研究脑血流调节 体内传统的药理学方法具有侵入性，常会损伤颅骨、硬脑膜和软脑膜。在本研究中，我们开发了一种微创技术，将纳米注射器引导的枕大池注射（ICM）与激光散斑衬比成像相结合，可在不破坏颅骨和软脑膜完整性的前提下进行。
本文内容
摘要
摘要
脑血流（CBF）调节对于维持认知功能至关重要，但其潜在机制仍不甚清楚。研究参与该调节过程的细胞与分子机制需要一种药理学方法，能够在实现脑脊液（CSF）中精确给药的同时，实时监测脑血流动态变化。本文介绍了一种研究脑血流调节的方法 体内 通过结合基于纳米注射器的枕大池（ICM）注射与激光散斑对比成像技术。
基于纳升级注射器的颅内注射技术可实现从 nL/min 到 µL/min 动态范围内的精确给药。在我们的实验中，该方法将注射体积从传统的 5–10 μL 显著减少至仅 1.5 μL，从而维持了正常的颅内压。当与激光散斑血流成像技术结合时，我们能够实时监测颅内注射前、注射过程中以及注射后的脑血流（CBF）动态变化。
利用该方法，我们评估了向颅内注射三种不同血管扩张剂——(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（DHPG）、乙酰胆碱和腺苷后，脑血流量（CBF）的变化。尽管这三种血管扩张剂均能增加基础CBF，但它们对CBF动态的影响各不相同。例如，腺苷的作用是短暂的，而DHPG和乙酰胆碱则产生持久效应。由于具备独特优势，该方法为研究啮齿类动物脑血流量调节的工具箱增添了有价值的手段 体内.
引言
脑血流（CBF）可确保向大脑持续供应氧气和营养物质，同时清除代谢废物，这对维持正常的认知功能至关重要1,2。在稳态条件下，尽管灌注压发生波动，CBF仍能保持相对稳定，这一过程称为自身调节3,4,5。除了自身调节外，局部脑血流还可根据邻近神经元活动进行动态调节，这一现象被称为神经血管耦合6,7。自身调节和神经血管耦合均由一组细胞共同调控，包括内皮细胞、壁细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和神经元，这些细胞统称为神经血管单元细胞4,7。然而，这些不同类型细胞协调调节脑血流的细胞和分子机制在很大程度上仍不清楚。
研究脑血流（CBF）调节的方法通常分为 体外 和 体内 模型 体外 研究通常采用急性脑切片，并结合电生理学或药理学技术，以探讨神经元和胶质细胞如何调控单个血管的舒张或收缩8,9,10主要局限性在于 体外 模型的一个问题是它们无法复制 体内 条件，尤其是缺乏生理血压。 在体 用于研究脑血流调节的模型涵盖从宏观到微观尺度的多种方法。宏观尺度技术，如正电子发射断层扫描（PET）和功能磁共振成像（fMRI），虽具有非侵入性优势，但空间和时间分辨率较低11,12,13,14.
研究脑血流量的主要微尺度方法 体内 是双光子成像，可提供高时空分辨率9,15,16,17,18然而，该技术需要移除颅骨和硬脑膜，当与药理学干预相结合时，侵入性进一步增加，可能引起出血、损伤脑组织并改变颅内压19因此，建立一种用于调控和监测脑血流（CBF）的方法至关重要 体内 需满足特定标准：应为非侵入性（保持颅骨、软脑膜及血管的完整性），具备高时空分辨率，并允许对脑血流（CBF）进行精确的药理学操控。本文中，我们介绍一种新方法，该方法结合基于纳升级注射器的大池（intracisternal magna, ICM）注射与激光散斑对比成像技术，可完全满足上述各项要求。
研究脑血流（CBF）调节的传统药理学方法通常需要去除颅骨和脑膜，以暴露脑组织进行局部药物递送。相比之下，脑脊液内注射（ICM注射）通过将药物直接注入脑脊液（CSF）中，避免了此类损伤，使药物能够随脑脊液的自然流动扩散，从而更好地模拟生理条件。ICM注射的一个挑战在于，通常需要较大的液体体积——在小鼠中往往需要5 µL或更多20。鉴于成年小鼠的总脑脊液量约为36 µL，注入5 µL液体可能增加颅内压并改变脑血流动力学。我们开发的纳米注射系统采用玻璃移液管，可精确控制注射液体的体积和速度，且不会在注射部位引起脑脊液泄漏。
乌拉坦和α-氯醛糖被用于本研究，因为与常用的异氟烷或氯胺酮/赛拉嗪（KX）等替代物相比，它们能提供更稳定的脑血流生理基线，并更好地保留神经血管耦合（NVC）。利用该系统，我们测试了三种不同的血管扩张剂——(S)-3,5-二羟基苯甘氨酸（DHPG）、乙酰胆碱和腺苷，并证实该模型可实现对脑血流动力学的精确操控与监测 体内.
