用于研究芸苔属植物耐缺氧性的卷心菜原生质体系统的开发

摘要

该协议描述了一种高效的卷心菜叶肉原生质体系统。测试了各种缺氧处理，该系统显示缺氧反应基因的高度激活，有助于研究 十字花科 蔬菜耐洪的遗传和分子机制。

摘要

随着气候变化带来更多的强降雨，卷心菜作为十字 花科 的主要蔬菜，由于洪水引起的缺氧胁迫而面临重大的产量损失。为了确定卷心菜耐洪的机制，需要一个多功能的遗传功能研究平台来克服卷心菜的转化顽固性。在本研究中，开发了卷心菜原生质体瞬时表达系统和相应的原生质体缺氧诱导方案。该方案实现了从卷心菜叶中分离原生质体的高产量和完整性，使用优化的酶条件，转染效率超过 40%。为了减轻治疗前潜在的缺氧影响，W5 溶液用氧气鼓泡以提高溶解氧水平。测试了几种用于调节氧水平和生理除氧处理的化学品，包括 EC-Oxyrase、OxyFluor、亚硫酸钠和脱氧剂包。双荧光素酶测定显示，缺氧处理后，甘蓝原生质体中厌氧呼吸反应基因 BoADH1 和 BoSUS1L 的启动子被激活，用脱氧剂包处理后观察到最高的诱导水平。综上所述，卷心菜原生质体瞬时表达系统结合缺氧处理展示了一种高效便捷的平台。该平台可以促进对卷心菜中缺氧反应相关的基因功能和分子机制的研究。

引言

全球气候变化加剧了洪水，而洪水已成为全球日益严重的问题。近几十年来，洪水事件的频率呈上升趋势，导致农作物遭受重大损失 ^1,2。卷心菜 （Brassica oleracea var. capitata L.） 是一种具有全球重要性的蔬菜，容易受到强降雨的不利影响，因此需要开发耐洪的卷心菜品种，以确保在面对极端天气事件时的可持续生产。因此，了解与卷心菜洪水胁迫相关的分子机制对于应对这一挑战至关重要。

为了了解埋伏条件下植物的基因调控机制，转基因品系被广泛用于遗传功能研究。然而，这种方法受到高成本、时间密集型转化和传代培养过程以及许多作物物种转化效率低的限制，因此需要开发替代方法。基于原生质体的瞬时表达系统已作为一种多功能且高效的替代方案广泛应用于植物分子研究。这些系统有助于研究启动子活性、响应环境线索的信号通路、蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA 相互作用以及亚细胞定位³。原生质体瞬时表达系统的建立不仅在模式植物 ^4,5 中也有报道，而且在具有重要经济意义的作物中也有报道，如甘蔗⁶、康乃馨⁷、蝴蝶兰 ⁸ 和茄子⁹。此外，这些系统已在木本植物中成功实施，包括 Camellia oleifera¹⁰和 Populus trichocarpa¹¹。然而，在淹没诱导的缺氧应激下应用原生质体系统研究叶菜的方案是有限的。因此，本研究为那些有兴趣使用卷心菜原生质体瞬时表达系统研究叶菜中缺氧反应的人开发了一种综合方案。

为了在细胞水平上执行浸没诱导的缺氧反应，在以前的研究中采用了几种除氧方法来模拟缺氧环境。这些包括使用 EC-Oxyrase、OxyFluor、亚硫酸钠和耗氧袋。EC-Oxyrase 通常用于人细胞系¹² 和拟南芥原生质体¹³ 中的厌氧处理。已发现 OxyFluor 可有效减轻活细胞荧光成像过程中活性氧引起的光漂白^14,15。亚硫酸钠已用于线虫的厌氧处理¹⁶，最近还用于水稻原生质体，与染色质免疫沉淀 （ChIP） 测定¹⁷ 等技术结合使用。主要用于厌氧细菌培养的脱氧剂包¹⁸也已证明在厌氧条件下诱导玉米原生质体中ZmPORB1启动子的激活¹⁹。

