本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。
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本文内容
摘要
摘要
自然杀伤（NK）细胞是一类先天性免疫细胞，在机体抵御肿瘤和病毒感染中发挥关键作用。利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源、表达嵌合抗原受体（CAR）的NK细胞，已成为一种具有前景的“即用型”癌症免疫治疗策略。本文中，我们采用了一种针对NK细胞优化的CAR结构，该结构包含NKG2D的跨膜区、2B4共刺激区以及CD3ζ信号区，已被证实可有效激发NK细胞介导的强效抗原特异性抗肿瘤活性。利用iPSC生成CAR-NK细胞具有多项优势，包括CAR表达均一、可扩展性强、可重复性高以及具备临床应用潜力。本方案从细胞工程改造到分化过程提供了详细的逐步操作流程，可用于生成经NK细胞优化的iPSC来源CAR表达NK细胞，为提高抗肿瘤活性提供了一种标准化且靶向性强的癌症免疫治疗方法，凸显其作为多种恶性肿瘤潜在治疗手段的重要前景。
引言
自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统中的一种淋巴细胞，在抵御肿瘤和病毒感染细胞的早期防御中起着关键作用1,2,3。与T细胞不同，NK细胞不需要通过主要组织相容性复合体（MHC）分子进行抗原呈递。相反，NK细胞表达一系列激活性和抑制性受体，用以调控其活性3。NK细胞介导的细胞毒性作用通过多种机制实现，包括释放穿孔素和颗粒酶、激活死亡受体，以及产生如IFN-γ和TNF-α等促炎性细胞因子。这种独特的作用模式使NK细胞成为癌症免疫治疗的理想候选者，特别是在治疗免疫逃逸构成重大障碍的实体瘤方面具有潜力1,2,3,4。
肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率最高的肝癌类型之一5。传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，通常临床获益有限，并导致较高的复发率6,
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方案
1. 人类iPSC的无饲养层培养方法
注意：按照先前所述方法23,34，将冻存的未分化人iPSCs解冻，并在预先包被基质胶（下文简称基底膜基质[BMM]）的培养板上使用mTeSR 1-plus进行培养。必须确保iPSCs在基因编辑前后均未发生分化。新解冻的iPSCs应传代培养约2-3代，以呈现与人多能干细胞一致的多能性形态。以下操作步骤适用于从6孔板的一个孔中传代细胞。
- 传代iPSC前，用1× BMM（每孔1 mL）包被新的6孔板，并在37 °C培养箱中孵育2–4小时后使用。
- 制备1×溶解的BMM。
- 在4 °C条件下过夜解冻一支5 mL的BMM储备液。
- 使用预冷的枪头快速将BMM分装至预冷的微量离心管中。
- 储存于-80 °C，可保存长达6个月。
- 配制1× BMM工作液时，按1:100比例将一份BMM分装物重悬于冷的DMEM/F12培养基中。1× BMM工作液可在-4 °C保存2周。
- 用足够体积的BMM包被培养板以覆盖整个表面（例如，6孔板每孔使用1 mL）。
- 使用前在37 °C培养箱中孵育2–4小时。
- 在....
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结果
抗GPC3-CAR iPSC来源的NK细胞分化与扩增示意图
示意图展示了 体外 由人诱导多能干细胞（iPSCs）分化的抗GPC3-CAR工程化NK细胞，以及携带GPC3 CAR结构的piggyBac载体示意图。首先，将未修饰的iPSCs转染携带编码GPC3 CAR（嵌合抗原受体）的piggyBac载体。转染后，表达GPC3 CAR的iPSCs进行克隆扩增，随后分化为具有功能的CAR iPSC来源NK细胞。这些工程化NK细胞随后接受 体外 和 体内 用于评估其对多种肿瘤细胞系抗肿瘤活性的功能实验图1).