方案
本方案已获得弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》 。实验共使用6只10至14周龄的雄性C57BL/6小鼠。手术操作流程见图1A。
1. 手术准备
- 手术前约20分钟，将加热垫放置在立体定位仪上并预热至37 °C。用磷酸盐缓冲液（PBS）新鲜配制乌拉坦（750 mg/kg）和α-氯醛糖（50 mg/kg）以用于麻醉。
注：配制α-氯醛糖的PBS溶液时，我们将溶液置于40 °C水浴中加热，并每隔10-15分钟涡旋振荡一次，直至完全溶解。乌拉坦和α-氯醛糖溶液在使用前均用0.22 µm注射器滤器过滤。 - 手术前准备好所有必要的手术器械，包括剪刀、镊子、微型持针器、止血钳、棉签、擦拭布和缝合线。通过高压灭菌（121 °C，15 psi，60分钟）对器械进行灭菌。
- 准备玻璃毛细管（外径1.14 mm，内径0.53 mm，长度88.9 mm）。使用拉针仪制备用于注射的玻璃微电极21。理想的微电极电阻约为80 - 100 MΩ。将玻璃微电极灭菌后存放于洁净容器中。
- 准备纳米注射仪，设定合适的注射体积（25 nL - 4.5 μL）和注射速度（6 nL/s - 644 nL/s）。
- 在人工脑脊液（aCSF）中配制以下血管扩张剂溶液：5 mM (S)-3,5-二羟基苯甘氨酸（DHPG）、0.5 mM 乙酰胆碱和10 mM 腺苷。
- 准备美洛昔康（4.0 mg/kg）用于术中镇痛。在手术开始前约30分钟对小鼠皮下注射美洛昔康，以确保充分的镇痛效果。
2. 手术步骤
- 称重六只C57BL/6雄性小鼠（10–14周龄），并通过腹腔注射给予乌拉坦（750 mg/kg）和氯醛糖（50 mg/kg）进行麻醉。将小鼠置于含1%异氟烷的麻醉舱中以维持麻醉状态。此过程大约需要40分钟至1小时。
注意：异氟烷可加快麻醉诱导速度。 - 小心将小鼠从麻醉舱中取出，并通过确认足趾夹捏反射消失来评估麻醉深度。使用棉签将脱毛膏涂抹于颅骨顶部和颈背部以去除毛发。
- 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥，并在整个手术过程中根据需要重复涂抹。实验期间应定期监测，必要时追加软膏。
- 将小鼠以俯卧位固定于立体定位仪中，同时以1至2 L/min的流速提供医用空气以确保充分通气。使用耳杆牢固固定小鼠，然后轻轻将头部向下倾斜，使其与身体形成120°角，从而暴露小脑延髓池。
注意：异氟烷仅用于麻醉诱导阶段，不用于维持阶段。 - 使用70%酒精和外科擦洗剂（如氯己定或聚维酮碘）交替涂抹至少三次，对术区进行消毒，以确保皮肤充分灭菌。
- 在手术显微镜下定位枕骨嵴。用镊子提起覆盖的皮肤，做一条长约1 cm的正中切口。使用棉签控制任何出血。
- 暴露颈部肌肉，并用镊子沿正中线小心切开并分离肌肉组织。双手各持一把弯头镊子，轻柔地牵拉肌肉以暴露硬脑膜，后者构成小脑延髓池的外层边界。
- 通过进一步向下倾斜头部，使其与身体形成150°角，以获得小脑延髓池的最佳暴露角度。
- 沿矢状缝做一条5 mm长的切口，覆盖λ点和bregma点。使用两把弯头镊子轻轻将皮肤向两侧拉开，用生理盐水清洁颅骨表面。确保暴露的颅骨上无残留毛发。
- 清洁后，使用棉签在暴露的颅骨上涂抹约1 mm厚的超声耦合剂，以保持局部湿润。由于超声耦合剂可能含有气泡，成像前必须彻底清除所有气泡。
- 将小鼠置于激光散斑对比成像系统的物镜下方。打开系统及其配套软件，确保小鼠脑部位于成像视野中央，然后使用自动聚焦功能调整至合适的成像焦平面。如有必要，使用镊子轻轻去除成像区域中残留的毛发或气泡。
3. 纳米注射装置设置
- 将泵固定在立体定位仪操作臂上，并将电缆连接至控制器。打开控制器并选择目标泵。在控制面板中，将DIRECTION 设置为INFUSE。设定流速为 2 μL/分钟，体积为 4.5 μL。