目前的工作旨在为卷心菜原生质体分离和瞬时表达建立稳健的管道。随后，通过使用双荧光素酶测定评估厌氧反应基因的启动子活性来评估各种氧调节治疗的疗效。本研究中开发的方案有望对未来与 Brassica 系统中的淹没或缺氧应激相关的研究具有价值。

方案

本研究使用了两个商业卷心菜 （B. oleracea var. capitata） 品种:'Fuyudori' 和 '228'。方案工作流程的图形表示如图 1 所示。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 卷心菜幼苗的制备

1. 使用商业植物基质将"Fuyudori"和"228"卷心菜种子播种到 48 孔插盘（长 49 厘米 x 宽 28 厘米 x 高 5 厘米）的圆形方形孔（深 4.5 厘米 x 高 4.5 厘米）中。将种子嵌入生长介质中约 1 厘米深。
2. 在 22 °C 的生长室中以 16/8 小时的明暗循环培养卷心菜幼苗。在光相期间保持 100 μmol m ^-2 ·s ^-1 （白色荧光灯管） 的光强度。
3. 生长 2-3 周后，使用 2 叶期的卷心菜幼苗进一步分离叶肉原生质体。
   注意:卷心菜幼苗的建议大小为 2 叶阶段，其中第二个真叶完全展开，但第三个真叶未展开，其长度短于 1 厘米（图 2A）。为了同步卷心菜幼苗的发育阶段，由于生长速度不同，"冬鸟"种子需要比"228"种子早播种大约 2 天。这种调整确保了卷心菜植株在所需阶段的均匀生长和成熟。

2. 卷心菜原生质体分离

1. 在每次原生质体分离之前准备 12.5 mL 酶溶液（表 1）。
   1. 用 10 mM MES （pH 5.7） 和 0.6 M 甘露醇在 55 °C 下预热溶液。 加入 1.5% 纤维素酶 R10 和 0.75% Macerozyme R10 后，继续在 55 °C 下加热溶液 10 分钟。
   2. 酶溶液冷却至室温 （25 °C） 后，加入 10 mM CaCl₂ 和 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA）。使用 0.22 μm 注射器过滤器将制备的酶溶液过滤到 9 cm 培养皿中消毒。
      注:溶液预热会增加酶的溶解度并使蛋白酶失活。消化效果因纤维素酶的不同类型而异。纤维素酶 R10 和 Macerozyme R10 的组合适用于卷心菜原生质体分离。
2. 从 5 到 8 棵卷心菜幼苗中收集第二片新扩展的真叶，并使用锋利的剃须刀片将它们切成 0.5-1.0 毫米的条状。立即将叶条转移到新鲜制备的酶溶液中。
   注意:在适当的阶段从卷心菜中选择健康和指定的叶子是至关重要的。来自 2 叶期卷心菜幼苗的第二个新扩展的真叶提供了最高的原生质体分离效率。不建议将过度成熟的植物、子叶或老化的叶子用于原生质体分离。5 到 12 片扩增良好的真叶可以在 12.5 mL 的酶溶液中成功产生卷心菜原生质体。原生质体分离所需的叶子数量取决于所需的原生质体数量。通常，从 5 到 8 片叶子中获得的原生质体足以用于后续的实验程序。
3. 在黑暗中真空渗透 30 分钟后（图 2B），将卷心菜叶条在室温下在黑暗中浸入酶溶液（图 2C）中再放置 4-16 小时。
   注意:酶消化时间可能因卷心菜品种而异，应根据特定基因型进行优化。例如，由于 "Fuyudori" 的叶子较厚，因此与 "228"（4 小时）相比，"Fuyudori"需要更长的消化时间（16 小时）。
4. 用等体积的 W5 溶液稀释含原生质体的溶液，该溶液由 2 mM MES （pH 5.7）、154 mM NaCl、125 mM CaCl₂、5 mM KCl 和 5 mM 葡萄糖组成，以停止酶消化。
5. 通过轻轻旋转或使用轨道摇床释放原生质体悬浮液。通过 70 μm 细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 锥形管中。
   注:分离的原生质体能够通过 70 μm 细胞过滤器，而未消化的植物碎片被过滤器保留，随后从悬浮液中去除。细胞过滤器可以重复使用，并在洗涤后保存在 75% 乙醇中，但必须在使用前用 W5 溶液充分冲洗细胞过滤器以去除残留的乙醇。
6. 将原生质体溶液在 4 °C 下用 150 x g 离心 2 分钟，然后小心地除去上清液。沿锥形管壁以大约 1 mL·s ^-1 的流速加入 10 mL 的 W5 溶液，轻轻洗涤沉淀的原生质体。在 4 °C 下以 150 x g 离心管 2 分钟，然后再次重复此洗涤程序以确保完全去除酶溶液。
7. 将原生质体重悬于 W5 溶液中，并将它们置于冰上 30 分钟。冰孵育后，用移液管一次 1 mL 去除上清液，直到去除所有上清液。
8. 将原生质体重悬于由 4 mM MES （pH 5.7）、0.4 M 甘露醇和 15 mM MgCl₂ 组成的冰预冷 MMG 溶液中（制备见 表 1 ）。
9. 用血细胞计数器测量原生质体浓度，并使用 MMG 溶液将最终浓度调节为 4 x 10⁵ 原生质体·^mL-1 。

