用 PFP 重新填充小瓶顶部空间，加盖，并用 Parafilm 密封瓶盖边缘。
    注意：该协议可以在此处暂停，并在不迟于 8 小时后恢复。

4. 放射性标记

注：对于未螯合的对照或仅荧光的微泡，请跳至方案第 5 节。

注意：除非另有说明，否则在放射性实验室中执行本方案的步骤 4.4-4.6。 64CuCl2 是一种放射性危害，通过皮肤暴露、吸入或摄入存在多系统毒性风险。尽可能使用橡胶镊子在通风橱中间接处理它。处理时，请穿戴防护实验服、个人戒指和徽章剂量计，并戴双层手套。确保在 64英寸铅屏蔽层上处理 2 CuCl2 。必要时，将其放在铅护套容器中运输。屏蔽废物容器，并在使用后进行污染作调查。

  1. 在玻璃烧杯或装有磁力搅拌棒的大结晶皿中制备 60 °C 的水浴。使用配备热探针的温控热/搅拌板，将热探针插入水中，设置为以产生微弱但可见的漏斗的速度搅拌。
  2. 通过橡胶镊子将含有 64CuCl2 的 0.1 N HCl 溶液的密封小瓶转移到剂量校准器中。
    注：订购 64CuCl2 时，要求将其溶解在 5-20 μL 的 0.1 N HCl 中。较低的体积对于保持微泡产量至关重要。
  3. 注意在剂量校准器上测得的铜 64 活性和时间。用镊子取出小瓶并将其放入含铅容器中。
  4. 将记录的活性除以 64CuCl2 报告的体积，得到 MBq·mL-1 值。
  5. 打开步骤 3.9 中的脂质悬浮液并将其固定在小瓶支架中。
  6. 打开 64CuCl2 小瓶的盖子并用镊子固定。
  7. 微量移液管 64CuCl2 溶液，对应于 40-250 MBq 的活性，并转移到脂质悬浮液中。确保移液器吸头浸入悬浮液中。插入然后上下移液以完全转移 64CuCl2。
    注：添加的 64CuCl2 的量将取决于放射性标记微泡的预期应用和剂量校准剂的灵敏度。对于小鼠体内的纵向（注射后长达 48 小时）PET 和 血液 采样，建议分别至少 220 MBq 和 50 MBq。
  8. 盖上脂质悬浮液和 64个 CuCl2 小瓶。
  9. 使用扁平橡胶镊子，手动上下旋转放射性脂质悬浮液至少 5 次，以通过悬浮液轻轻混合 64CuCl2 。避免摇晃或掉落样品瓶，并避免形成气泡。
  10. 当右侧朝上时，轻轻弹动样品瓶的盖子，同时保持悬浮液稳定。这将有助于捕获在瓶盖中的任何液体被吸引到样品瓶底部。小心地部分打开样品瓶盖，并插入配备 18 G 针头的 PFP 管路。按照步骤 3.5 用 PFP 填充小瓶顶部空间 20 秒。盖上样品瓶并用 Parafilm 密封。
  11. 在剂量校准品上测量样品瓶活性并记下时间。
    注：如果样品瓶中未转移足够的活性，请重复步骤 4.5-4.11，添加适当额外体积的 64CuCl2。
  12. 将样品瓶放入泡沫样品瓶支架中并推入，使样品瓶的下半部分受热。将支架置于搅拌的 60 °C 水浴中并加热 1 小时。
  13. 在螯合反应进行的同时，准备 iTLC 板。戴上新手套，将玻璃超细纤维色谱纸切成 1 cm x 8 cm 的条状。在 80 °C 玻璃干燥箱中加热条带。
    注：此步骤可在非放射性实验室中进行。
  14. 1 小时后，将步骤 4.12 中的小瓶从火上移开，并用纸巾擦拭边缘。
  15. 用橡胶镊子手动上下旋转样品瓶，以将样品瓶壁上的任何冷凝水重新冷凝到脂质悬浮液中。
  16. 将样品瓶置于直立位置，在稳定试管的同时轻弹瓶盖。取下 Parafilm 并擦拭盖子以去除任何滞留的沐浴水。
  17. 小心地打开样品瓶盖并吸出 1-2 μL 脂质悬浮液。在距离 iTLC 条带底部中心 1 cm 处找到悬浮液，然后重新盖上小瓶盖。让斑点干燥。
    注：理想情况下，每个反应混合物至少应点样 2 个 iTLC，并为每个放射性标记的脂质悬浮液显影以确保确定性。
  18. 将 200 μL iTLC 洗脱液（在步骤 1.4 中制备）微量移液到 10 mL 试管的底部。将试管装在铅容器中。将斑点 iTLC 添加到试管中，让条带显影，直到洗脱液距离条带顶部边缘约 1 cm。
  19. 使用镊子去除显影的 iTLC 条带。垂直握住试纸条，并在兼容γ计数器和推盖的圆形 5 mL 塑料管上切成三分之二，使每个试纸三分之一直接落入单独的三分之一。将推盖插入三个试管中。
  20. 在γ计数器上测量含试纸条的试管和空/加盖的对照管的铜 64 活性，并记录相关的每分钟计数 （cpm）。从其他读数中减去对照管活性以校正后台活性。
    注：条带底部三分之一（第 1 部分）的校正读数与螯合到脂质悬浮液颗粒的铜 64 相关。中间部分（第 2 部分）包含一条非超分子形式的游离铜 64 和 64铜-焦磷酸脂质螯合物。顶部（第 3 部分）主要含有游离铜 64。
  21. 通过公式 1 计算放射化学纯度。
    figure-protocol-1（公式 1）
    注意：如果第 1 部分的 cpm 似乎过低（例如，低于或相当于第 2 部分或第 3 部分），或者如果任何读数高于 γ 计数器非线性/饱和阈值，请点出较低体积或稀释的等分试样 （1-2 μL） 用于 iTLC 的放射性标记悬浮液。
  22. 确保从每个脂质悬浮液的两个 iTLC 试纸条中获得的放射化学纯度为 ≥ 94% 才能继续。如果没有，请继续在 60 °C 下加热脂质悬浮液，并通过 iTLC 每隔 30 分钟监测螯合物。
  23. 打开放射性标记的脂质悬浮液瓶的盖子，将 8.89 μL 1 N NaOH 微量移液到悬浮液中，上下移液以完全转移碱基并中和悬浮液。盖上样品瓶盖，用镊子手动旋转以反转/反转，然后轻轻敲击样品瓶盖。
  24. 按照步骤 4.10 用 PFP 填充顶部空间，用 Parafilm 盖上盖子并密封。

