本方案描述了一种简单且经济的方法，用于评估潜在光敏剂在抗菌光动力失活（aPDI）中的效果，采用96孔板结合LED面板光源进行实验。该方法可同时测试多种实验条件，包括不同浓度、不同化合物以及不同细菌菌株。
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摘要
摘要
多重耐药性感染的上升以及新型抗生素类别的缺乏，重新激发了人们对光动力灭活细菌（aPDI）等替代疗法的兴趣。该过程涉及使用光敏剂（PS），并在合适可见光源的激发下，产生活性氧（ROS）的显著增加，从而破坏关键的细胞生物分子，最终导致细菌细胞死亡。建立标准化、易于操作且可重复的初步测试方法，以评估和比较潜在光敏剂的光诱导光毒性的有效性，具有重要意义。本研究介绍了一种简单高效的体外（in vitro）技术，用于评估对浮游细菌细胞的光动力活性。通过采用96孔微孔板结合大面积LED面板的系统，可实现对多种化合物的系统性评价。该配置可在受控且一致的环境中进行高通量筛选潜在光敏剂，简化了筛选有前景候选物以进一步开发的过程。这一灵活的平台是推动创新性光动力疗法发展、应对抗生素耐药性感染的重要一步。
引言
光动力疗法（PDT）是一种微创治疗手段，近年来展现出良好的应用前景，尤其在皮肤科临床治疗中表现突出1。该治疗方式一个特别值得关注的应用领域是微生物感染的治疗，这一过程被称为抗菌光动力失活（aPDI）2。尽管由于抗生素具有显著的疗效，光触发杀灭细菌的方法最初未受到足够重视，但近年来随着抗菌多重耐药性（AMR）的出现以及应对这一公共卫生问题对替代性高效策略的需求，该技术重新受到关注3,4。通过精准照射目标区域以及治疗过程的开关控制特性，可在数秒至数分钟内实现显著的杀菌效果，具有高度的空间和时间精确性。
光动力作用原理的机制依赖于光敏分子（光敏剂）、分子氧和外部光源的结合。尽管这三种组分各自无害，但当它们共同作用时，光敏剂在光照激活下可能对靶细胞产生致命效应。光触发反应会大量产生活性氧物质（ROS），最终导致细胞关键组分发生严重且不可逆的损伤，从而引起细胞死亡5,6。此外，光动力抗菌疗法（aPDI）与其他传统抗菌治疗手段联合使用已显示出良好的治疗效果，包括提高治疗有效性、缩短治疗时间以及降低药物剂量7。
此外，光动力疗法（PDT）中光敏剂（PS）的局部给药可实现靶向治疗，对周围组织损伤极小，且全身性影响较低，因此成为治疗浅表皮肤感染的一种广受认可的选择8。局部治疗的便利性以及许多皮肤感染和病变的表浅特性，使其成为PDT的理想应用目标。已有研究证实，aPDI在治疗烧伤感染、手术伤口感染、溃疡性病变以及其他浅表性疾病（如痤疮和脓疱病）方面具有良好的疗效9,10,11。
许多天然和合成分子已被测试并提议用于抗菌光动力灭活（aPDI）。然而，由于实验方案中使用的参数各不相同且常未明确说明，导致结果难以比较，影响了科学发现的清晰性。建立简单且可重复的测试方法有助于快速筛选大量化合物，加快有前景候选分子的识别。在早期测试阶段，简便、可重复且成本较低的实验方案尤为宝贵，因其能够实现不同研究机构之间结果的相互比较。高效的筛选流程也有助于更广泛地探索各类分子，从而可能发现并筛选出新的光敏剂，用于后续更先进、复杂且成本更高的方法中的进一步测试。
本方案概述了一种利用光强为 25 mW/cm2 的 LED 面板评估潜在光敏剂对细菌光毒性的简便方法。实验选用代表性细菌菌株 S. aureus，并选择白光通道，以实现对可见光谱的全覆盖。实验步骤包括 30 分钟的预孵育，随后进行 15 分钟的光照（22.5 J/cm2）。尽管实验结果基于上述特定条件，但该方法可根据具体实验需求进行调整。明确界定这些参数并将其纳入实验描述中至关重要。
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方案
该实验方案的整体描述见图1。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 细菌培养物的制备
- 从储备菌种中在穆勒-欣顿琼脂（MH）上培养S. aureus（ATCC 29213）细菌。在进行实验前，将MH平板于37 °C培养24 h，以获得新鲜菌种。
- 接种细菌：从琼脂平板上挑取2-3个新鲜菌落，溶于6 mL预热的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，经无菌过滤）中。