3. 原生质体转染

1. 将总体积为 10 μL 质粒 （5-10 μg）（补充文件 1）与 100 μL 原生质体（4 x 10⁴ 原生质体）混合，置于冰上 10 分钟。
   注:对于转染级质粒纯化，按照制造商的说明使用市售的质粒试剂盒。大约 4 x 10⁴ 原生质体通常用于双荧光素酶报告基因测定。对于更大规模的实验，有更大量的原生质体可用于转染。具体而言，用 10 μg 质粒转染约 2 x 10⁵ 个原生质体的转染效率为 30% 至 40%。
2. 将等体积 （110 μL） 的新鲜制备的 PEG 溶液（制备见 表 1 ）加入原生质体溶液中 4000 （PEG4000）、0.1 M CaCl₂ 和 0.2 M 甘露醇，并轻轻混合。
3. 将原生质体混合物在室温下避光孵育 10 分钟，然后加入 440 μL W5 溶液终止反应。
4. 将转染的原生质体在 4 °C 下以 150 x g 离心 2 分钟，然后将沉淀重悬于 750 μL 富氧 W5 溶液中。将重悬的原生质体转移到预涂有 1% BSA 的 6 孔组织培养板中。
   注意:用于细胞孵育的 W5 溶液必须使用连接到气石的制氧机（~90% 氧气）与氧气一起鼓泡 5 分钟（图 2D）。在此氧化过程之后，W5溶液中的最终溶解氧浓度从7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 至 29.18 mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1，用溶解氧仪测量。用于重悬转染原生质体的 W5 溶液的体积取决于所使用的组织细胞培养板的类型。对于 12 孔或 24 孔细胞培养板，建议减少 W5 溶液的体积，以减轻孵育过程中由于孔内深度较深而导致的缺氧应激。对于 BSA 涂层，培养板的每个孔接受 1 mL 1% BSA 溶液，使其包被孔 10 秒。然后从每个孔中丢弃 BSA 溶液，随后用 W5 溶液重新填充孔。该程序旨在使用 BSA 创建一个临时的非粘附表面，有效防止原生质体在后续实验步骤中粘附在培养板的塑料表面。

4. 卷心菜原生质体的缺氧处理

1. 原生质体转染后立即进行化学或物理诱导的缺氧处理。
   注:建议在原生质体转染后立即进行缺氧处理。原生质体的长时间孵育可能会减少随后的缺氧反应。
   1. 对于卷心菜原生质体上的化学诱导缺氧，将 OxyFluor、EC-Oxyrase 和亚硫酸钠添加到 W5 原生质体溶液中。
      注:在 W5 中使用 0.6 单位·^mL-1 EC-氧氧酶、0.6 单位·^mL-1 氧氟和1 g·^mL-1 亚硫酸钠是能够诱导 BoADH1 和 BoSUS1L 启动子（图 3A）的测试条件，对两种检查的卷心菜品种的原生质体完整性损害低。
   2. 对于耗氧袋诱导的缺氧，将两个脱氧剂包放入 3.5 L 厌氧罐中，以创造缺氧环境。
2. 通过在 4 °C 下以 150 x g 离心 2 分钟来收获缺氧处理的原生质体。 使用液氮冷冻收集的原生质体，并将其储存在 -80 °C 冰箱中用于后续测定。