5. 微气泡活化和隔离

  1. 通过机械小瓶振荡器以 4530 rpm 激活脂质悬浮液 45 秒，以产生乳白色微气泡悬浮液。让小瓶被动冷却至 RT 约 10 分钟。随着时间的推移，所得的乳白色悬浮液将分离成两层。
    注：活化后，样品瓶内容物应呈乳白色。激活后更清晰的暂停表示激活不成功，其原因将在后面的部分中讨论。
  2. 进入 RT 后，轻轻倒置/反转小瓶以重悬微泡悬浮液。将样品瓶放在平坦的表面上，并在倾析前等待 2 分钟，以获得所需的微泡群，如下所示：
    1. 为 1 mL 塑料注射器配备 18 G 针头，并通过吸入/抽出空气来放空注射器/针头。在 2 分钟标记处，快速打开样品瓶盖，一次性打破封口膜密封。
    2. 从样品瓶底部抽取 400-550 μL（针对微泡群），避免吸取较大不需要的微泡群的顶部泡沫层。
      注：如果需要，将样品瓶向一侧倾斜，以将末端体积收集到注射器中，以避免吸出泡沫/较轻层。
  3. 仔细擦拭针头的边缘以去除任何泡沫污染物，并将分离的微气泡悬浮液转移到微量离心管中。轻轻盖上盖子（不要突然打开或关闭盖子）。这是放射性标记微泡的最终工作悬浮液。
  4. 在剂量校准器上测量最终微泡产物的活性并记下时间。将该值除以步骤 5.2 中倾析的悬浮液体积，得到 MBq·mL-1 值，从而根据感兴趣的应用计算进样体积。
    注意：放射性标记的微气泡现在可以使用了。第 6 部分可以在最晚 24 小时后执行。有关如何通过多模式（超声、PET、荧光）成像在 体内 注射和跟踪这些放射性标记的微气泡的信息，请参阅 Rajora 等人15。

