方法文章

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

DOI：

10.3791/67438

⸱

2025年2月14日

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自然杀伤（NK）细胞是一类先天性免疫细胞，在机体抵御肿瘤和病毒感染中发挥关键作用。利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源、表达嵌合抗原受体（CAR）的NK细胞，已成为一种具有前景的“即用型”癌症免疫治疗策略。本文中，我们采用了一种针对NK细胞优化的CAR结构，该结构包含NKG2D的跨膜区、2B4共刺激区以及CD3ζ信号区，已被证实可有效激发NK细胞介导的强效抗原特异性抗肿瘤活性。利用iPSC生成CAR-NK细胞具有多项优势，包括CAR表达均一、可扩展性强、可重复性高以及具备临床应用潜力。本方案从细胞工程改造到分化过程提供了详细的逐步操作流程，可用于生成经NK细胞优化的iPSC来源CAR表达NK细胞，为提高抗肿瘤活性提供了一种标准化且靶向性强的癌症免疫治疗方法，凸显其作为多种恶性肿瘤潜在治疗手段的重要前景。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统中的一种淋巴细胞，在抵御肿瘤和病毒感染细胞的早期防御中起着关键作用1,2,3。与T细胞不同，NK细胞不需要通过主要组织相容性复合体（MHC）分子进行抗原呈递。相反，NK细胞表达一系列激活性和抑制性受体，用以调控其活性3。NK细胞介导的细胞毒性作用通过多种机制实现，包括释放穿孔素和颗粒酶、激活死亡受体，以及产生如IFN-γ和TNF-α等促炎性细胞因子。这种独特的作用模式使NK细胞成为癌症免疫治疗的理想候选者，特别是在治疗免疫逃逸构成重大障碍的实体瘤方面具有潜力1,2,3,4。

肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率最高的肝癌类型之一5。传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，通常临床获益有限，并导致较高的复发率6,7。近年来，免疫治疗和靶向治疗的进展显著影响了HCC的治疗策略8,9。免疫检查点抑制剂，如纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab），通过增强免疫细胞对癌细胞的反应，已显示出良好的疗效10,11。这些疗法已使部分患者的生存率提高，生活质量改善。然而，它们也可能引发免疫相关的不良反应，从而限制其在某些患者中的应用12。靶向治疗药物，如索拉非尼（sorafenib）和仑伐替尼（lenvatinib），可特异性抑制促进癌细胞生长和血管生成的信号通路13。这些治疗在控制疾病进展和延长生存期方面具有明确的疗效8,14。然而，靶向治疗通常会出现耐药性，且治疗相关的副作用较为常见15,16。在癌症免疫治疗策略的诸多新兴方向中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞的出现彻底改变了癌症治疗格局，尤其在淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了突破性进展17,18,19。

表达CAR的NK细胞将NK细胞的天然细胞毒性与CAR技术的精准靶向能力相结合，为肝细胞癌（HCC）等实体瘤提供了一种创新且具有潜在变革性的治疗策略20,21,22,23,24。经CAR改造的细胞可特异性识别并杀伤表达靶抗原的肿瘤细胞，同时保护正常组织，从而降低传统疗法相关的脱靶效应风险25,26,27。由外周血或脐带血分离的NK细胞制备的CAR-NK细胞，通常通过将CAR结构转导至NK细胞中实现，该结构包含一个胞外抗原识别域、一个跨膜域以及对细胞活化和增殖至关重要的胞内信号域28,29,30。

通过使用诱导性多能干细胞（iPSCs），可以解决为临床治疗构建稳定且均一的功能性工程化自然杀伤（NK）细胞群体所面临的挑战31,32。对人源iPSCs进行基因改造，使其携带针对NK细胞优化的嵌合抗原受体（CAR），可增强NK细胞的活化与增殖信号，并提供一种标准化的、可无限扩增且高度均一的CAR表达NK细胞群体，作为即用型治疗方案"off-the-shelf therapy"20,33。本方案中，通过对iPSCs进行遗传修饰以生成表达CAR的iPSC来源NK细胞，涉及整合一种针对NK细胞优化的CAR结构，该结构包含来源于NK细胞的跨膜区和信号传导结构域(NKG2D-2B4-CD3ζ)，以及一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的单链可变区片段（scFv），如我们先前研究所述23。随后，利用此前建立的NK细胞分化方案对基因工程化后的iPSCs进行分化与扩增34。这些经工程化改造、表达CAR的iPSC来源NK细胞能够识别并清除表达特定肿瘤相关抗原（如在肝细胞癌及其他恶性肿瘤中高表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3））的肝细胞癌（HCC）及其他肿瘤细胞35,36,37,38。

