在单受试者水平上利用2-脱氧-2-[18F]氟-D-葡萄糖动态正电子发射断层扫描研究脑代谢连接性

摘要

获取动态正电子发射断层扫描（PET）数据并将其重建为时间帧，可实现单个受试者水平的脑代谢连接性分析。本文描述了一种获取大鼠脑部[¹⁸F]FDG动态PET数据的方法，并通过提取感兴趣区域的时间-放射性活度曲线来获得连接性矩阵。

摘要

迄今为止，代谢性脑连接主要通过采集多个受试者的静态正电子发射断层扫描（PET）数据，在群体水平上进行研究。我们研究团队目前正在大鼠个体水平上，研究脑内出血后多个时间点的代谢连接变化。为了探究个体内的代谢性脑连接，需要获取示踪剂在不同脑区摄取的时间动态信息，这可以通过动态PET实现。本文中，我们详细描述了数据采集与分析的实验方案。

使用2-脱氧-2-[¹⁸F]氟-D-葡萄糖（[¹⁸F]FDG）作为示踪剂，在专用的临床前PET系统上获取大鼠脑部的动态PET数据。示踪剂在PET扫描开始时通过静脉注射给予。在60分钟的采集过程中，动物使用美托咪啶进行镇静。

采集后，采用迭代重建算法（最大似然期望最大化）将PET数据重建为三十个2分钟的时间帧。使用包含多个感兴趣区（VOI）的分区图谱提取每个VOI的时间-活度曲线，然后计算每对VOI之间的皮尔逊相关系数。

这种动态PET方案能够评估两次单次扫描之间的代谢连接性差异，而非多组扫描之间的差异。该方法可用于研究单个受试者在不同时间点的代谢连接性变化，或将其个体的代谢连接性与正常数据库进行比较。此类比较可能有助于追踪疾病进展，或辅助诊断由脑区间通信中断所导致的神经系统疾病，例如癫痫或痴呆。

引言

正电子发射断层扫描（PET）是一种分子成像技术，广泛应用于科研和临床领域。随着多种PET示踪剂的开发，PET可用于研究疾病的病理生理学过程，并监测疾病进展及对治疗的反应¹。其中应用最广泛的放射性示踪剂之一是2-脱氧-2-[¹⁸F]氟-D-葡萄糖（[¹⁸F]FDG），它能够成像葡萄糖代谢情况，反映细胞活性。该示踪剂在肿瘤学中用于疾病的诊断、分期和预后评估；在神经病学中常用于痴呆等神经退行性疾病的研究；在心脏病学中则可用于结节病等疾病的诊断，仅举几例说明^1,2,3。

通过[¹⁸F]FDG PET数据获得的脑代谢连接性评估，指的是不同脑区示踪剂摄取之间的功能关系。该方法通过选取一组脑区，可计算出一个"连接矩阵"，从而揭示大脑不同区域之间如何相互作用并协同工作。此类分析在研究健康与疾病状态下的脑功能方面具有重要价值，适用于痴呆、癫痫及其他神经系统疾病等病症的研究^4,5。

首个评估脑代谢连接性的研究可追溯至20世纪80年代⁶，但研究人员主要通过扩散加权磁共振成像（DW-MRI）来探索脑结构连接性，后者也被称为"连接组"⁷。此外，利用功能磁共振成像（fMRI）、脑电图（EEG）和脑磁图（MEG）等技术研究功能连接性也已持续数十年之久^8,9。

近年来，利用[¹⁸F]FDG PET，不仅可单独使用，还可与其他形式的脑连接方法结合使用¹⁰然而，由于其固有的 "静态" 由于PET图像的特性（与例如功能磁共振成像相比），绝大多数基于PET的脑网络研究结果依赖于组水平分析，即在被试间水平上计算脑区间相关性。这一限制使得对PET图像进行被试内分析变得不可行，而被试内分析对于能够追踪同一受试者随时间变化的纵向研究至关重要。⁴因此，开发能够实现单受试者分析的方法（如基于动态PET的分子连接性分析）是脑科学研究中针对网络功能障碍的重要研究方向，因为它为在临床实践中应用分子网络分析打开了大门。因此，本研究的临床前实验采用了动态PET数据。

我们的研究团队目前正在开展一项研究，该研究利用大鼠胶原酶模型，在多个时间点上以受试者自身为对照，考察脑内出血后代谢连接性的变化¹¹。为了分析受试者自身的脑代谢连接性，需要获取示踪剂在不同脑区摄取的时间动态信息，这可通过动态正电子发射断层扫描（PET）实现。下文将详细介绍数据采集与分析的实验方案。