6. 验证放射性标记效率

  1. 通过轻柔的移液或样品瓶倒置重悬微泡悬浮液。
    注意： 切勿涡旋微气泡工作产品。涡旋会破坏微泡悬浮液的稳定性。
  2. 将 10-200 μL 放射性标记的悬浮液添加到 0.5 mL 30,000 截留分子量 （MWCO） 离心过滤器装置中。如果使用的体积为 <200 μL，则向过滤器单元中加入 ddH2O，以形成 200 μL 的总体积。将过滤器单元装在兼容的微量离心管和盖子中。
    注意：建议在体外或体内使用放射性标记微泡之前进行放射性标记测试，以确保成功完成方案。在这种情况下，此步骤可以使用更大的体积（例如 200 μL）。当该方案随后用于治疗时，首先准备治疗量/注射，然后尽早使用剩余的放射性标记微泡悬浮液进行第 6 部分。
  3. 在 RT 下以 12,000 x g 离心 10 分钟。
    注意：微量离心机应被铅屏蔽包围。
  4. 用剪刀剪断微量离心管与其盖子之间的连接。
    1. 将瓶盖放入标有“caps”的 20 mL 闪烁瓶中。将过滤器单元转移到新的微量离心管（管 2）中。
    2. 将第一个含有常开液的微量离心管放入标有“管 1”的 20 mL 闪烁瓶中。将 200 μL ddH2O 添加到管 2 中的过滤器单元中。
  5. 在 RT 下以 12,000 x g 离心管 2 中的过滤器单元。
  6. 重复步骤 6.4 和 6.5。将 2 管盖添加到装有 1 管盖的“瓶盖”闪烁瓶中。将试管 2 放入新的 20 mL 闪烁瓶中。
  7. 按照步骤 6.4 切开第三个微量离心管的盖子，放入“瓶盖”小瓶中。将过滤单元转移到标有“unit”的新 20 mL 闪烁瓶中，确保红外线保留在试管 3 中，不会转移到“单元”样品瓶中。如果在过滤器单元的边缘看到液滴，请将其放回管 3 中，加盖并向下旋转 10 秒。将试管 3 放入新的 20 mL 玻璃闪烁样品瓶中。
  8. 盖上 5 个闪烁瓶（试管 1、试管 2、试管 3、瓶盖和单元）。准备一个空的加盖 20 mL 闪烁瓶作为空白对照。
  9. 测量γ计数器上的六个闪烁瓶的铜 64 活性。从其他样品瓶的空白样品瓶活性中减去空白样品瓶活性。使用公式 2 计算放射性标记/螯合效率。
    figure-protocol-2（公式 2）
    注：如果单位 cpm 过低（例如，低于或等于试管）或任何读数高于 γ 计数器非线性/饱和阈值，请将闪烁瓶在铅容器中存放长达 4 天，以使活性衰减，直到值低于阈值并重新测量。

7. 微气泡物理化学表征

注：除非实验室有指定的放射性样品处理设备，否则必须使用非放射性的“冷”铜螯合样品进行微气泡物理化学表征。这种“冷”标签有助于评估微气泡产量，这对于评估用于预期应用的微气泡剂量至关重要。此外，它允许与对照未螯合的微泡进行比较，以确保放射性标记过程不会干扰微泡的特性。这种“冷”标记和相关的物理化学表征应在放射性标记的微气泡应用之前进行，如果需要对放射性标记进行修改，可以用作反馈（参见讨论）。