注意：纳米注射系统由两个主要部件组成：注射泵和控制器。每个控制器可同时操作两个泵。对于脑室内注射（ICM），我们仅使用一个泵。 - INFUSE 完成后，从容器中取出一根玻璃移液管，使用 34 G MicroFil 柔性针头或类似类型的针头吸入无色无味的矿物油。确保整根玻璃移液管内部均充满油。
- 松开泵上的卡盘，插入玻璃移液管，然后拧紧卡盘。确保玻璃移液管内无气泡存在。
- 在控制面板中将DIRECTION 更改为WITHDRAW。将速度 设为2 μL/min，体积设为 4.5 μL。
- 移动立体定位臂，将移液管轻轻插入已准备好的溶液中，并吸取所需体积的液体。
4. 向小脑延髓池注射血管扩张剂并监测脑血流
- 确保泵已牢固固定在立体定位操纵臂上。将立体定位操纵臂的角度调整至前后平面的45°。
- 在解剖显微镜下使用弯头镊子小心暴露小脑延髓池。用生理盐水清洁该区域以去除血液。利用立体定位微操纵器将玻璃微量移液管置于小脑延髓池的硬脑膜附近。
- 当玻璃微量移液管接触硬脑膜后，轻柔操作使其进入小脑延髓池中心，避免刺入小脑或延髓。在松开镊子前，确保玻璃微量移液管尖端插入深度为1–2 mm。
注意：必须使用数字立体定位框架来监测玻璃微量移液管进入小脑延髓池的深度。 - 在控制面板中将 DIRECTION 更改为 INFUSE。将 注射速度设为 300 nL/min，体积设为 1.5 µL。
- 启动激光散斑对比成像（LSCI）软件，并调节焦距以获得最清晰的血管图像。确保视野中无毛发或气泡。
- 在LSCI控制面板中将成像间隔设置为5秒。记录约10分钟的基础脑血流（CBF），确保基础值保持稳定。若基础值出现波动，应延长记录时间，直至达到稳定状态。
- 在稳定的基础值记录10分钟后，开始纳米注射，并在LSCI记录系统中标注注射开始时间。注射完成后，标记结束时间，并继续记录至少20分钟或更长时间。实验结束后，用PBS对小鼠进行心脏灌注，并采集脑组织用于组织学分析。
结果
手术完成后，我们将小鼠固定在带有数字读数的立体定位仪上（图1A，B）。为测量脑血流（CBF），我们在颅骨上方沿切口小心地分开皮肤，并涂抹透明超声耦合剂以保持颅骨表面湿润（图1C）。为便于小脑延髓池（ICM）注射，我们解剖枕骨嵴周围的颈部肌肉以暴露小脑延髓池。随后，用玻璃移液管吸取目标溶液，并使用显微操作器引导玻璃移液管穿透小脑延髓池膜，插入深度为1-2 mm（图1D，E）。立体定位臂倾斜呈45o角，以辅助插入操作。
接下来，我们研究了三种不同血管扩张剂对脑血流（CBF）动态变化的影响：(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（DHPG）、乙酰胆碱和腺苷22,23,24,25。在注射每种血管扩张剂之前，我们首先记录了10分钟的基础值，随后以300 nL/min的速度在5分钟内注射1.5 µL的药物。注射结束后，继续记录20分钟的数据。结果显示，这三种血管扩张剂均能增加CBF，但其动力学特征各不相同。DHPG引起CBF迅速升高，注射后随即逐渐下降（图2A、B）；相比之下，乙酰胆碱在整个记录期间诱导CBF逐步上升（图2C、D）；腺苷则引起CBF短暂升高，约在注射后15–20分钟恢复至基线水平（图2E、F）。
图 1：手术操作流程概要。（A）纳米注射联合激光散斑血流成像（LSCI）模型的主要手术步骤示意图。（B）纳米注射与LSCI系统联合装置示意图。纳米注射仪稳定固定于立体定位臂上，立体定位臂倾斜45o，以利于穿刺枕骨大孔膜进入小脑延髓池。（C）在LSCI系统下观察小鼠颅骨的俯视图。颅骨表面覆盖超声耦合凝胶。（D）后视图显示玻璃微电极穿刺进入小脑延髓池。玻璃微电极内充填伊文思蓝，以便于观察。本实验应使用数字式立体定位仪，以便精确量化穿刺深度。（E）示意图显示玻璃微电极尖端位于小脑延髓池内的位置。小鼠头部倾斜30o，以利于小脑延髓池注射。缩写：LCSI = 激光散斑对比成像。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：血管扩张剂纳米注射后脑血流量增加。（A）代表性图像显示DHPG注射前后脑血流的变化。