方案

所有操作均遵循欧洲指南（指令 2010/63/EU），实验方案经根特大学当地动物伦理委员会批准（ECD 23/33）。研究共纳入12只Sprague Dawley大鼠（雌性6只，雄性6只）。在诱导脑出血前后不同时间点（从脑出血前2周至脑出血后18周）按照以下方案进行PET扫描。首次扫描时，所有动物均为18周龄，雌性体重为244.8 ± 10.1 g（均值 ± 标准差），雄性体重为363.6 ± 13.3 g。

确保仅由经过培训的人员操作和处理放射性物质。应将工作人员和动物的辐射剂量保持在合理可行的最低水平（ALARA）。

1. 数据采集

注意：有关用于数据采集的临床前 PET 成像仪及软件的详细信息，请参见材料表。该成像仪为一台包含45个探测器（排列为5个环）的PET扫描仪，其轴向视野（FOV）为13 cm，横向视野（FOV）为7.6 cm，采用LYSO晶体和SiPM探测器。该系统空间分辨率为850 µm，灵敏度为12%，能量分辨率为12.6%¹²。以下步骤的编写均基于此设备参数。

1. 在扫描前6-14小时，通过移除笼内所有食物对动物进行禁食。动物完成足够的禁食期后，按如下步骤开始数据采集的准备工作。
2. 打开加热垫，使其升温至30–35 °C。
3. 使用异氟烷对动物进行麻醉，将动物置于充满5%异氟烷（溶于医用O₂）的气体麻醉室中₂ 以2,000 mL/min的流速通入麻醉气体。将加热灯置于距实验舱30 cm处，以帮助维持动物体温。当呼吸频率降至每秒0.5–1次时，通过施加压力于足垫并观察是否存在足爪回缩反射来确认麻醉深度是否充足。
4. 称量动物体重。
5. 将动物放置于加热垫上，使用鼻罩给予2%异氟烷与医用氧气混合气体₂ 以500 mL/min的流速通入异氟烷。根据需要调整异氟烷剂量，以维持动物适当的麻醉深度。使用眼用润滑剂，防止角膜干燥。
6. 剃除动物肩胛骨之间颈部区域的毛发。
7. 尾静脉准备用于示踪剂注射：
   1. 将动物置于左侧或右侧，使用加热灯照射其尾部以使其升温，从而引起血管扩张。
   2. 取约20厘米长的BTPE-10管。使用持针器折断30 G针头的针 shaft，将针尾端插入PE管中1–2毫米。用1毫升胰岛素注射器吸取生理盐水，并将针尖插入PE管内3–5毫米。通过已充满生理盐水的注射器预先灌注PE管，使生理盐水充满管路，并保持注射器与PE管连接。
   3. 用乙醇清洁动物尾巴。移除加热灯。
   4. 将PE导管的针尖插入尾部侧静脉。确认针头位置正确：回抽针栓时观察是否有血液进入PE导管，推注时无阻力，且注射部位未形成皮下肿胀（提示静脉外注射）。若穿刺未成功，应将针头从尾部撤出，并在更近端的部位再次尝试。
   5. 在穿刺部位用一滴瞬干胶固定针头，并用胶带将PE导管固定在尾巴上。
      注意：避免移动聚乙烯（PE）导管。若在任何时刻血液进入PE导管，应立即用生理盐水冲洗，以防堵塞。
8. 转换为美托咪定镇静：
   1. 将动物俯卧位放置于加热垫上。如有必要，重新涂抹眼用润滑剂。
   2. 准备一段聚乙烯（PE）导管（40–100 cm），用于连接靠近PET扫描仪的输液泵。使用持针器折断30 G针头的针体部分，将针尾端插入PE导管内1–2 mm。用带30 G针头的1 mL塑料注射器吸取至少0.2 mL的美托咪啶（每只动物用量），并将针尖插入PE导管内3–5 mm。通过注射器将美托咪啶预先充满PE导管。
   3. 将含有美托咪定的注射器放入输液泵中。打开泵开关，并通过点击选择正确的注射器 找到注射器 | BD 塑料 | 1 mL
   4. 使用泵推出0.005 mL的液滴，直至聚乙烯管（PE tubing）另一端的针头处出现液滴。确保聚乙烯管内无气泡存在。
   5. 将PE管的针头插入动物肩胛骨之间的皮下2–3 mm处。在穿刺部位用一滴瞬干胶固定针头，并用胶带轻轻将PE管固定在动物背部。
   6. 注射一定体积的推注液 v 根据动物体重给予右美托咪定（速率：3 mL/min）：
      
