我们介绍了一种制备DNA包被金微粒的方法，并展示了利用此类微粒对培养的海马脑片中的神经元进行基因枪轰击转染的技术。
本文内容
摘要
摘要
基因枪转染是一种通过高速DNA包被微粒轰击组织来实现细胞转染的物理方法。本文提供了大鼠海马脑片基因枪转染的详细实验方案，内容涵盖从DNA包被微粒的制备到使用基因枪对脑片组织进行轰击的全过程。基因枪转染是一种高效且简便的神经元转染方法，特别适用于在脑片组织中对少量细胞进行荧光标记。本视频中，我们首先介绍将DNA包被到金微粒上的具体步骤；随后演示如何将金微粒/DNA混合物均匀涂布于塑料管内壁，并如何切割该塑料管以制备可用于装载至基因枪中的塑料弹夹；最后，我们对大鼠海马脑片进行基因枪转染操作，展示Bio-Rad Helios基因枪的使用方法，并提供相关故障排除建议，以获得健康且转染效果最佳的脑片组织。
基因枪转染，DNA包被微粒，金微粒，脑片培养，海马，神经元转染，荧光标记，Bio-Rad Helios
方案
基因枪转染实验方案
制备子弹
微弹在6个月内效果良好，但在2至3个月后转染效率可能开始下降。微弹应与干燥剂小球一同保存于4°C。在打开储存微弹的闪烁瓶之前，务必让其恢复至室温。
开始之前，请准备好以下物品：
- 亚精胺（0.05 M）
- CaCl2（1 M）
- 乙醇（100%，高纯度，未开封瓶装）
- 高压灭菌 H2O
- 待转染的 DNA
- 聚乙烯吡咯烷酮（PVP-20 mg/ml 储存液）
- 2 个 15 ml 锥形管（每组子弹头实验配备 2 个）
- 导管（剪成约 30 英寸长，每组子弹头实验配备 1 根）
- 闪烁瓶（每组子弹头实验配备 1 个）
- 干燥剂颗粒
- 10 ml 注射器，末端连接导管
准备管路：
- 在管路站中用 N2 气体（0.4 压力）干燥约 30 英寸的管路（右侧 O 形圈外延伸约 2 英寸），至少 20 分钟。
在金珠上沉淀 DNA：
- 在微量离心管中准备用于转染的 DNA，总体积为 50 μL（DNA 总量不超过 50 μg）
- 称取 6–8 mg 金粉并转移至微量离心管中
- 向金粉中加入 100 μL 0.05 M 亚精胺，并超声处理 20 秒
- 将 50 μL DNA 加入金粉/亚精胺混合物中
- 涡旋振荡（约设置为 5 档），管盖保持打开
- 逐滴加入 100 μL 1 M CaCl2
- 短暂超声处理（< 5 秒）
- 室温下静置沉淀 10 分钟
- 短暂超声处理
在超声处理期间配制聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液：
- 在15 ml离心管中配制稀释的PVP溶液，每组弹丸使用3.5 mL稀释PVP（将7.5 μL的20 mg/mL PVP储备液加入3.5 mL 100% EtOH中）
用乙醇冲洗金珠：
- 将金珠在微量离心机中以最大速度离心10秒
- 弃去上清液，但保留少量液体覆盖在金珠表面
- 用1 ml乙醇洗涤3次，每次可短暂超声处理（如有必要）
在聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液中重悬金/DNA复合物：
- 将金沉淀物重悬于 200 μL 的 3.5 ml 稀释 PVP/EtOH 溶液中
- 涡旋振荡使金沉淀物重悬（必要时可短暂超声处理）
- 将 200 μL 金/PVP 溶液转移至新的 15 mL 锥形管中
- 以此方式继续操作，每次加入 200 μL PVP 溶液，直至所有金颗粒均转移至 15 mL 锥形管中，最终体积为 3.2 mL
包被导管：
- 关闭管路站的 N2 气体，取下已干燥的管路
- 将干燥的管路连接到 10 ml 注射器上
- 用力振荡装有金/PVP 溶液的 15 mL 锥形管
- 将管路末端插入金/PVP 溶液中，缓慢吸取溶液，注意避免产生气泡
- 管路两端各留出约 2 英寸的干燥部分
- 保持管路连接在注射器上并充满金/PVP 溶液，小心地将管路重新放回管路站
- 标记管路两端溶液液面的位置
- 让金颗粒沉降 5 分钟，期间保持注射器连接
- 缓慢拉动注射器吸取溶液，使已沉降的金颗粒留在管底（注意不要反向冲洗）
- 断开注射器连接