iPSC来源的CAR-NK细胞在治疗多种癌症中的应用具有重要意义30,39,40; 目前许多由iPSC衍生的CAR-NK细胞正处于临床试验阶段41,42,43为促进该领域的进展，本方案实现了从细胞工程化到分化为成熟自然杀伤细胞的高效制备工程化诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞， 体外 扩增

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方案

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1. 人类iPSC的无饲养层培养方法

注意：按照先前所述方法23,34，将冻存的未分化人iPSCs解冻，并在预先包被基质胶（下文简称基底膜基质[BMM]）的培养板上使用mTeSR 1-plus进行培养。必须确保iPSCs在基因编辑前后均未发生分化。新解冻的iPSCs应传代培养约2-3代，以呈现与人多能干细胞一致的多能性形态。以下操作步骤适用于从6孔板的一个孔中传代细胞。

  1. 传代iPSC前，用1× BMM（每孔1 mL）包被新的6孔板，并在37 °C培养箱中孵育2–4小时后使用。
  2. 制备1×溶解的BMM。
    1. 在4 °C条件下过夜解冻一支5 mL的BMM储备液。
    2. 使用预冷的枪头快速将BMM分装至预冷的微量离心管中。
    3. 储存于-80 °C，可保存长达6个月。
    4. 配制1× BMM工作液时，按1:100比例将一份BMM分装物重悬于冷的DMEM/F12培养基中。1× BMM工作液可在-4 °C保存2周。
    5. 用足够体积的BMM包被培养板以覆盖整个表面（例如，6孔板每孔使用1 mL）。
    6. 使用前在37 °C培养箱中孵育2–4小时。
  3. 在37 °C水浴中解冻一支冻存的iPSC（通常为1 × 106 个细胞/管）。
  4. 将解冻后的iPSC缓慢加入含有5 mL预热mTeSR Plus培养基的15 mL锥形管中，逐滴加入细胞以减少细胞应激，使其逐渐适应环境。
  5. 以300 ×g离心5分钟。
  6. 吸除上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞一次。
  7. 将细胞重悬于mTeSR Plus培养基中，以约200,000个细胞/3 mL/孔的密度接种至BMM预包被的6孔板中。
  8. 进行iPSC传代。
    1. 当iPSC达到70–80%融合度时，吸除培养基，在37 °C下用TrypLE进行单细胞传代消化5分钟（6孔板每孔1 mL）。
    2. 5分钟后，加入3 mL 1× PBS终止消化反应，并用3 mL PBS洗涤细胞一次。
    3. 以300 × g离心5分钟。洗涤后，将单细胞状态的iPSC重悬于mTeSR Plus培养基中，然后接种至BMM预包被的6孔板。
      注：6孔板每孔所需总培养基体积为3 mL。每2–3天更换一次培养基，且在细胞达到70–80%融合度时需重复步骤1.8，至少传代1–2次后方可进行iPSC的基因工程操作。
  9. 定期检测iPSC的多能性。将iPSC在冰上用藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的TRA-1-81抗体和PE-Cy7标记的阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA-4）抗体染色30分钟，随后按照先前描述的方法进行流式细胞术分析23,41。
    注：本实验所用iPSC已适应TrypLE消化。此前未使用TrypLE传代的iPSC通常需要8–10次传代才能完全适应TrypLE，从而确保生成高质量的悬浮胚状体（EBs）。

