开发一种用于研究缺氧耐受性的甘蓝原生质体系统 芸薹属

摘要

本方案描述了一种高效的甘蓝叶肉原生质体系统。通过测试多种缺氧处理条件，该系统表现出低氧响应基因的高水平激活，有助于研究植物对淹水胁迫耐受性的遗传与分子机制 十字花科 蔬菜

摘要

随着气候变化导致强降雨增多，白菜作为一种重要作物 十字花科 蔬菜，由于洪水引发的低氧胁迫，面临严重的产量损失。为揭示甘蓝类蔬菜耐涝性的分子机制，亟需建立一种多功能的遗传功能研究平台，以克服甘蓝类植物难以转化的特性。本研究建立了一种甘蓝原生质体瞬时表达系统及相应的原生质体低氧诱导方案。该方案通过优化酶解条件，实现了从甘蓝叶片中高效分离高产量、高完整性的原生质体，转染效率超过40%。为减轻处理前可能存在的低氧影响，使用氧气气体对W5溶液进行鼓泡，以提高溶解氧水平。测试了多种调节氧浓度的化学试剂及生理学除氧处理方法，包括EC-Oxyrase、OxyFluor、亚硫酸钠和氧吸收剂包。双荧光素酶检测结果显示，厌氧呼吸响应基因的启动子 BoADH1 和 BoSUS1L 在低氧处理后，卷心菜原生质体中的基因被激活，其中以氧气吸收剂处理后的诱导水平最高。综上所述，卷心菜原生质体瞬时表达系统结合低氧处理，展现出一种高效且便捷的研究平台，可用于卷心菜低氧响应相关基因功能及分子机制的研究。

引言

全球气候变化加剧了洪涝灾害，使其成为全球范围内日益严峻的问题。近几十年来，洪涝事件的发生频率呈上升趋势，导致农作物大量减产^1,2。甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）是一种具有重要全球意义的蔬菜作物，易受强降雨不利影响，因此有必要培育耐涝甘蓝品种，以确保极端天气条件下生产的可持续性。因此，深入了解甘蓝响应洪涝胁迫的分子机制对于应对这一挑战至关重要。

为了理解植物在淹水条件下基因调控的机制，转基因品系被广泛用于基因功能研究。然而，该方法受限于高昂的成本、耗时的转化与继代培养过程，以及许多作物物种中较低的转化效率，因此需要开发替代性方法。基于原生质体的瞬时表达系统作为一种灵活且高效的替代方案，已在植物分子研究中得到广泛应用。这些系统有助于研究启动子活性、响应环境信号的信号通路、蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用，以及蛋白质的亚细胞定位³。原生质体瞬时表达系统的建立不仅已在模式植物中报道^4,5，也在甘蔗⁶、香石竹⁷、Pha....

方案

本研究使用了两种 commercially available 的卷心菜（B. oleracea var. capitata）品种：‘Fuyudori’ 和 ‘228’。图1 展示了实验方案的工作流程示意图。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 甘蓝幼苗的准备

1. 使用商业植物基质将‘Fuyudori’和‘228’白菜种子播种于48孔穴盘（长49 cm × 宽28 cm × 高5 cm）的圆形方孔（直径4.5 cm × 深4.5 cm）中。将种子埋入培养基质中，深度约为1 cm。
2. 在22 °C条件下，于人工气候室中培养白菜幼苗，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。光照期间维持光照强度为100 µmol m^-2·s^-1（使用白色荧光灯管）。
3. 生长2–3周后，选取处于两叶期的白菜幼苗用于后续的叶肉原生质体分离。
   注意：建议选用两叶期的白菜幼苗，即第二片真叶已完全展开，而第三片真叶尚未展开且长度短于1 cm（图2A）。为使白菜幼苗的发育阶段保持同步，由于‘Fuyudori’与‘228’的生长速度不同，需提前约2天播种‘Fuyudo....