5. 双荧光素酶测定

1. 根据制造商的说明进行双荧光素酶报告基因测定，并稍作修改。
   1. 将卷心菜原生质体重悬于 50 μL 的 1x 被动裂解缓冲液中并涡旋 10 秒。
   2. 将破坏的原生质体在冰上孵育 10 分钟，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 10 分钟后收集上清液。
   3. 向微孔板的每个孔中加入 20 μL 细胞裂解物。将 100 μL 荧光素酶检测试剂 II 分配到孔中，并使用酶标仪测量萤火虫荧光素酶活性。
   4. 向每个孔中加入 100 μL 市售检测试剂，并使用酶标仪测量海肾荧光素酶活性。

结果

这项工作成功地开发了一种利用卷心菜原生质体的瞬时表达系统（工作流程见图 1）。使用纤维素酶/macerozyme 消化和黑暗真空浸润（图 2B、C），从商业卷心菜品种 'Fuyudori' 和 '228' 的 2 至 3 周龄卷心菜真叶中分离出适当大小的原生质体（图 2A）。为了减轻浸没原生质体在孵育过程中经历的缺氧条件，使用连接到制氧机的气石起泡器对 W5 溶液进行充氧（图 2D）。该过程显著提高了W5溶液中的溶解氧浓度，从7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 至 29.18 mg·^L-1 ± 0.43 mg·氧气鼓泡 5 分钟后 ^L-1。分离过程后，过夜消化期后，'Fuyudori' 的原生质体产量为 1.04 x 10⁷，'228' 的原生质体产量为 4.00 x 10⁶ 原生质体·g⁻¹ 鲜重（图 2E）。随后，使用 GFP 作为报告基因来评估 PEG 介导的转染方法的转化效率，证明两个品种在卷心菜中的原生质体转染效率均高于 40%（图 2F），从而证实了该系统的活力。

此外，将卷心菜厌氧呼吸反应基因 BoADH1p::Luc 和 BoSUS1Lp::Luc 载体的启动子构建体（图 3A）作为报告基因引入卷心菜原生质体中，以评估几种处理的缺氧诱导作用。各种氧调节处理也应用于该瞬时表达模型系统。结果表明，除亚硫酸钠外，所有除氧处理都成功地诱导了卷心菜原生质体的缺氧反应（图 3B）。具体来说，在用 EC-Oxyrase 和 OxyFluor 处理后， BoADH1 的启动子活性分别比对照高出约 2.6 倍和 3.2 倍，值得注意的是，在脱氧剂包处理后，启动子活性增加了约 7.0 倍以上（图 3B）。同样，EC-Oxyrase 和 OxyFluor 处理的 BoSUS1L 启动子活性分别提高了约 1.7 倍和 1.8 倍，而脱氧剂包处理诱导的活性显着增加超过 5.6 倍（图 3B）。这些结果表明，脱氧剂包在该卷心菜原生质体实验系统中在创造低氧环境方面表现出卓越的功效。