2. 使用 piggyBac 载体对人iPSCs进行基因改造以表达抗GPC3 CAR

  1. 用BMM包被新的6孔板，并在37 °C孵育至少1小时（时间可更长，只要液体不干燥即可）。
  2. 将mTeSR Plus与10 µM Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）（用无菌蒸馏水配制的1 mM储备液）在37 °C预温。
  3. 打开核转染系统，选择X单元，然后选择需要转染的孔位。选择P3溶液，并手动输入代码（CA-137）。
  4. 使用1 mL TrypLE收获70–80%融合度的iPSCs，在37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察以确认细胞解离。
  5. 轻柔吹打4–6次以获得单细胞悬液，然后加入5 mL PBS中和，并在300 × g离心5分钟形成细胞沉淀。
  6. 再轻柔洗涤细胞一次，以彻底去除残留的TrypLE。
  7. 将细胞重悬于1 mL含ROCK抑制剂的mTeSR Plus中，并进行细胞计数。
  8. 为构建抗GPC3 CAR iPSCs，每转染使用1 × 106个细胞置于微量离心管中，在300 × g离心5分钟。
  9. 在离心过程中，将表达CAR的转座子DNA与超级PiggyBac转座酶表达载体按3:1的比例（例如，3 µg含转座子的质粒与1 µg转座酶质粒）加入1.5 mL微量离心管中混合。
  10. 使用0.5 µL浓度为1 mg/mL的绿色荧光蛋白（GFP）阳性对照（材料表），并设置未转染的阴性对照，以确认GFP表达。
  11. 将细胞沉淀小心重悬于20 µL室温（RT）的P3核转染试剂（含核转染试剂盒提供的添加剂）中，然后将该混合物加入含有质粒DNA的1.5 mL微量离心管中，最终体积约为22–25 µL。
    注意：在向细胞中加入GPC3 CAR质粒或GFP对照质粒之前，应先将所有待转染的iPSCs重悬于P3核转染试剂中。
  12. 将细胞/DNA悬液转移至20 µL 16孔电转杯条中，确保样品覆盖电转杯底部且无气泡。
  13. 轻敲16孔电转杯条底部以去除任何气泡，并使细胞沉降至底部。
  14. 将含有iPSCs和CAR DNA混合物的16孔电转杯条放入核转染系统中，选择程序CA-137, P3溶液，然后启动程序。该程序将在1秒内结束并显示绿色勾选标记。
  15. 向电转杯中加入80 µL预温的含ROCK抑制剂的mTeSR Plus培养基，然后小心地将细胞转移至已包被BMM的6孔板中（每孔终体积为1 mL）。
  16. 转染后4小时，在荧光显微镜下快速检查细胞是否有GFP表达，以确认转染成功率。
  17. 转染后24小时，通过流式细胞术23,41检测iPSCs的GFP表达，以评估转染效率，并确认GFP表达。
  18. 在37 °C孵育4天，根据需要更换培养基，之后进行药物筛选。
    注意：每次核转染反应需要0.2–2 × 106个iPSCs。根据反应数量，可使用24孔板或6孔板。

3. GPC3-CAR iPSCs 的克隆筛选与多能性验证

  1. 对转染后的iPSCs进行一系列zeocin筛选（1:10,000），以单克隆方式筛选表达GPC3-CAR的iPSCs。
  2. 为确认转染效率，使用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达23,41。
    注：CAR结构中包含一个FLAG标签44,45 ，用于在iPSC阶段及NK细胞分化后评估CAR的表达情况。
  3. 在药物筛选条件下维持培养转染后的CAR-iPSCs，直至其达到最佳的CAR基因和GFP表达水平。
  4. 为确保GFP和CAR表达的均一性，延长药物筛选时间为2-3周。
  5. 基于GFP或CAR表达，通过流式细胞术进行细胞分选，以获得均一的单克隆筛选iPSC群体23。
  6. 此处使用的CAR结构包含zeocin药物筛选标记。通过向培养基中添加zeocin（50 µg/mL）来筛选转染了GPC3 CAR基因的细胞。
  7. zeocin筛选后，将转染了GPC3 CAR基因的iPSCs进行稀释，并接种至96孔板中，使每孔约含一个细胞。可通过连续稀释法或细胞分选仪实现。
    注：使用荧光激活细胞分选（FACS）根据与CAR结构相连的荧光标记的表达情况分离单个转染细胞。
  8. 让单个细胞在96孔板中扩增形成克隆集落。
  9. 每3-4天更换一次新鲜培养基，并观察各孔中集落的生长情况。
  10. 对集落进行CAR表达的筛选。可通过聚合酶链式反应（PCR）、定量聚合酶链式反应（qPCR）或蛋白质印迹法（Western blotting）验证CAR结构的存在23,47。
  11. 或者，使用流式细胞术23,41 检测CAR蛋白的表面表达。
    注：本研究中，通过流式细胞术检测FLAG标签的表达来定量CAR的表达水平。
  12. 此外，进行核型分析以鉴定是否存在染色体异常。
    注：该分析可由第三方机构（如Wicell（wicell.org）或Thermo Fisher Scientific（thermofisher.com））完成。
  13. 一旦鉴定出无任何异常的CAR阳性克隆，将其转移至更大的培养容器（如6孔板和T75培养瓶）中进行扩增。
  14. 使用冷冻保存培养基将单克隆扩增的CAR-iPSCs分装至多个冻存管中进行冷冻保存，以备后续使用。
    注：建议在该步骤中注意以下几点：（i）维持iPSCs的最佳培养条件，防止其发生分化。（ii）在药物筛选后，需1-4周时间以获得CAR和GFP表达均一的iPSC群体。（iii）持续监测细胞中CAR表达及多能性标志物的稳定性。（iv）在筛选和验证步骤中使用适当的对照组。（v）在单克隆筛选和扩增后，通过检测CAR表达iPSCs中TRA-1-81和SSEA-4的表达来验证其多能性。

