本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法作为一种开创性的癌症治疗方法，在治疗某些血液系统恶性肿瘤（如淋巴瘤和白血病）方面取得了前所未有的成功。然而，随着越来越多的癌症患者接受CAR-T细胞治疗，与治疗相关的继发性原发性恶性肿瘤的报道也逐渐增多，部分原因在于CAR转基因的意外插入，这引发了严重的安全性担忧。为解决这一问题，本文介绍了一种非病毒、非整合的方法，通过mRNA技术生成瞬时表达的CAR-T细胞。我们采用电穿孔法将编码人表皮生长因子受体2（HER2）特异性CAR的修饰mRNA导入T细胞，从而获得瞬时靶向HER2的CAR-T细胞。电穿孔后第1天，CAR在T细胞表面高效表达，第2天表达水平升高，至第5天则显著下降。这些瞬时CAR-T细胞对HER2阳性的SKOV-3卵巢癌细胞表现出强烈的细胞毒性，并分泌高水平的干扰素-γ（IFN-ϒ）。本实验方案提供了小规模制备瞬时CAR-T细胞的逐步操作指南，详细描述了CAR mRNA的制备、T细胞的活化与转染、CAR表达水平的检测以及CAR-T细胞功能的体外分析。该方法适用于临床前研究和临床研究中瞬时CAR-T细胞的制备。
引言
癌症正日益成为威胁人类健康的重要因素，全球每年估计有2360万例新诊断病例和1000万例死亡病例1。对于多种局部性的非侵袭性和侵袭性癌症，手术联合放疗和化疗仍是治疗的金标准2,3,4。尽管传统的系统性治疗在早期癌症管理中取得了巨大成功，但其毒性显著，且对转移性及血液系统癌症疗效有限5。患有此类癌症的患者需频繁接受治疗，承受显著的毒性反应，以期稳定病情并延缓疾病进展。嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法近年来作为一种革命性的靶向治疗手段崭露头角，在B细胞血液系统癌症中展现出强大疗效，为这些迫切需要治疗的患者带来了希望6。
CAR-T细胞是经过基因工程改造的T淋巴细胞，其细胞表面表达一种嵌合抗原受体（CAR），可特异性识别肿瘤相关抗原（TAAs），并在无需主要组织相容性复合物蛋白（MHC）呈递抗原的情况下激活细胞7。激活后，CAR-T细胞可分泌一系列细胞因子，并以非MHC依赖的方式裂解肿瘤细胞，从而在免疫抑制性肿瘤微环境导致MHC下调或缺失的情况下仍能增强对肿瘤的杀伤作用8<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究所用的外周血单个核细胞（PBMC）系先前根据机构审查委员会（IRB）批准的方案（13942），采用先前所述的Ficoll-Paque密度梯度法42，从斯坦福医院血液中心提供的全血中分离获得。由于我们用于获取PBMC的血液系从斯坦福医院血液中心商业购得，因此无需获得参与者的知情同意。
1. CAR mRNA 的制备
- 模板制备
注意：线性化质粒或PCR片段均可作为合成CAR mRNA的模板 体外，前提是它们包含适当的5' SP6或T7启动子、5'非翻译区（UTR）、CAR转基因以及带有合适poly(A)尾的3'UTR。在本研究中，我们使用了一种CAR质粒DNA构建体，其包含SP6启动子、一段短的人β-珠蛋白5'UTR、CAR转基因，以及由两个串联的β-珠蛋白3'UTR组成并后接一段112 bp poly(A)尾的3'UTR43UTR、编码序列和poly(A)尾均影响RNA的稳定性和翻译效率43,44,45120 bp的poly(A)尾已被证明与较短的poly(A)尾相比可提高细胞培养中的蛋白产量
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们构建了一种第二代靶向HER2的CAR，其包含一个源自人源化抗HER2小鼠单克隆抗体（mAb）4D5的scFv47，一个跨膜区，以及胞内4-1BB共刺激结构域，其后接CD3ζ激活结构域（图1A）。编码CAR的DNA序列包含一个5' SP6启动子，用于驱动CAR mRNA的转录 体外 (图1B）。CAR mRNA 长度约为 2 kb，通过凝胶电泳验证图1C).