图 1:原生质体分离工作流程的图形表示。 该图说明了从卷心菜叶组织中分离原生质体所涉及的分步过程。工作流程以可视化方式描述，以便清楚地了解该过程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:从卷心菜的叶组织中分离原生质体。 （A） 显示了商业卷心菜品种 'Fuyudori' 和 '228' 在推荐生长阶段的外观。选择 2 叶阶段卷心菜的第二个新完全展开的真叶 （由箭头表示） 用于原生质体分离。比例尺:2 厘米。（B） 真空泵和干燥器用于卷心菜叶条的真空渗透过程，在酶消化前进行 30 分钟的渗透。（C） 描述了酶消化过程中卷心菜叶条的状况。叶组织的完全消化总共需要 4-16 小时。比例尺:3 厘米。（D） 照片显示了使用连接到气石的制氧机来提高 W5 溶液中的溶解氧浓度。比例尺:5 厘米。（E） 从"Fuyudori"和"228"卷心菜品种中获得每克鲜重 （FW） 超过 4.00 x 10⁶ 个叶肉原生质体，并在显微镜下观察。比例尺:200 μm。（F） 使用组成型表达的 GFP 报告基因，来自两种卷心菜基因型的原生质体的转染效率显示高于 40%。比例尺:200 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:卷心菜原生质体在缺氧条件下的缺氧反应。 （A） 缺氧反应基因构建体 BoADH1 和 BoSUS1L 启动子用作报告基因，以评估 'Fuyudori' 卷心菜原生质体中的缺氧反应。（B） 将总共 5 μg 报告质粒转染到"Fuyudori"卷心菜原生质体中，将其在氧气气泡 W5 溶液中孵育，然后暴露于缺氧处理 4 小时。在孵育过程中，通过在 W5 溶液中加入 EC-氧合酶 （0.6 units·^mL-1）、OxyFluor （0.6 units·^mL-1） 和亚硫酸钠 （1 g·^mL-1） 来降低氧水平。脱氧剂包处理是通过将两个脱氧袋放入 3.5 L 厌氧罐中进行的。"CK"组代表未进行任何缺氧治疗的对照组。处理后，收获原生质体用于双重荧光素酶测定。每个值表示 SD ±平均值，其中 n = 4。不同的字母表示基于 LSD 事后检验的单因素方差分析的显著差异 （P < 0.05）。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:酶溶液、W5 溶液和 MMG 溶液的制备。请点击此处下载此表格。

补充文件 1:原生质体转染的质粒详细信息。请点击此处下载此文件。

讨论

该方案提出了一种从两个商业卷心菜品种中分离原生质体的简化方法。该方法的有效性主要通过两个关键的质量控制参数来评估:活原生质体的产量和原生质体转染的效率。实施该方案导致产量超过 4.00 x 10⁶ 个原生质体·g⁻¹·来自两个卷心菜品种的叶肉组织的 FW（图 2E，F）。该产量与其他物种报道的产量相当，包括茄子、康乃馨、甘蔗和油茶花，其中原生质体产量在 2.5 x 10⁶ 至 1.4 x 10⁷ 原生质体·g⁻¹·FW 6,7,9,17。这些结果表明该方案在油菜 B. leuracea 的不同遗传背景中具有潜在适用性。

该协议的成功取决于几个关键因素。最重要的是在适当的生长阶段利用健康卷心菜幼苗的指定叶子（图 2A）。使用较旧或不健康的植物可能会导致原生质体质量差。将叶组织小心地切成 0.5-1.0 毫米的条状，并避免用钝刀片压碎也很重要。持续 4-16 小时的酶消化过程是另一个关键步骤。短于 4 小时的消化时间可能导致消化不完全，而超过 16 小时的消化时间则存在细胞应激风险。值得注意的是，叶子较厚的基因型，例如 'Fuyudori'，可能受益于延长的消化时间以最大限度地提高原生质体产量。相比之下，'228' 只需 4 小时即可完全消化。此外，较宽的消解时间范围可以为实验计划提供更大的灵活性。例如，4 小时消化允许在一天内完成原生质体分离和随后的瞬时测定。相反，16 小时的消化允许在晚上开始酶消化，并能够在第二天完成后续步骤，这可以提高应用该方案时的便利性。此外，由于原生质体的脆弱性和对机械应力的敏感性，在整个原生质体分离过程中轻柔地处理原生质体至关重要。