  1. “冷”铜微气泡标记
    1. 使用在步骤 4.7 中添加到脂质悬浮液中的 64CuCl2 溶液的体积、脂质膜内的卟啉摩尔百分比组成和 64CuCl2 产品表上的比活性，计算在放射性标记过程中实现的近似金属：卟啉摩尔比。示例计算可以在 补充文件 1 中找到。
    2. 请遵循当前协议的第 1-3 节。
    3. 在 0.1 N HCl 中制备 0.1 mg·mL-1 CuCl2 溶液。
    4. 将适当体积的 CuCl2 溶液微量移液到根据步骤 7.1.1 计算的脂质悬浮液中，并盖上小瓶。
    5. 旋转小瓶以将 CuCl2 混合到脂质悬浮液中，用 PFP 填充顶部空间，密封，并按照步骤 4.9、4.10 和 4.12 加热。样品瓶处理不需要橡胶镊子。
    6. 1 小时后，将小瓶从火上移开并擦拭外部晾干。让样品瓶冷却至 RT。
    7. 中和脂质悬浮液，混合，用 PFP 填充顶部空间，并按照步骤 4.23 和 4.24 密封。
    8. 按照步骤 5.1-5.3 激活微气泡悬浮液并倾析以获得工作产品。
  2. 微气泡大小
    注意：微气泡大小测定应在激活后立即进行。如果评估工作悬浮液的稳定性，请每隔 30 分钟重复样品制备和测量。通常，1-2 小时的窗口代表激活后使用/施用微气泡工作悬架的时间范围。稳定性测量的目的是确保在此时间范围内保持微泡大小和产量，以便从工作溶液施用的所有处理都包含相似的微泡群。
    1. 打开 Coulter 计数器 （CC） 并使用 编辑 SOP 工具设置以下参数：30 μm 孔径，0.6-18 μm 尺寸范围，孔径电流 400-600 μA，前置放大器增益 4-8,400 个分档，每次运行前后齐平，体积分析，5 μL 样品量。
    2. 通过 0.2 μm 介质真空过滤装置过滤 CC 电解液。填充电解液容器和单独的容器进行样品制备。
    3. 背景测量：用 10 mL 过滤电解液填充 10 mL 一次性比色皿并运行基线测量。确保计数低于 400。如果没有，请冲洗仪器。
    4. 样品测量
      1. 将 10 mL 过滤后的电解液添加到新的比色皿中。通过手动反转/还原来重悬微气泡悬浮液。从样品瓶底部中心处移取 5 μL 微量移液器。擦拭移液器吸头的边缘（开口除外），然后将样品直接浸入准备好的电解液中。
      2. 上下移液以完全转移悬浮液。使用移液器吸头轻轻旋转电解液，直到微泡悬浮液的“缕缕”分散。
    5. 在 CC 上测量样品（每种分析物运行两次）。
      注：5 μL 微泡样品体积通常适用于含有 1-5 x 109 微泡·mL-1 浓度的样品。可能需要根据特定的 CC 仪器设置以及样品微泡产量是否超出上述范围来调整此样品体积。
  3. 共聚焦成像
    注意：根据步骤 7.2 中的说明，在微泡大小后立即进行共聚焦成像，并在保留微泡稳定性的时间范围内进行。
    1. 重悬微泡悬浮液，并将 1-5 μL 转移到玻璃显微镜载玻片的中心。小心地将盖玻片放在微气泡悬浮液滴上，避免气泡滞留。悬浮液将在盖玻片下扩散。
    2. 使用油浸物镜以 60 倍放大倍率对微气泡进行成像。在明场和 633 nm 激发/640-765 nm 发射下获取图像。叠加明场和荧光图像。
      注意：当探针均匀地掺入微泡壳内时，荧光信号应在所有可见颗粒的壳层中重叠。
  4. 荧光分光光度法
    注意：荧光分光光度法测量可以在微泡激活后 24 小时内进行。
    1. 如前所述制备 1% Triton X-10035。
    2. 在第一次测量前 15-30 分钟打开荧光分光光度计。
    3. 在石英比色皿中使用 410 nm 激发和 600-800 nm 发射范围测量 1% Triton X-100 的荧光光谱。选择该选项，通过参考检测器信号（通常称为 S1/R1）对信号进行归一化。
      注意：Triton X-100 在移液时很容易起泡。因此，当转移到比色皿时，只需跳到第一个微量移液器停止处。
    4. 用甲醇冲洗比色皿，并在样品之间用加压空气干燥。
    5. 将 6 mL 1% Triton X-100 转移至 15 mL 离心管中。重悬微泡悬浮液，并通过微量移液器吸出 1 μL。擦拭移液器吸头的边缘（开口除外），将样品转移到准备好的 1% Triton X-100 中，上下吹打以完成转移。涡旋溶液并将其转移到石英比色皿中。
      注意：根据仪器灵敏度和非线性饱和阈值调整样品比例：1% Triton X-100。
    6. 使用步骤 7.4.3 中的参数测量此样品。此测量值对应于“被破坏”的粒子。
    7. 使用 PBS 重复步骤 7.4.3-7.4.6。此测量值对应于“完整”颗粒。
    8. 分别使用 1% Triton X-100 和 PBS 测量对破碎和完整的样品光谱进行基线校正。
    9. 使用完整样品在 PBS （FPBS） 和 1% Triton X-100 （FTx） 中的积分基线校正荧光信号，通过公式 3 计算淬灭效率 （QE）：
      figure-protocol-3（公式 3）
  5. 紫外-可见光谱
    注意：光谱测量可以在微泡激活后长达 72 小时进行。
    1. 在 RT 下使用浴超声仪对微量离心管中的微气泡悬浮液等分试样进行超声处理，直到悬浮液透明。这减少了光谱分析过程中的散射效应。
    2. 在第一次测量前 10 分钟打开分光光度计。选择 0.25 nm 的扫描间隔和 200-800 nm 的采集范围。启用基线减去。
    3. 使用 1 cm 光程石英比色皿进行测量。在两次测量之间用甲醇冲洗比色皿，然后用加压空气干燥。
    4. 获得甲醇的基线测量值。
    5. 涡旋超声处理的透明微泡悬浮液，并将 10-50 μL 转移至含有 200-1000 μL 甲醇的微量离心管中。确保测量甲醇体积并通过干净的玻璃微升注射器添加到试管中。涡旋溶液以获得“破碎”样品。
      注：样品稀释度取决于卟啉负载效率和摩尔百分比组成。20 倍稀释适用于 30 mol% 的热释脂质微泡组成。
    6. 收集 UV-Vis 光谱。
    7. 使用 PBS 代替甲醇重复步骤 7.5.4 至 7.5.6。
      注：可以使用微量移液器代替玻璃微量注射器来测量 PBS 体积。

