本文介绍了一种优化且高效的成年斑马鱼静脉注射细胞或药理学试剂的实验方案，可显著提高细胞植入效率，并增加受处理斑马鱼的存活率。
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本文内容
摘要
摘要
静脉（IV）注射被广泛认为是在哺乳动物研究模型中实现物质全身递送最有效且最常用的方法。然而，由于成年斑马鱼体型较小且血管结构复杂，该方法在成年斑马鱼的药物递送、干细胞移植以及再生和癌症研究中的应用受到限制。为克服这些局限，过去曾探索采用心内注射和眶后（RO）注射等替代注射技术用于成年斑马鱼的干细胞移植。然而，这些技术也存在缺点，包括需要精细的注射操作或导致死亡率升高的风险。
本研究中，我们开发了一种经过优化和改进的静脉注射方法，专门针对成年斑马鱼独特的解剖结构而设计，以解决相关技术难题。为验证该技术的有效性，我们成功将来自Tg(mpo: EGFP) 斑马鱼的全肾髓细胞及FITC-葡聚糖染料通过静脉注射导入成年 Casper 斑马鱼体内。随后利用荧光显微镜观察，证实了注射的细胞和染料已成功递送并在斑马鱼体内成功植入。此外，我们还证明，与心内注射和后眼眶（RO）注射相比，静脉注射显著提高了受处理斑马鱼的存活率和细胞植入效率。该方法可实现物质的精确定位递送，在利用成年斑马鱼进行大规模药物和化学筛选方面具有广阔的应用前景。同时，通过可视化手段追踪注射后的细胞与染料，可深入揭示其在宿主组织中的植入、迁移及相互作用过程，从而对斑马鱼模型中的治疗效果和生物学过程进行更为全面的评估。
引言
斑马鱼（Danio rerio）已成为生物医学研究中一种重要的模式生物，主要因其与人类具有高度的基因相似性，超过70%的人类基因在斑马鱼中存在对应基因1,2。这种基因上的相似性，结合斑马鱼体型小、发育周期短以及易于进行大规模遗传操作的特点，使其成为科学研究的有力工具。这些特性在涉及细胞移植、药物递送和细胞示踪的实验中尤为有利。此外，透明的幼鱼以及特定的色素突变体（如Casper斑马鱼）具有良好的光学通透性，能够精确观察移植的细胞或物质，为传统动物模型提供了一种更高效且成本更低的替代方案。
斑马鱼被广泛用于建立癌症移植模型，并对胶质瘤、黑色素瘤、胰腺肿瘤和白血病等严重疾病进行药物筛选3,4,5,6,7,8,9,10。通常，这些模型在幼体阶段启动，以利用幼鱼尚未发育完全的免疫系统及其天然的通透性，从而简化注射过程并提高短期研究的可行性。然而，使用幼体限制了对移植效果和治疗干预的长期评估时长7,11。将这些实验方案扩展至成年斑马鱼时，会面临诸多挑战，例如注射操作更为复杂、移植效率降低、死亡率升高以及个体反应差异增大。这些挑战凸显了改进注射与物质递送技术的迫切需求，特别是在需要长期观察的成年斑马鱼研究中。
传统上，心内注射12和眶后（RO）注射13是成年斑马鱼药物递送和细胞移植的主要方法。心内注射是将物质直接注入心脏，可确保药物立即进入全身循环，但存在较大风险，包括潜在的心脏损伤和高死亡率。另一方面，眶后注射通过将物质递送至眼球后方的静脉窦，也能实现快速的全身分布，但可能对鱼类造成较大应激，且操作需要极高的精确度14。在小鼠和大鼠中，静脉注射（IV）作为一种成熟的全身性物质递送方法，对于药代动力学研究、药物疗效评估以及治疗干预至关重要15,16,17,18。近年来，静脉注射在斑马鱼研究中逐渐受到重视，尤其在幼体斑马鱼的先天免疫反应19,20和急性肾损伤研究21中得到应用。然而，其在成年斑马鱼中的应用仍较为有限。
本研究中，我们开发并优化了一种专门针对成年斑马鱼的静脉注射方法，该方法显著提高了存活率、操作精确性和递送效率。我们通过可视化方式展示了该技术，并提供了采用此优化方法的详细实验方案。我们成功地将来自 Tg(mpo: EGFP) 斑马鱼的全肾髓（WKM）细胞以及荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）染料经静脉注射至成年 Casper 斑马鱼体内，并通过荧光显微镜观察确认了递送效果及细胞植入情况。研究结果表明，与传统的心脏内注射和后眼眶静脉窦（RO）注射方法相比，优化后的静脉注射技术具有更高的效率和更好的一致性。随着斑马鱼在科学研究中的应用不断拓展，这一改进的静脉注射技术的推广应用有望加深我们对疾病发病机制的理解，并加速新治疗策略的开发进程。
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方案
所有动物实验程序均经香港大学（HKU）实验与研究动物使用委员会（CULATR）批准。
1. 注射材料的制备
- 制备细胞悬浮液培养基：0.9x PBS + 5% 胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）。
