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方法文章

糖尿病患者中血糖对50岁及以上人群膝骨关节炎症状的物理、放射学及炎症标志物影响

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DOI：

10.3791/67521

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2025年3月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Healthy Ageing and Wellness, Faculty of Health Sciences, Universiti Kebangsaan Malaysia, 2Department of Radiology, Hospital Canselor Tuanku Muhriz UKM, 3Laboratory of Natural Products, Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia, 4Ageing and Age-Associated Disorders Research Group, Department of Medicine, Faculty of Medicine, University of Malaya, 5Department of Medical Sciences, School of Medical and Health Sciences, Sunway University

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用毛细血管血糖（CBG）和糖化血红蛋白A1C（HbA1C）水平评估血糖控制的实验方案。该研究探讨了高血糖对老年糖尿病患者膝骨关节炎（KOA）症状、身体功能、体力活动水平、影像学严重程度及炎症的影响。

摘要

本研究探讨了高血糖对老年人膝骨关节炎（KOA）相关症状、身体功能、体力活动水平、影像学严重程度及炎症的影响。长期高血糖状态可促进晚期糖基化终末产物（AGE）的形成，从而加重KOA症状。毛细血管血糖（CBG）和糖化血红蛋白A1C（HbA1C）水平常用于实验室血糖评估，各有其优势与局限性。根据参与者的CBG和HbA1C水平，将其分为血糖控制良好组和血糖控制不良组。采用膝关节损伤与骨关节炎结局评分（KOOS）和国际体力活动问卷评估KOA的临床严重程度和体力活动水平。身体功能通过握力、步速、起立-行走计时测试（TUG）和5次坐-立测试（5STST）进行测量。进行膝关节X线检查，并通过血清酶联免疫吸附测定（ELISA）分析IL-1β、IL-4、CRP、NF-κB和AGE水平。共纳入300名参与者（平均年龄[标准差] = 66.40岁（5.938）），其中CBG达到空腹血糖>7.0 mmol/L和随机血糖>11.1 mmol/L者（N = 254）在KOOS疼痛（p=0.008）和症状（p=0.017）以及5STST（p=0.015）方面表现出显著差异；而HbA1c >6.3%者（N = 93）在5STST（p=0.002）和AGE水平（p=0.022）方面也存在显著差异（基于Mann-Whitney U检验）。Logistic回归分析显示，血糖控制 与下肢肌肉力量、影像学严重程度及实验室标志物之间存在显著关联，血糖状态与KOOS疼痛和症状之间亦存在显著关联。然而，在校正BMI后，这些关联不再具有统计学意义。在校正降糖药物使用后，单独的血糖控制不佳反而与运动和娱乐功能的改善相关，提示药物可能具有抗炎和镇痛作用，从而掩盖了高血糖的负面影响。未来的研究可进一步探讨在考虑药物影响的前提下，血糖评估对膝关节功能不良和身体功能下降的预测能力。

引言

膝骨关节炎（KOA）的患病率随年龄增长而上升，膝关节是主要的承重关节1。KOA 通常表现为膝关节僵硬和慢性疼痛，导致活动能力受限、生活质量下降，并增加心血管疾病的风险2。糖尿病 mellitus 也与年龄相关，会增加 KOA 发生的风险，因为升高的葡萄糖和脂质水平促进晚期糖基化终末产物（AGE）的形成，从而引起慢性关节炎症和软骨退变3。尽管医疗服务可及，但每五名马来西亚糖尿病患者中就有两名未意识到自己患病，而已确诊者中有 56% 未能维持良好的血糖控制4。急性高血糖可导致高血糖高渗状态，危及生命；而慢性高血糖则会引起周围神经病变、肾病、视网膜病变以及心血管疾病5。

周围神经病变是一种由于血糖控制不佳导致的微血管并发症，可引起疼痛机制的改变，从而加重膝骨关节炎（KOA）患者的膝关节疼痛6。患有糖尿病的KOA个体常表现为膝关节活动范围减小、膝关节功能下降、影像学改变更显著以及生活质量更差7。糖尿病对KOA的影响导致身体活动能力下降，其特征表现为肌肉力量和协调性受损8。磁共振成像显示，与软骨和半月板损伤相关的退行性改变（如关节间隙变窄和力线异常）在糖尿病患者中似乎更为严重9。