      何处 d = 0.05 mg/kg（每公斤动物体重所用美托咪啶的剂量，单位为mg） m 是动物的体重（单位：kg），以及 c 是右美托咪定的浓度，单位为 mg/mL。
   7. 在给予美托咪定推注后10分钟停止异氟烷的使用，根据需要调整异氟烷剂量，以在此等待期间维持稳定的麻醉状态。
      注意：异氟烷与美托咪定联合使用会显著减慢动物的呼吸频率。在停止给予异氟烷前，必须密切监测动物状态。
   8. 停止异氟烷5分钟后，开始以以下速率持续输注美托咪定：
      r_继续 = r • m
      何处 r = 0.1 mg/(kg·h)（即每小时每千克动物体重所用美托咪啶的毫克数）； m 动物的体重（单位：kg）。
      注意：在开始持续输注后，需额外进行25分钟的平衡期（即在停止异氟烷后30分钟），以确保动物体内完全清除异氟烷，方可启动扫描。在此期间，继续执行以下步骤。
9. 动物在PET扫描仪中的定位：
   1. 在扫描仪床面上放置加热垫、压力传感器和纸巾。使用传感器监测动物的呼吸频率，并用纸巾吸收动物排出的尿液。
      注意：由于使用了美托咪定，动物通常会排出大量尿液。
   2. 将动物小心转移至扫描仪床面上，确保右美托咪定输液管和尾静脉导管固定稳妥。必要时可借助鼻罩辅助，尽量使动物头部保持平直。待位置调整合适后，用胶带固定头部。
   3. 打开加热垫，并确认呼吸频率监测系统工作正常，必要时调整压力传感器的位置。
10. 开始PET扫描前10至5分钟，用胰岛素注射器抽取约20 MBq的2-脱氧-2-[¹⁸F]氟代葡萄糖¹⁸F]氟代脱氧葡萄糖（[¹⁸F]FDG) 用 0.1–0.8 mL 生理盐水稀释。
    注意：氟-18（¹⁸F 是一种氟的放射性同位素，半衰期为 109.8 分钟。操作放射性物质时应遵循当地的辐射安全规程。
11. 打开扫描仪软件并配置以下扫描参数：选择 ¹⁸F 作为 同位素 （衰变校正的重要参数），输入 测定的活性 注射器中放射性示踪剂的 MBq 由活度计测量）以及 测量时间 （这些信息将保存在元数据中，用于将数据转换为其他单位，例如标准摄取值）。选择 通用 方案与蜱虫 采集后的自动分选. 设置 扫描持续时间 到 1 h，并调整兴趣区域（ROI），使其包含整个大鼠脑（通常为位置2-5）。 
12. 异氟烷停止给药30分钟后，开始进行PET扫描：
    1. 再次通过回抽确认静脉内位置正确，然后按照步骤1.7.4所述注入少量生理盐水。
    2. 将生理盐水注射器更换为放射性示踪剂注射器。从聚乙烯（PE）管路中移除注射器时，血液可能进入PE管路，将生理盐水推出。迅速插入放射性示踪剂注射器的针头，注意不要刺穿PE管路。
    3. 使用扫描仪软件启动扫描。
    4. 开始采集后，将示踪剂在约0.5–2秒内以团注方式注入。立即用生理盐水注射器替换空的放射性示踪剂注射器，并用约0.1 mL生理盐水冲洗PE管路。在更换注射器时，使用纸巾接住可能溢出的放射性示踪剂液滴。
       注意：示踪剂注射后，扫描仪软件显示的计数率应迅速上升至 4.5–6.5 Mcps。若初始计数率明显低于 4 Mcps 且随后逐渐上升，则提示示踪剂注射存在（部分）静脉外渗。
    5. 通过测量未注入动物体内的示踪剂注射器、可能被污染的组织以及手套中的放射性活度，评估残余活度。将该活度值及测量时间输入扫描仪软件，以便保存至元数据中。
       注意：残留活性为 0.1–1.5 MBq 是典型情况，具体数值取决于更换为生理盐水注射器时逸出的示踪剂量。
13. 扫描完成后，将带有动物的床从扫描仪中推出。
    注意：在美托咪定被拮抗之前，动物可能对刺激产生反应或苏醒。操作过程中需小心谨慎，并做好应对动物突然活动的准备。同时应注意动物具有放射性，因此应尽可能快速而仔细地完成以下步骤。
14. 使用持针器从动物尾部移除针头和PE管。在穿刺部位放置纱布或棉垫以防止可能的出血。
15. 停止美托咪定给药，并从动物颈部移除针头和PE导管。
16. 将动物放入无其他动物的笼子中，转移过程中使用组织纸接住可能排出的（放射性）尿液。使用1 mL胰岛素注射器在动物背部皮下注射1 mL生理盐水，以促进其再水化。
17. 通过皮下注射阿替美唑逆转镇静作用。
    1. 计算适当的体积 v 使用以下公式：
       