4. 通过旋转形成拟胚体（EB）从经基因工程改造的CAR诱导多能干细胞生成造血祖细胞

注意：采用悬浮培养拟胚体（spin EB）或造血类器官方案生成造血祖细胞23,34。拟胚体内的细胞可分化为基质细胞，以支持淋巴细胞发育38，从而避免使用异源来源的基质细胞（如OP9细胞）23,34,48。以下为从6孔板中单个孔收集细胞用于拟胚体形成的实验步骤。

  1. 在制备旋转悬浮胚状体（spin EB）前2天，将约200,000个细胞/孔接种于6孔板中预先包被的BMM上。确保在进行spin EB实验当天细胞融合度达到70–80%。通常情况下，1个6孔板的细胞足以用于制备两块96孔板的spin EB。
  2. 吸除培养基，加入1 mL预热的TrypLE Select溶液，在37 °C孵育5分钟以消化细胞。
  3. 使用1 mL移液枪轻柔吹打，将细胞团块充分解离为单细胞悬液，并转移至15 mL锥形管中。加入3 mL 1× PBS终止消化反应，并用3 mL PBS洗涤细胞一次。
  4. 将细胞重悬于mTesR Plus培养基中，并通过70 µm细胞筛网过滤，以去除未解离的细胞团块。
  5. 以离心法收集细胞，弃上清液，再用5 mL PBS洗涤一次。随后将细胞重悬于1 mL STEMdiff APEL培养基（胚状体形成培养基）中。
  6. 用含以下细胞因子的胚状体形成培养基（SCF：40 ng/mL，BMP4：20 ng/mL，VEGF：20 ng/mL）并添加10 µM ROCK抑制剂，将细胞计数后调整至适当密度。
  7. 在96孔板中每孔加入100 µL培养基，接种3,000–10,000个细胞/孔（即100,000个细胞/mL）。
    注意：EB形成所用细胞数量可能因iPSC细胞系不同而有所差异。建议在96孔板中每孔测试3,000至10,000个细胞的范围。
  8. 使用多通道移液器将细胞悬液以每孔100 µL加入96孔板中。
    注意：为获得更佳的胚状体（EB）形成效果，建议使用超低吸附表面、圆底的96孔板。
  9. 将96孔板以300 ×g离心5分钟，随后在37 °C、5% CO2条件下培养6天。
    注意：初步研究表明，本研究中使用的CAR-iPSC细胞系在培养6天后可产生>30%的CD34+细胞。
  10. 通过流式细胞术检测EB的质量23,41。
    1. 准备4 mL预热的含0.4%鸡血清的0.25%胰蛋白酶溶液（每4 mL胰酶中加入16 μL鸡血清），用于EB的解离。
    2. 将10–30个EB转移至15 mL锥形管中。
    3. 向EB中加入胰蛋白酶/鸡血清溶液，在水浴中孵育10分钟，每隔30秒涡旋震荡一次，确保EB完全解离。
    4. 用移液器吹打经胰酶处理的EB，上下吹打数次以彻底解离EB团块。
    5. 加入5 mL 1× PBS以终止胰酶消化反应。
    6. 将细胞悬液通过70 μm细胞筛网过滤至新的锥形管中。
    7. 以300 × g离心5分钟。
    8. 吸除上清液，将细胞重悬于3–5 mL新鲜培养基中。
    9. 对细胞进行计数，使用CD34、CD31、CD43和CD45等典型EB标志物进行染色，并通过流式细胞术分析23,41 （图3）。
    10. 根据厂家说明书推荐体积，将适量抗体加入含100 µL流式缓冲液的各管中（每管含解离后的EB单细胞），冰上孵育30分钟39,41。
    11. 孵育结束后，用流式缓冲液洗涤细胞两次，加入SYTOX蓝活/死染料，然后进行流式细胞术分析。
      注意：通常情况下，使用本研究中的iPSC细胞系，在第6天从解离的旋转悬浮胚状体（Spin embryoid bodies）总细胞群中可获得>30%的CD34+细胞，但该比例可能因iPSC来源及培养条件不同而有所变化。