血糖控制不佳与膝关节滑液中变性酶和炎症因子的上调有关。糖尿病中升高的细胞因子和蛋白质，如IL-1β、IL-4、IL-6、核因子-κB（NF-κB）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），均与膝骨关节炎（KOA）的病理生理机制相关10,11。而在软骨细胞中，葡萄糖转运体功能缺陷可导致糖酵解、多元醇通路、蛋白激酶C和戊糖通路的上调，最终产生大量活性氧物种10。

空腹血糖和随机血糖可评估当前的血糖水平以及与胰岛素抵抗相关的葡萄糖代谢能力12。糖化血红蛋白A（HbA1c）反映过去三个月内的血糖控制情况，但无法提供血糖急性波动的详细信息13。毛细血管血糖检测可在床旁或门诊即时评估血糖状态，这也引发了关于其在评估血糖控制及预测并发症风险方面价值的讨论14,15。因此，本研究旨在阐明在膝骨关节炎（KOA）患者中，通过HbA1c评估的血糖控制情况以及通过毛细血管血糖（CBG）检测到的血糖升高，与膝关节损伤和骨关节炎结局评分（KOOS）、身体功能表现、体力活动水平、影像学严重程度及炎症标志物之间的关联。

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方案

该研究方案符合《赫尔辛基宣言》的要求，并获得了马来西亚国民大学伦理委员会的批准（参考编号：JEP-2022-001）。

1. 受试者招募

  1. 采用便利抽样法，从吉隆坡和雪兰莪州居住于社区的50岁及以上膝骨关节炎（KOA）成人中选取研究人群。通过老年人组织以及糖尿病和骨科门诊招募受试者。
    注：膝骨关节炎（KOA）的诊断定义为研究对象自我报告的医生确诊KOA，或符合美国风湿病学会（ACR）临床检查标准16。
  2. 排除居住在机构中的老年人，或患有重大心理障碍及1型糖尿病者。
  3. 参考类似背景下已发表的横断面队列研究文献，确定本研究中的效应量（即比值比）。使用G*Power 3.1软件17计算样本量，确保在80%检验效能下能够拒绝无效假设。
  4. 在数据收集前，向研究对象说明研究目的，并获取知情同意。

2. 数据收集 - 问卷调查

  1. 发放问卷，包括社会人口学信息、KOOS18 以及国际体力活动问卷（IPAQ）19。
  2. 根据42个条目计算KOOS五个领域的各项总分，并将得分转换为0-100的百分制评分，其中0表示无问题，100表示每个领域存在极端问题。
  3. 通过将活动持续时间（分钟）与每周天数相乘，并结合各领域的标准，计算IPAQ各领域对应的代谢当量（MET）。
    注意：代表体力活动水平的总MET值为3.3（步行活动MET）+ 4（中等强度活动MET）+ 8（高强度活动MET）。

3. 数据采集 - 身体机能表现

  1. 使用身高计测量身高。使用体成分分析仪获取体重和体重指数（BMI）。确保受试者脱去厚重衣物、金属饰品及鞋子。
  2. 使用卷尺测量腰围、臀围和小腿围。腰围在静息状态下于脐部水平测量，单位为厘米；臀围在臀部向后突出最明显处水平测量20。测量小腿围时，受试者应坐姿端正，背部挺直，双足平放于地面，在小腿长轴最大周径处进行测量21。
  3. 向受试者说明如何完成体能测试：握力测试（HGS）22、计时起走测试（TUG）23、六米步行测试24 和五次坐立测试（5STST）25。
    1. 确保测试环境无障碍物和安全隐患。每次测试之间安排1分钟标准化休息时间26。
  4. 进行握力测试。
    1. 指导受试者坐姿，肩部处于中立位内收，肘关节屈曲90°。
    2. 告知其在整个测试过程中不得进行快速扭转或突然用力的动作。
    3. 使用握力计对每只手各测量三次最大力量，选取最大值（单位：kg）作为最终结果。
  5. 进行计时起走测试。
    1. 指导受试者坐直，背部紧贴椅背，手臂置于扶手上，双脚平放在地面上。
    2. 使用秒表记录从站起、行走3米、完成U形转弯、返回并重新坐回椅子所需的时间。计时从受试者背部离开椅背开始，到其背部再次接触椅背时结束。
    3. 重复测试两次，取最短时间（单位：秒）作为最终结果。
  6. 评估步速。
    1. 标记一条10米长的步行通道，并在通道两端各2米处用胶带做标记，以指示测量起始和终止位置。
    2. 让受试者以正常步速沿10米通道行走。
    3. 当受试者越过起点2米线时开始计时，到达8米线时停止计时。
    4. 使用速度公式（m/s）计算步速，即用6米除以所用时间（秒）。
  7. 进行五次坐立测试。
    1. 指导受试者尽可能快速且保持平衡地完成5次从坐位站起再坐下动作。
    2. 记录完成5次重复所需的时间，并从三次试验中选取最短时间（单位：秒）作为最终结果。