野生型及抗GPC3-CAR基因修饰iPSC在不同阶段NK分化过程的显微分析
将GPC3 CAR基因修饰的iPSC分化为抗GPC3-CAR基因修饰的iPSC来源的NK细胞。从GPC3 CAR基因修饰的iPSC形成悬浮胚状体（EB），到进一步分化为GPC3-CAR iPSC来源的NK细胞，整个.......
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讨论
本方案概述了一种标准化且可重复的方法，旨在通过稳定的细胞来源生成表达CAR的iPSC来源的NK细胞，以促进靶向治疗 "现成的" 癌症免疫治疗。多项临床前和临床研究已表明，基于过继性自然杀伤（NK）细胞的免疫治疗在治疗癌症方面具有疗效，同时可最大限度地减少移植物抗宿主病（GvHD）或细胞因子释放综合征（CRS）等毒性反应。23,42, 49,50,51,52,53,54,55,
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披露
DSK 是 Shoreline Biosciences 的联合创始人及顾问，并持有该公司股权。DSK 还为 Therabest 和 RedC Bio 提供咨询服务，并从中获得收入和/或股权。这些安排的条款已经过加州大学圣地亚哥分校根据其利益冲突政策审查并批准。其余作者声明无竞争利益。
致谢
感谢Kaufman实验室所有成员的支持、科学见解和讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助U01CA217885、P30CA023100（行政补充资助）以及加州大学圣地亚哥分校桑福德干细胞研究所的支持。JT：撰写和修改稿件。DSK：审阅并编辑稿件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| aAPC | Dean A. Lee 实验室 | N/A | |
| a-MEM 培养基 | 赛默飞世尔科技 | Cat#12634 | |
| APC 抗 DYKDDDDK（FLAG 标签） | BD 生物科学 | Cat#637308 | |
| APC-抗人 TRA-1-81 | 赛默飞世尔科技 | 17-8883-42 | |
| APC-CD16 | BD 生物科学 | Cat#302015 | |
| APC-CD43 | BD 生物科学 | Cat# 560198 | |
| APC-CD45 | BD 生物科学 | Cat# 555485 | |
| APC-GPC3 | BD 生物科学 | Cat#DB100B | |
| APC-NKG2D | BD 生物科学 | Cat# 558071 | |
| CellEvent Caspase-3/7 绿色检测试剂 | 赛默飞世尔科技 | Cat#C10423 | |
| CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | Cat#C34571 | 细胞示踪荧光染料 |
| CryoStor 溶液 | 干细胞科技公司 | https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html | 冷冻保存培养基 |
| CTS NK Xpander | 吉布科 | A5019001 | |
| CTS NK-Xpander 培养基 | 生命技术公司 | Cat#A5019001 | |
| DMEM | 吉布科 | 11965084 | |
| DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂，丙酮酸钠 | 吉布科 | 10569010 | |
| EasySep 人 NK 细胞富集试剂盒 | 干细胞科技公司 | Cat#19055 | |
| 乙醇胺 | 西格玛奥德里奇 | E9508 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | Cat# 10437010 | |
| 荧光素异硫氰酸酯-CD94 | BD 生物科学 | Cat#555888 | |
| GlutaMAX 补充剂 | 吉布科 | 35050061 | |
| GolgiPlug | BD 生物科学 | Cat#555029 | |
| GolgiStop | BD 生物科学 | Cat#554724 | |
| Ham's F-12 营养混合物，含 GlutaMAX 补充剂 | 吉布科 | 31765035 | |
| 马血清 | 赛默飞世尔科技 | Cat#16050130 | |
| 人血清 | AB 西格玛奥德里奇 | Cat#BP2525100 | |
| 人干细胞 Nucleofector™ 试剂盒 | 龙沙 | Cat# VPH-5012 | |
| 人：HePG2 细胞 | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | Cat#HB-8065 | |
| 人：HePG2-td-tomato-luc 细胞 | Dan S. Kaufman 实验室 | N/A | |