8. 协议的修改

  1. 替代螯合剂
    1. 根据第 2 节制备脂质膜，用焦磷酸脂质代替替代脂质共轭铜螯合剂（例如，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-二乙烯三胺五乙酸（铵盐），以下简称 DTPA -脂质）。使用 补充文件 1 计算所需的质量和库存体积。
      注意：可能需要测试替代螯合剂的各种摩尔成分，以确定上限，超过该上限就无法产生高产率的稳定微泡。
    2. 按照第 3 节到第 6 节生成和表征放射性标记的微气泡。
    3. 按照步骤 7.1 到 7.3 来表征“冷”铜螯合微泡。只需要明场共聚焦显微镜图像采集来评估颗粒形态。如果替代螯合剂是荧光剂，则除了步骤 7.4 和 7.5 外，还进行具有相关激发和发射波长的共聚焦显微镜检查。
  2. 替代荧光基团
    1. 根据第 2 节准备脂质膜，用焦磷酸脂质代替替代脂质偶联或嵌入荧光团（例如，DiI）。使用 补充文件 1 计算所需的质量和库存体积。
      注意：可能需要测试替代荧光基团的各种摩尔组成，以确定上限，超过该上限就无法产生高产率的稳定微泡。
    2. 按照第 3 节使用 PGG 而不是 AA-PGG。
    3. 完成步骤 5.1 到 5.3 和步骤 7.2 到 7.5。
  3. “加标”方法：标记预先形成的微气泡脂质悬浮液
    1. 按照第 2 节生成卟啉脂质膜，仅使用焦磷酸脂质，不使用其他脂质成分。有关焦释脂质数量，请参阅 补充文件 1 。
    2. 按照第 3 节使用 100-200 μL AA-PGG（如果不需要放射性标记，则为 PGG）代替 1 mL 水合缓冲液水合焦释脂质膜。
    3. 将整个焦磷酸脂质悬浮液转移到预制的脂质微泡悬浮液中。
    4. 用 PFP 填充顶部空间，加热，然后按照步骤 3.4 到 3.9 在 PFP 下对悬浮液和密封进行超声处理。监测焦释脂质悬浮液分散到预制脂质微泡悬浮液中的情况，并进行热/超声循环直至完全分散。
      注：如果使用隔膜密封的商用微泡样品瓶，则可以通过注射器/针头将焦释脂质悬浮液引入样品瓶中，而无需用 PFP 重新填充样品瓶顶部空间。
    5. 根据第 4 节到第 7 节进行放射性标记（参见下面的步骤 8.3.5.1）、激活、分离（参见下面的注释）和相关表征。
      1. 另一种方法是首先放射性标记水合的焦磷酸脂质悬浮液，监测 >94% 的放射化学纯度，用 1 N NaOH 中和（根据用于水合热释脂质膜的 AA-PGG 体积修改体积），然后按照步骤 8.3.3 将放射性标记的焦磷酸脂质悬浮液引入预制的微泡脂质悬浮液中。
        注意：这种修改后的方法只能用于产生荧光或多模式放射性标记的微泡，如果随后进行分离过程，以去除脂质水合过程中产生但未掺入微泡的亚微米多层囊泡。有关更多详细信息，请参阅 讨论 。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