4. 数据采集 - 膝关节X光片

  1. 为参与者安排就诊日期和时间，前往医院进行双膝站立位前后投照负重X线检查。
  2. 将X线影像提交给放射科医生，由其确定并为每侧膝关节分配Kellgren和Lawrence分级27。
    注：该分类系统分为0至4级，级别越高表示膝骨关节炎（KOA）的严重程度越高，依据的特征包括：骨赘形成、关节周围游离骨、骨端形态改变、关节间隙变窄以及软骨下骨硬化。
  3. 记录所分配的分级，确保评分正确对应相应的膝关节。

5. 数据采集——用于血糖状态评估的毛细血管采血

  1. 洗手并戴上外科手套。用酒精棉片清洁受试者的手指，并让手指自然晾干。
  2. 将试纸插入血糖仪，完成血糖仪的准备工作。
  3. 选择采血笔，并确保其未使用且密封完好。
  4. 打开采血针的密封，用新的采血笔刺破手指，轻轻挤压手指以形成一小滴血珠，将血滴接触试纸的采样区。
  5. 使用质控液进行质量保证，将质控液滴加到试纸上，根据制造商说明检查读数是否处于预期范围内。
  6. 记录血糖仪显示的血糖水平。询问受试者最后一次进餐的时间，并记录采样时间是否在其进餐后8小时以上。
    注意：空腹血糖要求受试者在采样前至少禁食8小时，而随机血糖则无此要求。
  7. 将采血针安全丢弃至锐器盒中，并为受试者提供棉签，按压手指穿刺部位以确保止血。
  8. 操作结束后洗手，并清理任何血液溢出物。

6. 数据采集——用于血糖控制评估的静脉采血

  1. 洗手并戴上外科手套。
  2. 从左侧或右侧肘前窝中选择合适的静脉。在选定手臂的上臂处绑上止血带，并通过触诊确定合适的静脉。
  3. 使用酒精棉片清洁所选静脉周围的皮肤，并使其自然风干。
  4. 使用23 G蝶形针和两支6 mL普通采血管采集静脉血样本。用受试者的唯一识别编号标记采血管。
  5. 安全丢弃锐器和医疗废物，并洗手。
  6. 将血液样本置于含冰袋的冷藏箱中运送至实验室。将装有血液样本的采血管放入离心机，以604 × g 离心10分钟。
  7. 用微量移液器将血清分装至1.5 mL微量离心管中，并在储存前于管壁标记日期、识别编号和样本类型，随后置于-80 °C保存。

7. ELISA 检测

  1. 根据制造商说明书计算ELISA实验所需的血清体积。进行优化实验以确定最佳浓度；分别对IL-1β、IL-4、CRP、NF-κB和AGEs重复该过程。
  2. 解冻血清并将ELISA试剂恢复至室温（RT）。同时，标记用于标准品、样品和空白对照的微量离心管。
  3. 如需使用，按照制造商说明，用储备液配制稀释液、检测抗体、底物和洗涤缓冲液的工作液。
  4. 使用提供的标准稀释液对标准品进行两倍系列稀释。各标志物的标准品参考浓度：IL-1β = 500 pg/mL，IL-4 = 2000 pg/mL，CRP = 25 ng/mL，NF-κB = 10 ng/mL，AGEs = 4800 ng/L。标准稀释液同时作为空白对照。
  5. 如需优化实验，对血清样品进行稀释。
    1. 对于IL-1β、IL-4和NF-κB的ELISA实验，使用未稀释的血清样品。对于CRP，用参考稀释液稀释1000倍。每孔加入100 µL样品，并设复孔。
    2. 对于AGEs的ELISA实验，使用2倍稀释的血清样品，每孔加入40 µL，并设复孔。
  6. 在不同样品或试剂之间更换移液器吸头。使用多通道移液器以避免边缘效应。
  7. 根据制造商说明书建议的时间和温度进行孵育，并在每次孵育时用新的粘性封板膜密封酶标板。
  8. 对于该夹心ELISA实验，依次将样品和标准品加入预包被的孔中，随后加入检测抗体、偶联的二抗、底物，最后加入终止液。每次添加溶液的顺序应保持一致。
  9. 在每次孵育之间，根据制造商说明书使用洗涤缓冲液倾倒并清洗各孔。将孔板轻拍在干净的吸水纸上以去除洗涤液，但确保在加入下一种溶液前孔内不会干燥。
  10. 使用酶标仪在450 nm波长下读取各孔吸光度值。采用四参数逻辑曲线（4PL）法进行记录和计算，这是一种用于绘制对称S型标准曲线并确定浓度的定量方法28。分析时采用每个样品的平均值。