- 旋转 90°，静置 2 秒
- 再旋转 180°，继续静置 2 秒
- 旋转管路 5 秒
- 打开 N2 气体，调节阀门至 0.4 - 0.5，同时旋转镀金管路，干燥 5 分钟
切割导管：
- 从管路预处理站取下管路，并在标记处剪去两端。
- 将一个贴好标签的闪烁瓶放在管路切段器下方，用于收集切割后的管段。
- 将管路放入管路切段器中，使用洁净的剃刀进行切割。
- 在闪烁瓶中放入干燥剂颗粒。
- 将管段在 4°C 下保存。
射击组织切片
在轰击培养的组织切片时，应采用相对无菌的技术，以避免污染。请注意， 当轰击两种不同构建体时，可将两组微弹加载到同一个载弹夹中，但在不同构建体之间必须更换枪管衬管和筛网。
开始之前，请准备好以下物品：
- DNA 微弹（使用前让闪烁小瓶恢复至室温）
- 组织切片
- Helios 基因枪
- 连接基因枪软管的氦气罐
- 弹匣 holder
- 已安装塑料 O 型圈的枪管衬管
- 扩散器（已改装）
- 扩散屏
- 镊子
准备基因枪：
- 用镊子将镀金的塑料弹夹放入弹夹架中。
- 将弹夹架装入基因枪时，先向后推动锁扣。
- 用锁扣固定弹夹架。
- 取一个带有O形圈且扩散屏已牢固安装的枪管衬管。
- 将枪管衬管旋入基因枪中。
使用基因枪轰击培养的脑片：
- 戴上耳罩
- 将基因枪插入连接氦气罐的软管
- 将气罐压力调至 180 PSI
- 向空中发射一次空弹，以清除扩散屏上的灰尘或碎屑。发射前，先按下安全联锁按钮，直到基因枪发出蜂鸣声，然后扣动扳机。
- 发射空弹后，从培养箱中取出脑片
- 将基因枪移至第一个构造位置
- 发射时，使扩散屏距离脑片约 0.5 - 1 英寸
- 在各孔之间移动弹匣
- 完成最后一孔的轰击后，将脑片放回培养箱
- 在将基因枪从氦气管上拆下前，关闭气体并释放压力
- 拧下枪管衬管，取出弹匣和已使用的弹壳
清洗柱芯套管和柱管内衬：
- 将弹匣、筒衬管和扩散屏放入盛有肥皂水的烧杯中
- 将烧杯放入超声波清洗机中，超声处理20分钟
- 用清水彻底冲洗，直至完全去除肥皂残留物
- 在70%乙醇中浸泡1小时
- 置于干燥的纸巾上过夜晾干
- 清洁后的弹匣、筒衬管和筛网即可在后续的基因枪转化实验中重复使用
基因枪转染实验的故障排除技巧
基因枪转染有时可能导致转染条件不理想。 可能导致转染的细胞过少或过多、表达水平过高或过低，或导致组织切片整体状态不佳。组织切片状态不佳通常由高压气流冲击引起。 以下是一些获得最佳转染组织切片的建议。
如果切片看起来不健康（或如果 太多 细胞被转染/切片时，可尝试：
- 增加射击距离
- 降低气罐压力
- 减少金的用量
- 切除 Bio-Rad 扩散器的中心部分，并用扩散屏替换中心部分。
如果转染的细胞数量过少，可尝试以下方法：
- 缩短射击距离
- 增加气体罐压力
- 增加金的用量
- 增加每孔组织切片数量
- 确保枪管衬里中的O形圈完好无损。
如果在同一次拍摄中获得的切片同时存在转染细胞过多和转染细胞过少的情况，请务必确保：
- 确保枪体对称地置于孔上方
- 金均匀地包被在导管内壁。（如果出现金线现象，在金颗粒沉降后应加快从导管中吸出上清液的速度，并在通氮气前延长旋转混匀时间。反之，如果出现金 streaking（金 streaking），可能是由于制备子弹过程中湿度过高所致：请确保使用未开封的乙醇（EtOH）试剂瓶，导管在包被前已彻底干燥，并及时盖紧瓶盖及完成子弹的制备）
如果转染效率似乎最佳（转染细胞数/切片），但表达水平过高或过低：
- 调整 DNA 与金的比率。 （例如，如果比率过低，则保持金的量不变，但增加 DNA 的量。）
- 调整射击后至数据采集之间的时间长度
在进行双重转染时，如果其中一个构建体的表达量过低，应适当调整两种构建体的转染比例，并确保两个构建体使用相同的启动子，以避免一个启动子竞争性地抑制另一个启动子的活性。
讨论