5. 从旋转EBs分化GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞

注意：表达 GPC3 CAR 的 Spin EBs 可接种于 24 孔板或 6 孔板中，板壁可预先用 2% 明胶包被或不包被。更换培养基时，6 孔板更为合适，而使用 2% 明胶包被可增强 EBs 的贴壁能力。

  1. 按照以下步骤制备明胶包被的6孔板。
    1. 将明胶溶于组织培养级水中，配制 2% (w/v) 的明胶溶液。
    2. 在121 °C、15 psi条件下高压灭菌30分钟，对溶液进行灭菌。
    3. 用5–10 µL/cm²的明胶溶液包被每个孔的表面2 （约每孔1 mL，适用于6孔板）
    4. 将培养板在37 °C孵育2–4小时后使用。孵育结束后，在进行拟胚体转移前，吸除残留的明胶溶液。
  2. 制备NK细胞分化培养基：加入56.6% DMEM+ GlutaMAX-I、28.3% F12+ GlutaMAX-I、15%热灭活人AB血清、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺、1 µM β-巯基乙醇、5 ng/mL亚硒酸钠、50 µM乙醇胺和20 mg/L抗坏血酸。4 °C避光保存。
  3. 向已包被明胶的6孔板每孔中加入3 mL含有以下细胞因子的NK分化培养基（IL-3：5 ng/mL，SCF：20 ng/mL，IL-7：20 ng/mL，IL-15：10 ng/mL）。
  4. 第6天，按照以下步骤将悬浮培养的EB直接转移至已制备的明胶包被的6孔板中，孔内含NK分化培养基。
    1. 使用10 mL血清移液管将EBs从96孔板小心转移至10 cm培养皿中，并移除大部分培养基。
    2. 向每孔胶原蛋白包被的6孔板中加入3 mL含有上述细胞因子的NK分化培养基。
    3. 使用1 mL微量移液器将16-20个EBs分配至6孔板的每个孔中。
      注意：平均而言，一个96孔板中的EB可用于接种一个NK分化用的6孔板。
  5. 每5-7天更换一次培养基。自然杀伤细胞分化第一周后，从培养基中去除IL-3。
    注意：14天后，需每3-4天更换一次培养基。
  6. 继续更换培养基3-4周。评估自然杀伤细胞标志物（CD45）的表达+CD56+通过流式细胞术24,42 悬浮细胞上。
  7. 当 >80%的悬浮细胞表达CD45+CD56+用70 µm滤器过滤细胞以去除任何团块，收集细胞。
  8. 将收获的NK细胞与经100 Gy照射的aAPCs共培养34,48 并在含有IL-2（100 ng/mL）和IL-15（10 ng/mL）的NK扩增培养基中进行培养。

6. 抗GPC3 CAR-iPSC来源的NK细胞扩增

注意：通常，即使在扩增前，也可从单个6孔板中获得2-20 × 106个自然杀伤（NK）细胞。为了促进NK细胞的进一步扩增以用于后续实验，可使用人工抗原呈递细胞（aAPCs）来生成>1 × 109个NK细胞。

  1. 利用表达41BBL和膜结合型IL-21（41BBL-mbIL-21）的基因工程K562细胞48 作为人工抗原呈递细胞（aAPCs）以诱导NK细胞扩增。
  2. 在将人工抗原呈递细胞（aAPCs）与自然杀伤细胞（NK细胞）共培养之前，用100 Gy照射aAPCs，并将其保存为冷冻储备液。
  3. 从6孔板中收集悬浮细胞，并将NK细胞接种于含有50 U/mL IL-2和IL-15（10 ng/mL；需新鲜添加）的NK细胞扩增培养基中，细胞密度为5 × 10⁵ cells/mL5 cells/mL
  4. 将解冻的经照射的aAPCs以1:1的比例加入NK细胞中。
  5. 每3-4天更换一次培养基，分别补充新鲜的IL-2和IL-15，终浓度分别为50 U/mL和10 ng/mL。
  6. 确保CAR诱导多能干细胞来源的NK细胞在一段时间内保持扩增能力 >3个月，同时维持细胞活力和细胞溶解活性。