结果

本研究成功开发了一种利用卷心菜原生质体的瞬时表达系统（参见 图1 用于工作流程）。从生长2至3周、大小适宜的甘蓝真叶中分离原生质体（图2A）从商品甘蓝品种‘Fuyudori’和‘228’中利用纤维素酶/离析酶消化及暗处真空浸润法获取图2B, C）。为了减轻原生质体在孵育期间因浸没而经历的缺氧条件，使用连接至氧气机的气石曝气装置对 W5 溶液进行氧合（图2D）。该过程使 W5 溶液中的溶解氧浓度显著升高，从 7.84 mg·L^-1 ± 0.05 mg·L^-1 至 29.18 mg·L^-1 ± 0.43 mg·L^-1 氧气鼓泡5分钟后。原生质体分离完成后，得率为1.04 × 10⁷ 对于“Fuyudori”为 4.00 x 10⁶ 原生质体·.......

讨论

本方案介绍了一种从两种商用甘蓝品种中分离原生质体的简化方法。该方法的有效性主要通过两个关键的质量控制参数进行评估：有活力原生质体的产量和原生质体转染效率。采用本方案后，原生质体产量超过4.00 × 10⁶ 原生质体·克⁻¹·两种甘蓝品种的叶肉组织鲜重（FW）图 2E，F）。该产量与其他物种中报道的结果相当，包括茄子、康乃馨、甘蔗和 油茶（Camellia oleifera），其中原生质体产量范围为 2.5 x 10⁶ 至 1.4 × 10⁷ 原生质体·克⁻¹·FW^6,7,9,17这些结果表明，该方案在不同遗传背景下具有潜在的适用性 B. oleracea

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)	PhytoTech Labs	M825	用于酶溶液配制
228 粒卷心菜种子	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL 圆锥形离心管	SPL Life Sciences	50050	用于酶溶液配制
6 孔细胞培养板	Alpha Plus	16106	用于原生质体孵育
70 μm 细胞筛	Sorfa	SCS701	用于原生质体过滤
9 cm 培养皿	Alpha Plus	16001	用于酶解消化
厌氧罐	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	用于低氧处理
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	用于 W5 溶液配制及培养板包被
氯化钙	J.T.Baker	131301	用于 W5 溶液和 PEG 溶液配制
纤维素酶 R10	Yakult		用于酶溶液配制
干燥器	Tarsons	402030	用于真空渗透
D-葡萄糖	Bioshop	GLU501	用于 W5 溶液配制
溶解氧测定仪	Thermo Scientific	Orion Star A223	用于氧气浓度测定
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M1902	用于酶溶液、PEG 溶液和 MMG 溶液配制
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1960	用于双荧光素酶报告基因检测
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	用于低氧处理
富誉斗利卷心菜种子	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
高速冷冻离心机	Hitachi	CR21GIII	用于原生质体收集
离析酶 R10	Yakult		用于酶溶液配制
氯化镁	Alfa Aesar	12315	用于 MMG 溶液配制
微量离心机	Hitachi	CT15RE	用于原生质体收集
微孔板	Greiner	655075	用于双荧光素酶报告基因检测
微孔板读数仪	Molecular Devices	SpectraMax Mini	用于双荧光素酶报告基因检测
Millex 0.22 μm 注射式滤器	Merck	SLGP033RS	用于酶溶液配制
无油真空泵	Rocker	Rocker 300	用于真空渗透
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	用于低氧处理
氧气吸收剂包	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	用于低氧处理
氧气浓缩器	UTMOST PERFECT	AII-X	用于 W5 溶液中通氧
植物培养基质	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	用于卷心菜幼苗制备
质粒大提试剂盒	QIAGEN	12145	用于转染级质粒 DNA 的纯化
聚乙二醇 4000	Fluka	81240	用于原生质体转染
氯化钾	J.T.Baker	304001	用于 W5 溶液配制
剃须刀片	Gillette		用于卷心菜叶片条制备
氯化钠	Bioshop	SOD002	用于 W5 溶液配制
亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	S0505	用于低氧处理
水浴锅	Yihder	BU-240D	用于酶溶液配制