- 将接种液涡旋振荡（1200 rpm）3-4次，以确保样品充分均质化。取出3 mL至一次性比色皿中。
- 测定OD600，并用PBS调节至0.1（约1 × 108 CFU/mL）。
注意：OD值与CFU的换算关系可能因S. aureus菌株不同而有所差异。可针对特定菌株及实验室实验条件建立标准生长曲线以确定准确换算关系。
2. 光敏剂的制备
- 储备液：将目标光敏剂化合物（详见结果部分）溶于适当的溶剂中（例如 DMSO 或 PBS）配制储备液（图 2）。
- 工作液：用 PBS 稀释储备液。使用 PBS 而非细菌培养基可确保培养基成分不会干扰 aPDI 实验中的光吸收。
- 涡旋震荡样品以确保完全均质化。如有必要，使用超声水浴以保证完全溶解并获得澄清溶液（此时应谨慎控制条件）。对于疏水性化合物，可能需要调整溶剂体系（例如添加一定比例的 DMSO 或乙醇）。务必始终检测溶剂对细胞活力的影响。
注意：超声处理的条件取决于化合物类型、浓度和溶剂体系；对于易溶化合物，较短时间（例如 5 分钟）可能已足够，而对于高度疏水的化合物，则可能需要较长的超声时间（20–30 分钟）。
3. 培养板设置
- 准备两个独立的96孔板：一个用于光照处理，另一个置于黑暗环境中（暗对照）。
- 在每块板中，将100 µL光敏剂溶液与100 µL细菌悬液混合，上下吹打5–10次。
- 将板在37 °C下孵育一段预设时间（本研究中采用30分钟），以使光敏剂与细菌细胞充分作用。
4. 照射
- 从培养箱中取出培养板，将其中一块暴露于LED面板发出的光线下（本实验所用设备为50 W功率的矩形LED投影仪；IP65防护等级；输入电压：交流85–265 V），另一块则避光保存。
- 将一块培养板放置在LED面板上方。为确保在多次重复实验过程中培养板位置的精确一致，可在LED表面直接标记96孔板的边缘位置。
- 对培养板进行适当的照射时间（本研究中采用15分钟）。
注意：需确保光照剂量足以激活光敏剂，同时不损害细胞活性。因此，必须设置光照对照组（即在无光敏剂存在下暴露于光照的细菌）。
5. 辐照后处理及琼脂平板取样
- 使用另一块96孔板制备样品（对照、未辐照和辐照孔）的系列稀释液。
- 根据样品数量，每孔加入180 µL PBS。为合理规划布局，需注意每个样品的系列稀释需要6个孔组成的一行（10倍梯度稀释，从10−1至10−6）。
- 从辐照和未辐照的96孔板中各取20 µL，分别加入已预先加入PBS的96孔板的第一列孔中。
- 使用多通道移液器，从第1孔到第6孔进行简单的系列稀释（10-1至10-6）。注意：此时样品的充分混匀至关重要，以确保混合均匀一致。每步稀释均需上下吹打5–10次。
- 将琼脂平板均分为六个区域，每个区域对应一种稀释度（见图3）。
- 从每个孔中取10 µL，分别点样于琼脂平板对应区域表面（每个样品至少设置3个重复）。避免点样位置过于靠近。轻柔地将琼脂平板转移至培养箱，静置培养18–20小时。
注意：需注意菌落形态因细菌种类不同而有显著差异。例如，S. aureus菌落相对容易计数，而P. aeruginosa则倾向于形成较弥散的菌落类型。可根据此情况调整重复次数。
6. 细胞活力测定（菌落形成单位计数）
- 从培养箱中取出琼脂平板，选择适合进行细胞计数的区域。
注意：避免在菌落密集、重叠或边界不清晰的区域进行计数。 - 在每个区域内，计数菌落形成单位（CFU）的数量，并计算3个重复样本的平均值。
- 将计得的CFU数量换算为CFU/mL，即用平均计数值乘以稀释倍数，再除以接种的培养液体积（mL）。
7. 数据分析
- 将CFU/mL的数据转换为对数尺度，并以log10|CFU/mL|表示细胞存活率随测试浓度的变化关系。
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结果
基于氨基的花色素化合物（图2）：7-二乙氨基-4′-二甲氨基花色素（7NEt24′NMe2）、7-二乙氨基-2-(二甲氨基苯乙烯基)-1-苯并吡喃鎓（7NEt2st4′NMe2）、7-二乙氨基-4′-氨基花色素（7NEt24′NH2）和7-二乙氨基-4′-羟基花色素（7NEt24′OH），其光响应特性此前已有报道12,13，将这些化合物与S. aureus共孵育30分钟，随后使用LED光源发出的白光进行光照处理（图4）。经15分钟照射（对应光通量为22.5 J/cm2）后，观察其对细胞活力的影响（见图5）。在测试浓度范围内，所有化合物均未表现出细胞毒性，...