7. GPC3 CAR iPSC 来源的 NK 细胞的表型与功能特征分析

注意：GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞的表征涉及对其表型特征和功能活性的全面评估。

  1. 通过流式细胞术检测抗GPC3 CAR-iPSC来源的NK细胞上CD45、CD56、CD94、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM、TRAIL和FasL等NK活化受体的表达24,42 以确定CAR-NK细胞的活性和成熟状态（图4).
  2. 评估 体外 采用基于流式细胞术的Caspase-3/7检测、CD107a颗粒释放检测、IFN-γ和TNF-α细胞因子释放检测，评估GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞针对多种肿瘤靶标的生物学功能活性。
  3. 对于Caspase3/7检测，按照以下步骤操作。
    1. 计数目标细胞，并在37 °C条件下，用5 µM的细胞示踪荧光染料在PBS中对细胞进行预染色，孵育15分钟。
    2. 在37 °C下，将经染色的靶细胞用完全培养基洗涤后，与CAR iPSC来源的NK细胞按不同的效应细胞与靶细胞比例（E:T）共培养。
    3. 共培养3小时30分钟后，加入Caspase-3/7绿色检测试剂，继续孵育30分钟，总孵育时间为4小时。
    4. 在染色的最后5分钟内加入1 µL死细胞染色液，轻轻混匀。
    5. 使用流式细胞术分析染色后的细胞23,41(图5).
  4. 采用本方案可全面了解GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞的表型特征及功能活性，从而对其治疗潜力进行可靠评估。
    注意：通常需要4-5周时间才能获得 >90% CD45+CD56+ 使用GPC3 CAR iPSC细胞系进行旋转EB法诱导的NK细胞分化及NK细胞扩增条件下获得的细胞。某些iPSC细胞系可能仅需3周，而部分细胞系可能需要更长时间（约4-5周）。

8. 问题排查事项及解决方案

注意：使用旋转拟胚体（EB）方法对诱导多能干细胞来源的靶向GPC3嵌合抗原受体自然杀伤细胞（GPC3 CAR NK细胞）进行分化、扩增和功能检测时，可能会遇到多种问题。以下列出了一些常见问题及相应的建议解决方案：