基因枪转染是一种通过高速将DNA包被的金颗粒轰击活体组织来实现细胞转染的物理方法。在颗粒介导的基因转移过程中，通常当微弹最终停留在细胞核内时，即可实现细胞的转染。尽管目前已存在多种转染方法，如显微注射、脂质体转染、磷酸钙转染、电穿孔和病毒转染等，但基因枪转染可作为一种劳动强度较低且高效的替代方案，尤其适用于那些难以通过上述其他方法进行转染的细胞。事实上，该技术最初是为植物基因转移而开发的，因为植物细胞壁的存在使得传统方法难以实现有效转染1。类似地，由于终末分化神经元极难转染，基因枪技术在神经生物学领域也逐渐受到重视2,3。特别是，在旨在研究完整脑片中单个神经元精细形态的实验中，该技术被广泛认为是主要的转染手段。本文所述方法详细而全面地介绍了如何使用手持式基因枪（Helios Gene Gun系统；Bio-Rad）对培养的脑片进行基因枪转染。
基因枪转染已成为脑片培养中转染神经元的首选方法，因为它能够在整个脑片中实现少量细胞的转染。通过这种方式，可以单独观察单个神经元。由于该技术特别适用于脑片中神经元的转染，因此常与双光子显微镜结合使用，因为双光子激发能够对光散射组织深层中的荧光标记细胞进行可视化成像4。事实上，本视频中展示的单个锥体神经元的高倍放大图像，均使用定制的双光子激光扫描显微镜采集。总之，基因枪转染是一种在高密度周围细胞环境中高效转染单个细胞的方法，因此在神经元脑片培养中对单个神经元进行荧光标记方面已被证明极为有用。
致谢
我们感谢 Mark Lucanic 和 Hwai-Jong Cheng 在获取本视频中展示的全海马切片低倍图像方面提供的帮助。我们还感谢 Sarah Parrish 在协助撰写视频配套文字方面给予的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 1.6 μm 金颗粒（微载体） | 0.25 g | 伯乐（Bio-Rad） | 1652264 | |
| 1 M CaCl₂ | Fluka | 21115 | ||
| 100% 乙醇 | 1品脱 | Goldshield | ||
| 卡式管路 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652412 | ||
| 闪烁瓶 | 20毫升，每箱500个 | VWR 国际公司 | 66021-668 | |
| 干燥颗粒 | ”Dricap” | MTI（800-445-9890） | ||
| 水浴超声仪 | model 50T | VWR 国际 | ||
| 卡式盒支架 | 5个装 | Bio-Rad | 1652426 | |
| 枪管内衬 | 5个装 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652417 | |
| 扩散屏 | 5个装 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652475 | |
| O形圈 | 75 个氟橡胶（Viton），007 型，数量：100 | McMaster-Carr | ||
| 筛网（网孔） | McMaster-Carr | 144258 | ||
| 聚乙烯吡咯烷酮 | 20 mg/ml，溶于乙醇 | 伯乐（Bio-Rad） | 配备伯乐（Bio-Rad）的管路 | |
| 管路预处理工作站 | Bio-Rad | 1652418 | ||
| 管子切割器 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652422 | ||
| Helios 基因枪 | 伯乐（Bio-Rad） | 1652411 | ||
| 基因枪软管 | 伯乐（Bio-Rad） | 附带基因枪 | ||
| 亚精胺 | 5g | Sigma-Aldrich | s-0266 | |
| 尽管我们已将所有产品分别列出，但批量购买更为经济 "Helios基因枪系统"，包含上述 Bio-Rad 公司列出的所有产品（货号 # 165-2431）。 |
参考文献
- Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).
- Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun. J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
重印与许可