| 人：iPS 细胞 | Dan S. Kaufman 实验室 | N/A | |
| 人：SNU-449 细胞 | ATCC | Cat#CRL-2234 | |
| 人：SNU-449-td-tomato-luc 细胞 | Dan S. Kaufman 实验室 | N/A | |
| IncuCyte Caspase-3/7 绿色凋亡检测试剂盒 | Essen Bioscience | Cat#4440 | |
| L-抗坏血酸 | 西格玛奥德里奇 | A5960 | |
| MP 生物医学 人血清，AB 型 | MP 生物医学 | ICN2938249 | |
| mTeSR plus | 干细胞科技公司 | 100-0276 | |
| NovoExpress 软件 | ACEA 生物科学 | https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805 | |
| PE/Cy7 抗人 SSEA-4 抗体 | Biolegend | 330420 | |
| PE-CD16 | BD 生物科学 | Cat#560995 | |
| PE-CD226 | BD 生物科学 | Cat#559789 | |
| PE-CD34 | BD 生物科学 | Cat# 555822 | |
| PE-CD45 | BD 生物科学 | Cat# 555483 | |
| PE-CD94 | BD 生物科学 | Cat#555888 | |
| PE-cy7-CD56 | BioLegend | Cat# 318318 | |
| PE-FAS 配体 | BD 生物科学 | Cat#564261 | |
| PE-NKp30 | BD 生物科学 | Cat# 558407 | |
| PE-NKp44 | BD 生物科学 | Cat#558563 | |
| PE-NKp46 | BD 生物科学 | Cat#331908 | |
| PE-NKp46 | BD 生物科学 | Cat#557991 | |
| 外周血血沉棕黄层 | 圣迭戈血库（https://www. sandiegobloodbank.org/） | N/A | |
| PE-TRAIL | BD 生物科学 | Cat#565499 | |
| pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO | Branden Moriarity 实验室 | N/A | |
| pMAX-GFP 质粒 | 龙沙 | N/A | GFP 阳性对照 |
| Prism 9 | Graphpad | 版本 9 | |
| pSpCas9 | 金斯瑞 | PX165 | |
| RBC 裂解缓冲液（10×） | Biolegend | Cat#420301 | |
| 重组人 bFGF 基础型 | R&D 系统 | Cat#4114-TC | |
| 重组人 BMP-4 | 百肽生物科技 | Cat#120-05 | |
| 重组人 FLT-3 配体 | 百肽生物科技 | Cat# 300-19 | |
| 重组人 IL-15 | 百肽生物科技 | Cat# 200-15 | |
| 重组人 IL-2 | 百肽生物科技 | Cat# 200-02 | |
| 重组人 IL-3 | 百肽生物科技 | Cat#200-03 | |
| 重组人 IL-7 | 百肽生物科技 | Cat# 200-07 | |
| 重组人 Nodal 蛋白 | R&D 系统 | Cat#3218-ND-025 | |
| 重组人 SCF | 百肽生物科技 | Cat# 300-07 | |
| 重组人 TGF-β1 | 百肽生物科技 | Cat#100-21 | |
| 重组人 VEGF | 百肽生物科技 | Cat# 100-20 | |
| RPMI1640 | 吉布科 | 11875093 | |
| 亚硒酸钠 | 西格玛奥德里奇 | 214485 | |
| STEMdiff APEL 2 培养基 | 干细胞科技公司 | 5270 | 拟胚体形成培养基 |
| STEMdiff APEL2 培养基 | 干细胞科技公司 | Cat#05270 | |
| 超级 piggyBac 转座酶表达载体 | SBI | Cat#PB210PA-1 | |
| SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | S10274, S10349 | 死细胞染色溶液试剂盒 |
| β-巯基乙醇 | 吉布科 | 21985023 |
参考文献
- Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. J Clin Invest. 132 (6), e143762(2022).
- Yu, Y. The function of NK cells in tumor metastasis and NK cell-based immunotherapy. Cancers (Basel). 15 (8), 23....
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