  1. 拟胚体（EB）形成不一致的症状
    1. 检查拟胚体是否过小或过大，且形状不规则。
  2. 拟胚体（EB）形成不一致的解决方案
    1. 调整用于形成拟胚体的离心速度和时间。通常采用约 200–300 × g 离心 5–10 分钟。
    2. 确保使用适当的 U 型底培养板或超低吸附培养皿，以促进拟胚体的形成。
    3. 确认诱导多能干细胞（iPSCs）具有均一性，并且不含可能影响拟胚体形成的已分化细胞。
  3. iPSCs 向自然杀伤细胞（NK 细胞）分化效果不佳的症状
    1. 检查 NK 细胞标志物（如 CD56、NKp46）的表达水平是否较低。
    2. 检查是否未能形成拟胚体或拟胚体形成不良。
  4. iPSCs 向自然杀伤细胞（NK 细胞）分化效果不佳的解决方案
    1. 确保关键生长因子（如 VEGF、BMP4、Y-27632、FLT3、IL-15、IL-7、SCF 和 IL-3）的浓度适合拟胚体形成及 NK 细胞分化。根据既往研究23,34,41调整其浓度。
    2. 确保 iPSCs 的初始接种密度适当。通常建议在旋转法形成拟胚体时，接种密度为 8000–10,000 个细胞/100 µL。
    3. 验证分化培养基配制正确，包含必要的补充成分（如血清或无血清替代物、其他细胞因子）。
    4. 给予足够时间进行拟胚体形成，通常至少 6 天，最长可达 12 天，之后再更换为 NK 细胞分化培养基。
  5. NK 细胞扩增效果不佳的症状
    1. 检查扩增过程中细胞产量是否有限。
    2. 检查扩增后的 NK 细胞活力是否降低。
  6. NK 细胞扩增效果不佳的解决方案
    1. 在扩增阶段提高 IL-15 和 IL-2 的浓度。这可显著增强 NK 细胞的增殖能力。
    2. 可考虑使用饲养细胞（如经辐照的 aAPCs）以改善 NK 细胞的存活和扩增。
    3. 定期监测细胞密度，并在细胞达到过度拥挤前进行传代，以维持最佳生长条件。
  7. 功能检测结果不理想的症状
    1. 检查对靶细胞的杀伤活性是否降低。
    2. 检查细胞因子分泌水平是否较低（如 IFN-γ、TNF-α）。
  8. 功能检测结果不理想的解决方案
    1. 优化细胞毒性实验中的效应细胞与靶细胞比例。可从 10:1 的比例开始，并根据实验结果进行调整。
    2. 确保在进行功能检测前 NK 细胞已充分激活。可包括使用细胞因子预刺激或与经辐照的 aAPCs 共培养。
    3. 验证靶细胞系对 NK 细胞介导的裂解是否敏感。使用已知敏感的靶细胞作为对照。
    4. 延长功能检测的持续时间，以确保有足够时间使 NK 细胞活性得以充分显现。
  9. CAR 表达水平不理想的症状
    1. 检查 NK 细胞间 CAR 表达是否不一致。
  10. CAR 表达水平不理想的解决方案
    1. 验证 CAR 转染方法（如病毒转导、电穿孔）的效率。必要时调整感染复数（MOI）或电穿孔条件。
    2. 采用适当的筛选标记以富集 CAR 阳性（CAR+）NK 细胞。根据需要使用抗生素筛选或荧光标记分选。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抗GPC3-CAR诱导多能干细胞来源的NK细胞分化与扩增示意图
示意图展示了 体外 由人诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的抗GPC3-CAR基因修饰NK细胞，以及携带GPC3 CAR结构的piggyBac载体示意图。首先，将未修饰的iPSCs转染携带编码GPC3 CAR（嵌合抗原受体）的piggyBac载体。转染后，表达GPC3 CAR的iPSCs进行单克隆扩增，随后分化为具有功能的CAR iPSC来源的NK细胞。这些基因工程改造的NK细胞随后接受 体外 和 在体 用于评估其对多种肿瘤细胞系抗肿瘤活性的功能实验图1).