为了模拟代表洪水压力的厌氧条件，该协议利用常见的除氧剂和耗氧袋来创造缺氧环境。为了提高系统的有效性，采用氧气机对 W5 溶液进行充氧（图 2D），旨在减少卷心菜原生质体在处理前潜伏期内的背景缺氧反应信号。5 min 的氧合过程使溶氧水平从 7.84 mg·^L-1 ± 0.05 mg·^L-1 至 29.18 mg·^L-1 ± 0.43 mg·^L-1，表明在缓解缺氧状况方面具有显着效果。在本研究中使用的除氧方法中，脱氧剂包表现出优异的性能，在两个厌氧反应核心基因中诱导最高的启动子活性（图 3）。此外，该方法还提供了可扩展性的额外优势，允许通过在单个厌氧罐中使用耗氧袋同时处理多个样品，而不是在每个细胞培养板上单独施用除氧剂。总之，脱氧剂包提供了一个方便有效的平台，适用于评估卷心菜原生质体在缺氧条件下的反应。

虽然该方案展示了几个优点，但重要的是要承认其局限性，特别是卷心菜原生质体相对适中的转染效率。尽管该效率未达到拟 南芥⁵ 报告的 90%，但仍证明它仍然足以成功进行后续启动子活性研究（图 3），表明该系统中功能分析具有巨大潜力。

鉴于卷心菜作为主要蔬菜作物的全球重要性，将该方案与缺氧处理和遗传分析技术相结合有望进一步了解洪水条件下卷心菜的调节机制。这些见解可能会加速耐洪卷心菜品种的开发，满足面对极端天气和不断增加的洪水事件的关键需求。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-（N-吗啉代）乙磺酸 （MES）	PhytoTech Labs	M825	用于酶溶液制备
228 颗卷心菜种子	Takii & Co.， Ltd. （日本京都）
50 mL 锥形管	SPL Life Sciences	50050	用于酶溶液制备
6 孔组织培养板	Alpha Plus	16106	用于原生质体孵育
70 &亩;m 细胞过滤器	Sorfa	SCS701	用于原生质体过滤
9 厘米培养皿	Alpha Plus	16001	用于酶消化
厌氧罐	HIMEDIA	厌氧罐 3.5 L	用于缺氧治疗
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	用于 W5 溶液制备和培养板包被
氯化钙	J.T.Baker	131301	用于 W5 溶液和 PEG 溶液制备
纤维素酶 R10	养乐多		用于酶溶液制备
干燥器	Tarsons	402030	用于真空浸润
D-Glucose	Bioshop	GLU501	用于 W5 溶液制备
溶解氧仪	Thermo Scientific	Orion Star A223	用于氧测量
D-甘露醇	Sigma-Aldrich	M1902	用于酶溶液、PEG 溶液和 MMG 溶液制备
双荧光素酶报告基因检测系统	Promega	E1960	用于双荧光素酶报告基因测定
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	用于缺氧处理
Fuyudori 卷心菜种子	Kobayashi Seed Co.， Ltd. （日本加古川市）
高速冷冻离心机	Hitachi	CR21GIII	用于原生质体收获
Macerozyme R10	养乐多		用于酶溶液制备
氯化镁	Alfa Aesar	12315	用于 MMG 溶液制备
微量离心机	Hitachi	CT15RE	用于原生质体收获
微孔板	Greiner	655075	用于双荧光素酶报告基因测定
酶标仪 Molecular	Devices	SpectraMax Mini	用于双荧光素酶报告基因测定
Millex 0.22 μm 针式过滤器	Merck	SLGP033RS	用于酶溶液制备
无油真空泵	摇臂	Rocker 300	用于真空渗透
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	用于缺氧处理
脱氧剂包	三菱瓦斯化学公司	AnaeroPack， MGCC1	用于缺氧处理
制氧机	UTMOST PERFECT	AII-X	用于 W5 溶液中的氧气鼓泡
植物基质	Klasmann-Deilmann	Potgrond H 基质	用于卷心菜幼苗制备
粒中型试剂盒	QIAGEN	12145	用于纯化转染级质粒 DNA
聚乙二醇 4000	Fluka	81240	用于原生质体转染
氯化钾	J.T.Baker	304001	用于 W5 溶液制备
剃须刀片	吉列		用于卷心菜叶条制备
氯化钠	Bioshop	SOD002	用于 W5 溶液制备
亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	S0505	用于缺氧处理
水浴	Yihder	BU-240D	用于酶溶液制备