- 在波长为 270–280 nm 的紫外线下对 Hamilton 注射器及配套针头（34 G，10 mm 长度，10 µL 容量，请参见材料表）进行灭菌处理，照射时间为 2 小时。
- 准备灭菌棉签、泡沫垫和纸巾。
- 通过将三卡因（tricaine）用灭菌鱼用水稀释至终浓度为 0.2 mg/mL，制备麻醉混合液。
- 对于在Casper鱼中移植 WKM 细胞的实验，移植前 2 天给予亚致死剂量的辐照（25 Gy），分两次进行，每次 12.5 Gy，两次之间间隔 7–8 小时。辐照过程中，将 5–10 条成年鱼置于含有鱼用水的 100 mm 培养皿中，并放入γ射线辐照仪中进行照射。
注意：该剂量被确定为亚致死剂量，依据是对Casper鱼暴露于最高达 35 Gy 的不同辐照剂量后进行为期 30 天的存活率分析所得结果（图 1A）。确切的辐照时间应根据辐照仪的具体设置进行校准。仅涉及药物递送的操作无需辐照处理。 - 使用实验室高压蒸汽灭菌器对用于饲养处理后鱼类的鱼用水（见材料表）进行灭菌，以防止感染，并确保鱼类注射后的安全恢复环境。
注意：灭菌程序需根据所使用的特定高压灭菌设备进行调整，我们遵循制造商关于液体溶液高压灭菌的指导说明来制备鱼用水。 - 制备针头清洗缓冲液：准备若干管含 75% 乙醇和超纯水的 1.5 mL 微离心管。
- 通过将 FITC-葡聚糖（分子量：10,000）溶解于先前制备的细胞悬浮液培养基（含 5% FBS 和 1% Pen/Strep 的 0.9x PBS）中，制备移植缓冲液，调节浓度至 100 µg/mL。
注意：该缓冲液将用于注射，每条鱼计划注射体积为 2 µL。
2. 移植用全肾髓质的制备
- 通过将所需数量的 Tg(mpo: EGFP) 鱼浸入 0.4 mg/mL 的三卡因溶液中实施安乐死，确保在鳃盖运动停止后继续在溶液中放置至少 10 分钟。
- 解剖 Tg(mpo: EGFP) 鱼，分离肾髓组织（KM），并将其转移至 1.5 mL 微量离心管中的细胞悬浮液培养基中，操作步骤如前所述22。
- 通过移液吹打并使用 40 µm 尼龙细胞筛过滤，将 KM 细胞分散成单细胞悬液。
- 在 500 × g 条件下离心 8 分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于 500 µL 细胞悬浮液培养基中。
- 取 10 µL 细胞悬液，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
- 再次在 500 × g 条件下离心 8 分钟。
- 使用移植缓冲液将细胞浓度调整至 150,000 个细胞/µL。
3. 注射操作步骤
- 注射前用75%乙醇彻底清洗Hamilton注射器3-4次，再用超纯水冲洗3-4次，以去除任何乙醇残留。
- 将斑马鱼浸入麻醉混合液中进行麻醉，直至其完全麻醉，表现为活动明显减少且反射反应消失。鱼体镇静后，将其背部朝上、头部朝左放置（图1B）。小心地将鱼放置在洁净湿润的纸巾上，有助于在注射过程中稳定鱼体。确保纸巾足够湿润以防止鱼体干燥，但又不能过湿导致滑动。
- 牢固握住Hamilton注射器，将针头以约45°角对准主血管（尾静脉），以有效靶向该血管并尽量减少对周围组织的损伤。对于Capser品系斑马鱼，应选择透过其透明体壁可见的血管段，以便准确插入针头（图1B）。对于皮肤有色素的野生型斑马鱼（Tubingen, TU），应瞄准位于体轴沿线、肛门后方的主血管区域（图1B）。轻柔平稳地将针头插入目标血管，缓慢注射（2 µL），以减少应激，确保物质充分吸收；注射后用棉签对注射部位施加轻柔压力10秒，以控制可能的出血。
- 在显微镜下观察以确认GFP信号的存在，确保注射有效。确认细胞或染料在血管内呈现为绿色信号（图2A）。
- 注射后将鱼置于新鲜灭菌的鱼水中恢复10分钟，之后转移至静水养殖缸中。
- 在更换不同试剂注射之间，按照前述方法清洁针头。
- 为防止细胞聚集，每隔10分钟轻弹细胞悬液一次，以重新悬浮细胞。
- 在4 L静水条件下，每缸最多饲养15条移植鱼，处理期间维持此状态。或者，可将移植鱼单独饲养于1 L静水缸中。养殖缸应配备氧气泵，并每日更换水体，以降低感染风险。
- 移植后约14天，通过流式细胞术监测和评估斑马鱼体内的GFP表达，以评价移植率。记录鱼的每日死亡情况，以准确计算存活率。移植率分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA），存活率分析采用Log-rank检验。
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结果