野生型及抗GPC3-CAR基因修饰iPSC在不同阶段NK分化过程的显微镜分析
将GPC3 CAR基因修饰的iPSC分化为抗GPC3-CAR基因修饰的iPSC来源的NK细胞。从GPC3 CAR基因修饰的iPSC形成悬浮胚状体（EB），到进一步分化为GPC3-CAR iP...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了一种标准化且可重复的方法，旨在通过稳定的细胞来源生成表达CAR的iPSC来源的NK细胞，以促进靶向治疗 "现成的" 癌症免疫治疗。多项临床前和临床研究已表明，基于过继性自然杀伤（NK）细胞的免疫治疗在治疗癌症方面具有疗效，同时可最大限度地减少移植物抗宿主病（GvHD）或细胞因子释放综合征（CRS）等毒性反应。23,42, 49,50,51,52,53,54,55,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK 是 Shoreline Biosciences 的联合创始人及顾问，并持有该公司股权。DSK 还为 Therabest 和 RedC Bio 提供咨询服务，并从中获得收入和/或股权。这些安排的条款已经过加州大学圣地亚哥分校根据其利益冲突政策审查并批准。其余作者声明无竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢Kaufman实验室所有成员的支持、科学见解和讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助U01CA217885、P30CA023100（行政补充资助）以及加州大学圣地亚哥分校桑福德干细胞研究所的支持。JT：撰写和修改稿件。DSK：审阅并编辑稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
aAPC Dean A. Lee 实验室 N/A
a-MEM 培养基 赛默飞世尔科技 Cat#12634
APC 抗 DYKDDDDK（FLAG 标签）BD 生物科学 Cat#637308
APC-抗人 TRA-1-81 赛默飞世尔科技17-8883-42 
APC-CD16BD 生物科学 Cat#302015
APC-CD43 BD 生物科学Cat# 560198 
APC-CD45 BD 生物科学Cat# 555485 
APC-GPC3BD 生物科学 Cat#DB100B
APC-NKG2D BD 生物科学 Cat# 558071 
CellEvent Caspase-3/7 绿色检测试剂 赛默飞世尔科技 Cat#C10423
CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒 赛默飞世尔科技 Cat#C34571细胞示踪荧光染料 
CryoStor 溶液 干细胞科技公司https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html冷冻保存培养基
CTS NK Xpander吉布科A5019001
CTS NK-Xpander 培养基生命技术公司Cat#A5019001
DMEM吉布科11965084
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂，丙酮酸钠吉布科10569010
EasySep 人 NK 细胞富集试剂盒 干细胞科技公司 Cat#19055
乙醇胺西格玛奥德里奇E9508
胎牛血清 赛默飞世尔科技 Cat# 10437010
荧光素异硫氰酸酯-CD94 BD 生物科学 Cat#555888
GlutaMAX 补充剂吉布科35050061
GolgiPlug BD 生物科学 Cat#555029
GolgiStop BD 生物科学 Cat#554724
Ham's F-12 营养混合物，含 GlutaMAX 补充剂吉布科31765035
马血清 赛默飞世尔科技 Cat#16050130
人血清 AB 西格玛奥德里奇Cat#BP2525100
人干细胞 Nucleofector™ 试剂盒 龙沙 Cat# VPH-5012
人：HePG2 细胞 美国典型培养物保藏中心（ATCC） Cat#HB-8065
人：HePG2-td-tomato-luc 细胞 Dan S. Kaufman 实验室N/A
人：iPS 细胞 Dan S. Kaufman 实验室 N/A
人：SNU-449 细胞 ATCCCat#CRL-2234
人：SNU-449-td-tomato-luc 细胞 Dan S. Kaufman 实验室N/A
IncuCyte Caspase-3/7 绿色凋亡检测试剂盒 Essen Bioscience Cat#4440
L-抗坏血酸西格玛奥德里奇A5960
MP 生物医学 人血清，AB 型MP 生物医学ICN2938249
mTeSR plus干细胞科技公司 100-0276
NovoExpress 软件 ACEA 生物科学 https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
PE/Cy7 抗人 SSEA-4 抗体 Biolegend330420
PE-CD16 BD 生物科学 Cat#560995 
PE-CD226BD 生物科学 Cat#559789
PE-CD34 BD 生物科学Cat# 555822 
PE-CD45 BD 生物科学 Cat# 555483 
PE-CD94 BD 生物科学 Cat#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
PE-FAS 配体 BD 生物科学 Cat#564261 
PE-NKp30BD 生物科学Cat# 558407
PE-NKp44 BD 生物科学 Cat#558563 
PE-NKp46BD 生物科学 Cat#331908
PE-NKp46 BD 生物科学 Cat#557991 
外周血血沉棕黄层 圣迭戈血库（https://www. sandiegobloodbank.org/） N/A
PE-TRAIL BD 生物科学 Cat#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Branden Moriarity 实验室 N/A
pMAX-GFP 质粒龙沙N/AGFP 阳性对照 
Prism 9Graphpad 版本 9
pSpCas9 金斯瑞PX165
RBC 裂解缓冲液（10×）BiolegendCat#420301
重组人 bFGF 基础型 R&D 系统 Cat#4114-TC
重组人 BMP-4 百肽生物科技Cat#120-05
重组人 FLT-3 配体 百肽生物科技Cat# 300-19
重组人 IL-15 百肽生物科技Cat# 200-15
重组人 IL-2 百肽生物科技Cat# 200-02
重组人 IL-3 百肽生物科技Cat#200-03
重组人 IL-7 百肽生物科技Cat# 200-07
重组人 Nodal 蛋白R&D 系统 Cat#3218-ND-025
重组人 SCF 百肽生物科技Cat# 300-07
重组人 TGF-β1百肽生物科技Cat#100-21
重组人 VEGF 百肽生物科技Cat# 100-20
RPMI1640吉布科11875093
亚硒酸钠西格玛奥德里奇214485
STEMdiff APEL 2 培养基干细胞科技公司 5270拟胚体形成培养基
STEMdiff APEL2 培养基 干细胞科技公司 Cat#05270
超级 piggyBac 转座酶表达载体SBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒赛默飞世尔科技S10274, S10349死细胞染色溶液试剂盒
β-巯基乙醇吉布科21985023

参考文献

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CAR NK NK

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