血流速度以颜色编码，蓝色表示低速，红色表示高速。（B）红色线条标记区域的实时血流，该区域指示DHPG注射的时间窗口。（C）代表性图像显示乙酰胆碱（ACh）注射前后脑血流的变化。血流速度以颜色编码，蓝色和红色分别表示低速和高速。（D）红色线条标记区域的实时血流，该区域指示ACh注射的时间窗口。（E）代表性图像显示腺苷注射前后脑血流的变化。血流速度以颜色编码，蓝色和红色分别表示低速和高速。（F）红色线条标记区域的实时血流，该区域指示腺苷注射的时间窗口。缩写：DHPG = (S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸；ACh = 乙酰胆碱。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们提出了一种研究脑血流（CBF）调节的新方法 体内 通过结合精确的小脑延髓池纳米注射与激光散斑对比成像（LSCI），实现将药物准确递送至脑脊液（CSF），同时实时监测脑血流（CBF），从而促进脑血管反应性的评估。
药理学干预和药物递送技术对于在活体中研究脑血流量（CBF）和脑血管反应性至关重要。in vivo。传统的药物施用方法，例如使用血管扩张剂或收缩剂，通常需要去除颅骨，这可能会损伤软脑膜甚至脑实质9,10,18。这些侵入性技术可能破坏脑微环境，特别是引起血管损伤和出血，从而无法真实模拟生理条件。相比之下，我们的方法具有四个显著优势。
首先，我们的药物施用方法具有非侵入性，能够保持生理条件。其次，传统的颅内脑池（ICM）注射方法通常依赖注射器或导管，由于针头尺寸较大，可能导致药物或示踪剂以及脑脊液（CSF）泄漏。这些传统方法通常需要使用较大量的药物或示踪剂——一般为5 µL或更多，这可能会改变颅内压。相比之下，我们采用纳米注射器引导的ICM注射仅需极小体积，低至1.5 µL甚至更少。此外，注射速度可在宽泛范围内精确控制，范围从1 nL/s到100 nL/s。我们通常采用5 nL/s（300 nL/min）的速度，因为该速率不会影响颅内压。第三，与通过移液管引导将药物注入脑实质或在皮层表面进行药物灌注的方法不同，我们基于小脑延髓池注射的药物递送方式顺应脑脊液的自然流动，更接近生理状态。最后，由于本方法保留了颅骨和脑膜的完整性，因此可以在同一组小鼠中于不同时间点进行多次测量，实现纵向比较——这是其他药物施用方法难以实现的。对于存活实验和纵向比较研究，必须严格遵守无菌操作技术，包括适当的皮肤准备、使用无菌器械和材料，并符合机构动物护理指南。应给予两周的恢复期以确保伤口愈合。
麻醉方法会显著影响脑血流量（CBF）。例如，氯胺酮-赛拉嗪麻醉可使CBF升高超过基线水平的50%，而异氟烷可使基础CBF水平翻倍。在本实验中，我们选用乌拉坦和水合氯醛，因其对心血管系统的影响较小，有助于维持生理状态下的CBF水平，这也是该领域常用的方案26,27。此外，为实现无创操作，我们未进行动脉插管以重复测量血气，尽管此类操作可与本方法结合使用26。
我们的方法整合了两个系统：基于纳米注射的脑内注射系统28和激光散斑对比成像（LSCI）系统29。实验人员必须接受这两个系统的操作培训，才能成功完成该实验操作。由于LSCI系统占据了小鼠头部上方的全部空间，将注射臂倾斜45o不仅有助于实现脑内注射，还能确保两个系统之间的兼容性。该装置对实验的成功至关重要。
对于初学者使用纳米注射器引导的囊胚内细胞团注射技术，需要大量练习才能掌握用一只手使用镊子分离肌肉组织，同时用另一只手操作显微操纵器引导玻璃移液管的协调动作。良好的激光光源和带关节臂的体视显微镜对于手术过程中的最佳可视化至关重要。
利用该方法，我们评估了经典血管扩张剂（如DHPG、乙酰胆碱和腺苷）对脑血流量（CBF）的影响。正如预期，这三种血管扩张剂均能增加CBF；然而，它们诱导的动态变化各不相同。DHPG引起CBF急剧上升，随后缓慢衰减；而乙酰胆碱则导致CBF逐渐升高。相比之下，腺苷仅引起CBF短暂性升高。