制造放射性标记的微气泡时，关键的可量化结果是放射化学纯度和放射性标记效率。该协议分别使用 iTLC 和经过验证的离心程序来表征每个。 图 2A 显示，在成分为 1 mol%、10 mol% 或总脂质的 30 mol% 时，用宿主脂质替代焦释脂质的商业微气泡模拟配方实现了 ≥95% 的平均放射化学纯度和效率。1 mol% 和 10 mol% 焦释脂质制剂需要更高浓度的脂质悬浮液（0.15 mL vs 1 mL）才能达到这些值。当前方案中实现的高放射化学纯度和螯合效率消除了对标记后纯化的任何需求。

对于由 C16、C18 和 C22 链长脂质组成的替代制剂也是如此，这些脂质具有整体中性或阴离子表面电荷（图 2B）。这些变体加载了 30 mol% 的焦释脂质组成，基于先前确定的上限，以保持平均微泡大小、可接受的微泡产量（>1 x 109 个微泡·mL-1），并限制 >8 μm 微泡群的产生，同时最大限度地提高热释脂...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前的脂质微泡放射性标记方案可实现 >95% 的放射化学纯度、>95% 的螯合效率和微泡物理化学性质的保留，而无需任何标记后纯化。这些成就代表了现有标记方案以前未曾取得的进步。缺乏纯化步骤可以更快地使用放射性同位素（在本例中为铜 64），从而减少放射性衰变引起的低效活性损失。由此产生的微泡特性保留，结合铜-卟啉螯合33 的已知稳定性，更好地确保任何后续放射成像或治疗都代表感兴趣的微泡，而不是与游离放射性同位素或纯化修饰的微泡群相关的微泡。

目前的方案也是第一个集成平行“冷”标记和关键表征技术的方案，以确保保持微泡物理化学特性。事实上，这是第一个对微泡大小、产率和稳定性进行稳健表征的微泡放射性标记方案。了解这些特性对于放射性标记微泡的应用至关重要。需要了解微泡大小、气体体积和产率来确定微泡剂量，这反过来又会影响微泡-FUS 治疗的安全性和有效性。例如，微泡-FUS BBB 打开与微泡剂量/气体体积的上限相关，超过该上限，FUS 后出血和炎症会引起安全问题