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讨论
尽管本方案可作为初步的测试平台，但在更深入的研究阶段，应考虑采用更具临床意义的测试条件来治疗微生物感染。在评估aPDI疗效时，应针对生物膜型细菌结构而非浮游细菌开展实验。许多临床病例涉及以这种更具耐受性形式存在的微生物，例如慢性伤口、囊性纤维化以及植入式医疗设备上的感染14。
需要注意的是，虽然使用白光发光LED可以覆盖整个可见光范围，但它并不能提供与特定光敏剂吸收光谱相匹配的光源。然而，在筛选不同化合物以寻找潜在光活性分子时，这可能并非严格要求。此外，使用激光器的成本较高。因此，在此阶段，采用LED面板来测试在相同波长范围内但具有不同吸收峰的多种分子，是一种更为便捷且经济的替代方案。考虑到局部治疗的应用方式，LED设备是一种更可行且多功能的选择，因为可以以较低的成本构建覆盖更大面积的不同装置15,16。
S. aureus 被用作代表性细菌菌株...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由FCT项目FERMEN.TO - 通过发酵食品应对代谢综合征：一种综合的体外动态方法（2023.00164.RESTART）提供资金支持。本工作还得到了绿色化学联合实验室LAQV（LA/P/0008/2020 https://doi.org/10.54499/LA/P/0008/2020；UIDP/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDP/50006/2020；UIDB/50006/2020 https://doi.org/10.54499/UIDB/50006/2020）的支持，该实验室由FCT/MCTES通过国家资金资助。P.C. 感谢FCT为其提供的博士奖学金（SFRH/BD/150661/2020）。Iva Fernandes 感谢其助理教授合同（https://doi.org/10.54499/CEECINST/00064/2021/CP2812/CT0004）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卡里60紫外-可见分光光度计 | 安捷伦 | G6860A | |
| 二甲基亚砜 | 西格玛-奥德里奇 | D8418 | |
| 一次性PMMA比色皿 | 布兰德有限公司 | 759030 | |
| 离心管（500 mL） | 菲舍尔科技公司 | 15625367 | |
| 费尔森管（15 mL） | 康宁公司 | 430791 | |
| 费尔森管（50 mL） | 康宁公司 | 430291 | |
| LED面板IP65 50W | |||
| 微量移液器（100 µL） | Transferpette S | 705874 | |
| 微量移液器（1000 µL） | Transferpette S | 705880 | |
| 穆勒-欣顿琼脂 | Oxoid | CM0405 | |
| 12通道多通道移液器 | Transferpette S | ||
| Nunc 96孔微孔板 | 赛默飞世尔科技 | 260844 | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 pH 7.4 | 潘瑞亚克-阿佩尔化学 | A9177 | |
| 血清移液管（10 mL） | 赛默飞世尔科技 | 170356N | |
| 血清移液管（5 mL） | 赛默飞世尔科技 | 170366N | |
| 组织培养皿 | TPP 技术塑料制品股份有限公司 | 93150 |
参考文献
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