随后通过电穿孔将CAR mRNA转染至活化的T细胞中，操作步骤如上所述。电穿孔后一天，超过50%的细胞表达CAR，而未转染mRNA的对照T细胞则不表达CAR（图2A）。CAR-T细胞的比例在第2天上升至超过70%（图2B），随后在第5天下降至10%（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究中，我们描述了一种详细的非病毒、非整合性方法，用于生成瞬时表达的CAR-T细胞，并提供了评估CAR-T细胞功能的技术操作流程。该方法避免使用传统的逆转录病毒和慢病毒载体进行永久性且随机的CAR转基因递送，而是利用电穿孔技术高效导入 体外 将修饰后的CAR mRNA导入T细胞。该方法可实现T细胞表面高水平、瞬时的CAR表达，显著降低与插入突变相关的继发性恶性肿瘤风险。
为了优化CAR mRNA的翻译，mRNA结构的精心设计至关重要。5'非翻译区（5'UTR）、编码序列、3'非翻译区（3'UTR）以及poly(A)尾均会影响mRNA的稳定性或翻译效率42。在设计mRNA的5'UTR时，通常采用来源于细胞内丰度较高的蛋白质对应mRNA的短5'UTR，例如肌动蛋白（actin）、β-微管蛋白（beta-tubulin）或胶原蛋白（collagen）的5'UTR50。在我们的CAR mRNA构建体中，选用了人β-珠蛋白（human beta-globin）的5'UTR，因其.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者Liang Hu、Robert Berahovich、Yanwei Huang、Shiming Zhang、Jinying Sun、Xianghong Liu、Hua Zhou、Shirley Xu、Haoqi Li和Vita Golubovskaya为ProMab Biotechnologies公司员工。Lijun Wu为ProMab Biotechnologies公司员工及股东。
致谢
本工作由 ProMab Biotechnologies 资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 7-AAD 活性染料 | Biolegend | 420404 | |
| ACEA Novocyte 流式细胞仪 | Agilent | NovoCyte 3000 | |
| AIM-V 培养基 | Gibco | 12055083 | |
| APC 标记的山羊抗人 IgG F(ab')2 抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-136-097 | |
| BglII 限制性内切酶 | New England BioLabs (NEB) | R0144L | |
| 3´-O-甲基-m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构类似物 | NEB | S1411S | |
| DMEM，高糖 | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28 磁珠 | Gibco | 11131D | |
| E-Plate 96 | Agilent | 5232376001 | |
| 乙醇 | Sigma | 459844-4L | |
| FBS | Lonza.com | 14-503F | |
| HiScribe SP6 RNA 合成试剂盒 | New England BioLabs (NEB) | E2070S | |
| 人 IL-2 重组蛋白 | Gibco | 15140122 | |
| Millennium RNA 标记物 | Invitrogen | AM7150 | |
| Monarch RNA 纯化试剂盒 (500 μg) | NEB | T2050L | |
| N1-甲基假尿苷三磷酸 (N1-Methylpseudo-UTP) | Trilink | N-1081-10 | |
| Neon 转染仪 | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 转染系统 100-μL 试剂盒 | Invitrogen | MPK10096 | |
| 青霉素-链霉素 (10000 U/mL) | Gibco | 14-503F | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875135 | |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红 | Gibco | 25300120 | |
| UltraPure 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593049 | |
| xCELLigence 实时细胞分析 (RTCA) 仪器 | Agilent | RTCA MP | |
| ZymoPURE II 质粒中量提取试剂盒 | Zymo Research | D4201 |
参考文献
- Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376(2021).
- Jordan, R. M., Oxenberg, J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