该方法也应适用于大鼠模型。然而，由于大鼠颅骨厚度约为 0.5–1 mm，需对其进行减薄处理，以便进行激光散斑对比成像。此外，尽管当前方法可调整用于头部固定状态下的清醒小鼠，但仍需要进行大量训练，以尽量减少动物在实验过程中的运动。我们使用了有限数量的小鼠来演示本方法，因此本研究在统计学上存在局限性，从研究结果中得出广泛结论时应谨慎对待。
为获得一致且可靠的脑血流量（CBF）测量结果，实验人员需认识到其他生理参数（如体温、血压和CO₂）的影响至关重要。2 水平在全面的生理学评估中起着关键作用，应在今后的研究中予以充分考虑。总之，我们提出了一种新的 体内 研究小鼠脑血流（CBF）调节的方法。该方法精确且创伤小，非常适合用于研究药物诱导的CBF动态变化。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（NS108763、NS127392、NS125788、NS125677）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (RS)-3,5-二羟基苯基甘氨酸 | Tocris | Cat. No. 0342 | |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma | A6625-25G | |
| 腺苷 | Sigma | A9251-25G | |
| 70% 异丙醇酒精棉片 | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| AmScope SM-8T 系列可调臂变倍体视显微镜 | AmScope | SM-8TZ-144S-10M | |
| Aquasonic 清澈超声传导凝胶 | AquasonicGel | PLI 03-50 | |
| 数字式小鼠立体定位仪 | Stoelting | 51730D | |
| 乙醇 | Sigma | 459836-2L | |
| Fiber-Lite DC950 光源照明器 | Dolan-Jenner industries | DC950H | |
| 玻璃替换件 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | |
| Kimtech Science 精密擦拭纸 | Kimberly Clark Professional | 5511 | |
| 激光散斑对比成像仪 | moor instruments | MOORFLPI-2 | |
| Lasik 眼科探针（每箱100支） | hospeq | BV40815 | |
| MICROFIL 柔性针头 | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| 矿物油 | Sigma | M5904 | |
| 小鼠加热垫 | Fisher scientific | 50-195-4000 | |
| Nair 可可脂脱毛乳液 | Amazon | ASIN : B000GCW5CS | |
| NANOLITER 2020 微量注射器 | World Precision Instruments | NANOLITER2020 | |
| P-2000 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Puritan® 棉签，棉质头，木杆 | Puritan Medical | 806-WC | |
| 无菌眼用润滑剂 | Medi-Vet | 11897 | |
| 氨基甲酸乙酯 | Sigma | U2500 | |
| Vetbond 组织胶水 | World Precision Instruments | VETBOND | |
| α-氯醛糖 | Sigma | 23120 |
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