       何处 d = 0.5 mg/kg, 即 动物体重每千克所用美托咪啶的剂量（mg/kg）， m 是动物的体重（单位：kg），以及 c 是阿替美唑的浓度，单位为 mg/mL。
    2. 对于体重较轻的动物，若计算出的体积较小，可用生理盐水稀释阿替美唑，以便更准确地给药。用胰岛素注射器抽取4 • v 阿替美唑和12 • v 生理盐水。将所得溶液的四分之一皮下注射到动物颈部附近的背部。
18. 目视监测动物直至其苏醒，通常需要1–5分钟。一旦动物能够自主保持直立并自由活动，即可将其放回群养笼具。为动物提供食物和饮水。

2. 数据重建与质量检查

注意：使用本研究中的硬件和软件，所有 PET 数据均针对放射性核素衰变进行了校正，采集的正弦图采用在 511 keV 光电峰周围设置 30% 窗口的有序子集最大期望值三维（OSEM-3D）算法进行重建。OSEM 重建软件使用其默认设置，即 10 个子集，每个子集包含 2000 万个事件。图像被重建为 192 × 192 × 384 的横断面矩阵，图像体素为 0.4 mm 的立方体。未进行衰减校正。

1. 为确认示踪剂注射成功，需检查60分钟采集期间检测到的计数率（即时间-活性曲线（TAC）），并确认在示踪剂注射后采集开始的1分钟内出现峰值。
2. 静态重建：使用OSEM算法对采集数据进行重建，设置30次迭代，各向同性体素大小为400 µm，能量窗为511 keV光电峰中心处的30%。
3. 重建完成后，检查所得图像是否存在伪影。
4. 动态重建：使用与静态重建相同的参数设置，将采集数据重建为30个每帧2分钟的时间帧。

3. 数据分析

注意：以下步骤 3.1 和 3.2 在专用于 PET 数据定量分析的生物医学软件环境中进行，使用的是 图像配准与融合工具（PFUS） 和 通用动力学建模工具（PKIN）。

1. 在 PFUS 中：
   1. 在子页面 加载输入图像：
      1. 通过点击 INP 加载 按钮或将文件拖放到画布中，加载动态重建的 DICOM 文件。使用右上角的 通用图像显示控制 功能浏览切片和时间帧，并调整颜色条。如有需要，可通过右侧边栏中的 更改输入图像方向 按钮，将图像方向调整为标准方向。
      2. 裁剪与帧平均：点击右下角的 箭头 以显示用于求和和裁剪的隐藏控件，并勾选 裁剪。在画布中，通过调整裁剪框的边缘并拖动其中心，定义裁剪边界；确保整个大脑以及包含部分眼睛和脊髓区域的周边区域均被包含在内。完成裁剪框设置后，点击 裁剪 按钮以裁剪图像。通过点击 橙色平均 按钮，计算所有时间帧的加权时间平均值，并等待结果自动添加至输入图像中，最终得到两个输入图像：包含时间帧的裁剪后动态数据 和 相同数据的裁剪后加权时间平均值。
      3. 选择 Deform 作为 匹配方法，或如果已选中则直接点击按钮，进入基于模板的归一化步骤。
   2. 在子页面 参考图像与匹配：
      1. 选择 加权时间平均图像 作为 输入图像（通常由上一步自动选中）。
      2. 点击按钮加载参考图像，选择一个归一化模板作为参考图像。选择 Rat FDG (W. Schiffer)。
      3. 点击右侧边栏中的 输入匹配 | 输入：手动调整 按钮，将输入图像与模板进行匹配。拖动并旋转输入图像，使其大致与模板对齐。确保 Rat 被选为 物种，配准方法 为 Deform，然后点击 匹配当前 按钮，进入下一个子页面。
   3. 在子页面 匹配结果：
      1. 检查匹配结果，如有需要可手动调整。点击 将当前变换应用于全部，以同时对包含时间帧的输入图像进行匹配。
      2. 点击绿色按钮 VOIs，进入下一步处理。
   4. 在子页面 VOI 分析：
      1. 在 右下角菜单 中，选择 包含时间帧的图像 作为 图像 A。
      2. 进入 模板 选项卡，在 图谱 选项卡中选择 Px Rat (W. Schiffer)，或加载自定义图谱，并选择 所需的体积区域。点击底部的 轮廓 按钮以应用感兴趣体积（VOI）。
      3. 点击 模板 选项卡上方的按钮，计算时间-活性曲线（TACs），并将其发送至 PKIN 工具。
2. 在 PKIN 中：
   1. 在右下角，将 显示类型 设为 TACs，以可视化先前选定 VOI 的 kBq/mL 单位的时间-活性曲线。
   2. 在显示 TACs 的 画布 上右键点击，选择 可见曲线的数值表。将表格复制到电子表格中以进行进一步分析。
3. 利用扫描开始后第6至最后时间帧（即10–60分钟）的数据，计算所有 VOI 配对之间的皮尔逊相关系数，以获得相关性矩阵。实现此功能的 Python 脚本“correlation_matrix.py”包含在 补充文件1 中。
4. 使用 t-检验统计量判断皮尔逊相关是否具有显著性：，自由度为 n - 2，其中 r 为皮尔逊相关系数，n = 25 为用于计算皮尔逊相关的帧数。对多重比较进行适当的校正，并将统计量与具有 n - 2 自由度的双尾 t-分布（p = 0.05）的临界值进行比较。若校正后的 t-检验值小于临界值，则认为两个 VOI 之间的皮尔逊相关具有显著性。