8. 统计分析

注意：使用适当的数据分析软件进行数据分析（此处使用 SPSS 版本 20）。将研究人群分为两组：1）血糖控制良好组，2）血糖控制不良组（血糖状态不良 = 空腹血糖 > 7.0 mmol/L 或随机血糖 > 11.1 mmol/L；血糖控制不良 = HbA1c > 6.3%）。

  1. 打开软件，根据日期、参与者识别码、社会人口学变量、问卷条目以及测量参数创建变量。
    1. 选择 可变视图插入柱中 名称，将描述或显示名称插入到该列中 标记.
    2. 选择 类型 > 测量对于编码的分类变量，将列中代表性的数字代码与其对应的值进行匹配 数值选择 好的.
  2. 将收集的数据录入软件，每一行代表一位参与者。
    1. 选择 数据视图在数字类型列中输入代表性的数字代码，在字符串类型列中输入名称或描述。
  3. 检验连续变量的正态性以确定参数检验的假设条件。
    1. 选择 分析 > 描述性统计学 > 探索将连续变量插入该字段 依赖列表.
    2. 选择 图示 > 正态性检验图及检验结果 > 继续 > 好的样本量大于50时，参考Kolmogorov-Smirnov检验中的p值；若p值具有显著性，则拒绝数据服从正态分布的零假设。
  4. 对非参数变量进行 Mann-Whitney U 检验，以检验组间差异的显著性。
    1. 选择 分析 > 非参数检验 > 设置 > 选择检测方法 > 定制检测 > Mann-Whitney U 检验（2 个样本）.
    2. 前往 领域 并将连续变量插入该字段 测试区域.
    3. 将CBG或HbA1c的分类组插入到该字段中 组别 > 运行.
  5. 对分类变量进行卡方检验，以检测组间是否存在显著性差异。
    1. 选择 分析 > 描述性统计学 > 交叉表 > 统计学 > 卡方 > 继续.
    2. 选择 细胞展示选择 观察到 在视野中计数并选择 柱 在该领域 百分比然后，选择 继续.
    3. 将分类变量插入该字段 行 将CBG或HbA1c的分类组别填入该字段 柱（柱） > 好的.
  6. 将连续型因变量转换为二分类变量，以准备进行逻辑回归分析。
    1. 选择 转化 > 重新编码为不同变量 并将连续变量插入该字段 输入变量 > 输出变量.
    2. 在字段中插入新变量名 名称在字段中插入一个新标签 标记 > 改变 > 旧值与新值.
    3. 在字段中插入截止点的阈值以下数值 范围，从最低值到指定值，并在场地上与零配对 值 的 新值 如果这表明结果良好。
    4. 选择 添加 > 在该区域插入截断点 范围，尽管数值最高 并与现场的一个配对 值 的 新值 > 添加 > 继续 > 好的.
  7. 因变量的截断点：
    - KOOS 疼痛维度 < 86.1%，症状领域 < 85.7%，日常生活活动领域 <86.8%，运动领域 < 85.0%，生活质量领域 < 87.5%
    - 握力较差：男性 < 28 公斤，女性 < 18 kg
    - TUG 测试表现差 > 8.00 秒
    步态速度差 < 1.13 毫秒-1
    - 5TSTS 差 >12.80 秒
    - 体力活动水平低，IPAQ MET < 3000
    - 中度至重度放射影像学膝骨关节炎，Kellgren 和 Lawrence 分级标准 > 2
    - 高水平 IL-1β > 11.9 pg/mL
    - 高IL-4 > 5 pg/mL
    - 高C反应蛋白（CRP） > 8 ng/mL
    - 高级糖基化终产物（AGE）水平升高 > 900 ng/L
    - NF-κB 高表达 > 3 ng/mL
  8. 进行多重逻辑回归以获得比值比。根据具有显著性差异的参与者特征，对逻辑回归模型进行混杂因素校正。
    1. 选择 分析 > 回归分析 > 二元逻辑回归将二元因变量插入该字段 依赖的.
    2. 将 CBG 或 HbA1c 变量插入字段中 协变量.
    3. 选择 分类变量 并将分类变量转入该字段 分类协变量然后，选择 参考类别 作为 首先 > 改变 > 继续.
    4. 选择 选项 > exp(B) 的置信区间：95% > 继续 > 好的.
  9. 对调整后的模型重复该步骤，但将显著的混杂因素添加到相应字段中 协变量.
  10. 连续变量以均值（标准差）表示，若使用非参数检验则以中位数（四分位间距）表示；分类变量以数量（百分比）表示。报告比值比（OR）及其95%置信区间（CI），将p值小于0.05标注为具有统计学显著性。