为了评估不同注射方法在成年Casper鱼中注射效果与精确度，本研究采用心内注射、眼后注射（RO）和静脉注射（IV）技术进行了比较分析（图2A）。实验中注射了来自Tg(mpo: EGFP)鱼的不同数量WKM细胞，并均与FITC-葡聚糖染料混合，细胞浓度分别为1 × 105和3 × 105。每种方法的成功率通过注射后立即在显微镜下检测GFP信号是否存在来确定。结果显示，不同方法在递送成功率方面存在显著差异。静脉注射（IV）方法效果最佳，在43尾鱼中有41尾检测到GFP信号。相比之下，眼后注射（RO）方法成功率较低，37尾鱼中仅有3尾实现成功注射。心内注射方法在40尾鱼中有11尾成功递送细胞（图2A）。同时监测了移植鱼的存活情况。通过眼后注射和心内注射的鱼其存活率显著低于静脉注射组（图2B）。值得注意的是，静脉注射组中注射细胞数量影响了受体鱼的存活率，接受3 × 105
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讨论
在本研究中，我们开发了一种针对成年斑马鱼的静脉注射方案，旨在提高细胞或药物递送的精确性和一致性。该方法的关键在于能够定位并可视化主静脉，这对于准确给药至关重要。尽管推荐使用透明的 Casper 斑马鱼品系以获得最佳血管可视性，但只要对可视性和准确性做出适当调整，本方案也可适用于多种成年斑马鱼品系。选择合适的针头规格对于最大限度减少血管损伤并确保有效输送物质至关重要。此外，我们高度重视注射后的全面护理，包括维持清洁且充分供氧的水质。这些措施不仅优化了注射流程，还显著改善了斑马鱼的健康状况和存活率，从而获得了更可靠且可重复的实验结果。
此外，我们对成年斑马鱼的经心注射、视网膜下腔注射（RO）和静脉注射（IV）技术进行了比较分析，结果表明静脉注射法在提高存活率和促进细胞植入方面具有显著优势。尽管经心注射传统上被使用，但其与较高的死亡率相关13，而视网膜下腔注射需要极高的操作精度，难以稳定实现14。静脉注射技术具有微创性，能显著减轻鱼类的应激反应和物理损伤，从而大幅改善注射后的...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢香港大学比较医学研究中心（CCMR）斑马鱼实验设施的支持。感谢黄瑶玲女士在动物实验方面的协助。本研究工作得到主题研究计划（T12-702/20-N）、健康与医学研究基金项目（编号08192066和08193106）、国家自然科学基金委员会（NSFC）/研究资助局（RGC）联合研究计划2021/22年度（N_HKU745/21）以及国家重点研发计划 &中国国家重点研发计划（2023YFA1800100）以及由香港特别行政区政府创新科技署资助的“InnoHK创新香港研发平台”肿瘤学与免疫学中心（A.Y.H.L.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高压灭菌器 蒸汽灭菌器 | HIRAYAMA | HRG-140 | |
| 离心机 5424 | Eppendorf | ||
| Countess 3 自动细胞计数仪 | Thermofisher | ||
| Countess II FL | Invitrogen | ||
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine） | Sigma-aldrich | MKCL9483 | |
| Falcon 40 µm 细胞筛 | CORNING | 蓝色，无菌，独立包装，每箱50个 | |
| 经鉴定合格的胎牛血清（FBS） | Gibco | 26140079 | |
| 异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（分子量 10000） | MedChemExpress | 60842-46-8 | |
| 注射针头 | Hamilton | HAMI207434 | 34 G，长度 10 mm |
| 微量注射器 | Hamilton | 7635-01 | 容量 10 µL，型号 701 RN |
| Nikon SMZ18 | |||
| PBS pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| 青霉素-链霉素溶液（5,000 U/mL） | Gibco™ | 15070063 | 100倍浓缩液 |
| 移液器吸头 | Eppendorf | epTIPS | |
| 单通道移液器 | Eppendorf | 05-403-151 | |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977015 |
参考文献
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