结果

扫描完成后，可分析采集期间检测速率的时间-活性曲线（TAC），以评估示踪剂注射与摄取是否正确. 图1 显示成功示踪剂注射和采集后，扫描仪整个视场（FOV）产生的TAC（图A），以及部分静脉旁注射示踪剂后产生的TAC（图B）。在成功的情况下，计数率在示踪剂注射后迅速上升，并在前4分钟内达到峰值，随后在整个采集剩余时间内稳定下降。在静脉旁注射的情况下，计数率在示踪剂注射后 shortly 达到一个局部最大值，随后下降数分钟，之后再次上升，并在采集的后半段达到全局最大值。

图 1：扫描仪整个视野60分钟采...

讨论

本方案指导用户在大鼠中使用[¹⁸F]FDG作为示踪剂获取1小时动态PET数据。最终获得感兴趣区域（VOI）的相关矩阵，可用于在单个受试者水平上评估代谢连接性。经验丰富的研究人员可根据具体需求在多个环节调整本方案，例如更换不同的放射性示踪剂、调整采集时间或图像重建的时间帧宽度，并在数据分析阶段选择相关的感兴趣区域（VOI）。

示踪剂注射是本实验方案中最关键的步骤之一。尾静脉通路的准备应由具有实验室动物研究经验的专业人员操作。当针头正确置入尾静脉内时，通过导管注射生理盐水或示踪剂应几乎无阻力。如果对尾静脉通路的质量存在疑虑，建议在注射任何示踪剂之前，先拔出针头和导管，并重新建立正确的通路。若动物发生静脉外注射，建议在之后的时间点重新进行实验，因为此时示踪剂的摄取动力学与成功注射的情况不同（见图1）。由于¹⁸F的半衰期为109.8分钟，已接受注射的动物需至少等待18.5小时才能再次注射，以避免首次注射残留的放射性影响动物体内的检测结果。静脉注射的一种替代方法是腹腔注射，但这也将会导致不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Antisedan	Orion Pharma		盐酸阿替美唑 5 mg/mL
BD Micro-Fine+ 胰岛素注射器 1 mL	BD	324827	0.33 mm (29G) x 12.7 mm
BD Microlance 3 针头 30 G x 1/2"	BD	304000	30 G x 1/2"；0.3 x 13 mm
BD Plastipak 注射器 1 mL	BD	303172	用于输注泵
BTPE-10 聚乙烯管	Instech		0.11×0.024 英寸 (0.28×60 mm)
Domitor	Orion Pharma	1070499	盐酸美托咪啶 1 mg/mL
Fusion 100 输注泵	Chemyx Inc.	07100	更新型号可选：Fusion 100X
Isoflutek 1000 mg/g	Alivira		异氟烷
MOLECUBES β-CUBE 配 CUBEFLOW 软件	MOLECUBES NV		临床前 PET 扫描仪
PMOD 软件版本 4.4	Bruker Corporation		http://www.pmod.com；PET 数据定量分析
生理盐水	B. Braun	394496	NaCl 0.9%
Vidisic 眼用凝胶	Vidisic		卡波姆 980 2 mg/g