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结果

参与者特征
表1 总结了根据空腹毛细血管血糖（FPBS）和糖化血红蛋白（HbA1c）血糖状态划分的参与者特征。图1 展示了基于不同纳入标准在各个阶段所包含的参与者总数。在招募的300名参与者中，254人提供了用于FPBS检测的毛细血管血液样本，93人提供了用于HbA1c检测的静脉血液样本。在254份毛细血管样本中，有45份（17.7%）符合高血糖标准；而在93份静脉样本中，有42份（45.2%）符合血糖控制不佳的标准。FPBS检测可获取数据的参与者平均年龄为65.98 ± 5.41岁，HbA1c检测可获取数据的参与者平均年龄为66.41 ± 6.02岁。根据毛细血管血糖（CBG）结果，正常血糖组与高血糖组在民族、教育水平、体重指数（BMI）及慢性肾脏病方面存在显著差异；而根据HbA1c结果，仅BMI在血糖控制不佳组显著高于血糖控制良好组（p < 0.05）。此外，接受持续抗糖尿病药物治疗的参与者比例在CBG分组的两组之间（p < 0.001）以及HbA1c分组的两组之间（p < 0.0...

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讨论

在实验室检测中，静脉采血通常比毛细血管采血更能提供准确的结果29。HbA1c 与糖尿病并发症密切相关，具有稳定的化学性质，并且其实验室检测方法已高度标准化。由于 HbA1c 反映的是过去 3 个月内的血糖控制情况，因此无需空腹采样；而单次毛细血管血糖检测仅能反映某一时间点的血糖状态，易受最近进餐时间和食物内容的影响。然而，这两种血糖评估方法各有优缺点。毛细血管血糖检测结果可能受到微循环障碍、低血压、严重脱水、水肿以及糖尿病酮症酸中毒的影响，同时也受所使用的商用血糖仪及试纸条性能的影响30。尽管如此，毛细血管采血能够提供即时结果，具有更高的可及性，并能捕捉急性血糖状态，因此可满足不同的研究需求，尤其有助于在资源有限的环境中提升科研能力。

在本研究中，下肢力量、影像学严重程度和实验室标志物与血糖控制之间的关联受到 BMI（肥胖标志物）的混杂影响。同样，血糖状态与 KOOS 疼痛和症状之间的关联部分归因于 BMI 的混杂效应，而与下肢力量的关联则通过抗糖尿病药物介导。先前研究也发现，抗糖尿病药...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本研究由马来西亚高等教育教育部基础研究拨款计划资助，项目/奖项编号：FRGS/1/2021/SKK0/UKM/02/15。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蝴蝶针BD Vacutainer367282
G*Power 3.1Heinrich-Heine-Universityhttps://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpowerHeinrich-Heine-University, Düsseldorf
血糖仪及试纸Contour plushttps://www.diabetes.ascensia.my/en/products/contour-plus/瑞士巴塞尔
人CRP（C反应蛋白）ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-H0043-96TELISA试剂盒
人IL-1β（白细胞介素1β）ELISA试剂盒 ElabscienceE-EL-H0149-96TELISA试剂盒
人IL-4（白细胞介素4）ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-H0101-96TELISA试剂盒
人NF-κB-p105亚基Bioassay Technology LaboratoryE0003HuELISA试剂盒
人NF-κBp105（核因子NF-κB p105亚基）ElabscienceE-EL-H1386-96TELISA试剂盒
手动握力计Jamar5030J1美国伊利诺伊州沃伦维尔
便携式体成分分析仪InBody ASIAhttps://inbodyasia.com/products/inbody-270/Inbody 270，韩国忠清南道天安市
便携式身高测量仪Seca213 1821 009SECA 213，德国汉堡

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