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者报告没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Deborah Scollard 和 Teesha Komal（安大略省多伦多市大学健康网络时空定位和辐射响应放大 （STTARR） 计划）的技术服务和指导。我们还感谢 Mark Zheng 和 Alex Dhaliwal 博士在共聚焦显微镜期间提供的技术帮助，以及高级光学显微镜设施（安大略省多伦多）提供相关设备。我们感谢我们的资金来源：加拿大卫生研究院、特里福克斯研究所、加拿大自然科学与工程研究委员会、加拿大创新基金会、玛格丽特公主癌症基金会、加拿大研究主席计划、麦克劳克林中心、瓦尼尔奖学金计划、安大略省研究生奖学金计划、加拿大前列腺癌和彼得伯勒 KM 亨特慈善基金会。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
64CuCl2华盛顿大学医学院，马林克罗特放射研究所N/A小批量订购 （<10 &微;L）溶于0.1N HCl
乙酸 任何公司&ge95%纯度
铝箔任何公司
酸铵任何公司纯度：&ge98%
平衡-分析任何公司能够测量低至0.1毫克
超声仪公司加热到69oCCC
孔径-30微米贝克曼库尔特A36391粒径范围：0.6-18 um
CC 电解质贝克曼库尔特8546719Isoton II 稀释剂
CC 软件贝克曼库尔特Multisizer 4e
心机过滤装置（0.5 mL 30,000 MWCO），带兼容的微量离心管MilliporeSigmaUFC503096Amicon Ultra - 0.5 mL
心管 - 15 mL带盖任何公司
氯仿任何公司度：≥ 99.8% 
库尔特计数器贝克曼库尔特B43905Multisizer 4e 库尔特计数器
盖玻片VWR48393081VWR 微盖玻璃
CuCl2任何公司确保未氧化
CuCl2
色皿 - 夸脱，1 厘米路径长度任何公司
比色皿 - 用于 CC 测量的 10 mL 塑料贝克曼库尔特A35471库尔特计数器 Accuvette ST
ddH2O任何公司可以通过超纯水净化系统获得
DiI（1,1'-二辛烷基-3,3,3'，3'-四甲基啎哚羧菁高氯酸盐）任何公司形式
剂量校准器任何公司能够读取铜-64
DPPA（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸盐（钠盐））Avanti Polar Lipids830855P粉末形式
DPPC（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）Avanti Polar Lipids850355P粉末形式
DPPE-MPEG（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（铵盐））AvantiPolar Lipids880200P粉末形式
DTPA-脂质（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-二乙基三胺五乙酸（铵盐））Avanti Polar Lipids790106P粉末形式
EDTA（乙二胺四乙酸）任何公司
伽马计数器任何公司能够读取铜-64
伽马计数管推盖Globe Scientific22-171-665法兰用于 12 mm 管的塞帽
伽马计数管Sarstedt55.15795 mL， 75 x 12 mm， PS
玻璃烧杯 - 250 mL任何公司能够承受高达 100 oC 的温度
干燥箱任何公司可加热至 80 oC
玻璃微升注射器 - 25、50、100、 1000 &微;l任何公司与有机溶剂兼容
玻璃闪烁瓶 - 20 mLVWR66022-081VWR®闪烁瓶，硼硅酸盐玻璃，带螺旋盖，带纸浆箔衬垫
玻璃瓶 - 0.5 德拉姆VWR66011-020VWR 小瓶 1/2 德拉姆，带黑色酚醛螺旋盖和聚乙烯基面纸浆衬垫
甘油西格玛奥尔德里奇G7757-1L纯度：  ≥ 99.0% 
刻度移液器/喷枪任何公司
热/搅拌板配备用于自动温度控制的温度探测器
盐酸 - 0.1 N任何公司
iTLC 板安捷伦A120B12 iTLC-SA 色谱纸
实验室组织任何公司
介质真空过滤装置任何公司0.22 微米孔径，PES 膜，500 mL 漏斗容量
甲醇任何公司度：  ≥ 99.8%，HPLC 级，符合 ACS 规范
微量离心管 非无菌 - 1.5 mL任何公司
无菌微量离心管 - 1.5 mL任何公司
微量移液器 - p1000、p200、p20、p10任何公司确保是校准的
显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15Superfrost Plus 显微镜载玻片 预清洁
针头 - 18 G无菌
封口膜任何公司
PBSSigma AldrichD8537-500MLDPBS，改性，不含氯化钙和氯化镁，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
PFPFluoroMedAPF-N40HP纯度：  ≥ 99.8%
PFP 系列任何公司直径 1/4 英寸塑料软管切割，长度约 50 厘米
PFP 调节器 世伟洛克SS-1RF4 和 SS-4HC-1-4
pH 计任何公司
pH 标准 4 和 7公司
p1000、p200、p10 移液器吸头 - 非无菌任何公司
p1000、p200、p10 移液器吸头 - 无菌任何公司
注射器 - 1 mL任何公司菌
二醇BioShopPRO888.500纯度：  ≥ 99.5%
焦脂N/A内部制造
橡胶头镊任何公司推荐细头和平/方边的混合
任何公司
氢氧化钠 - 1 N任何公司
光光谱仪任何公司能够进行 410 nm 激发和 600-850 nm 发射
光光谱软件HoribaFluorEssence
光谱仪任何公司
器 - 1 mL公司、塑料、无菌
注射器过滤器 - 0.2 微米孔径任何公司膜材料：PES 或其他与醋酸铵/乙酸和 PBS 兼容的试
管 - 10 mL
Triton X-100任何公司
真空干燥器/真空任何公司
VialmixLantheus Medical Imaging515030-0508在协议中称为机械小瓶摇床
重纸任何公司为避免产品丢失，建议将称重纸切割成 3x3 厘米的正方形
醋浴任何都可以 离 离 纯 比都 粉末 玻璃 纯 任何 塑料 无丙子 剪刀 氢氧化钠 - 10 N 任何公司 任何公司荧 荧 注射 任何 一次性 称

参考文献

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