在插入诱变细胞文库中鉴定功能相关的慢病毒整合位点

摘要

插入诱变是正向遗传学中鉴定功能基因组元件的重要工具。在这里，我们描述了基于插入的功能元件和转录本筛选 （InSET），这是一种在基于慢病毒的插入诱变细胞库中检测慢病毒整合位点的方法。

摘要

人类基因组中功能序列的范围是生物学中一个关键但有争议的话题。尽管高通量反向遗传筛选在探索这一点方面取得了长足的进步，但它们通常将其范围限制在已知的基因组元件上，并可能引入非特异性效应。这凸显了对新型功能基因组学工具的迫切需求，这些工具能够更深入、公正地理解基因组功能。该协议引入了基于插入的功能元件和转录物筛选 （InSET），这是一种在基于慢病毒的插入诱变细胞库中识别慢病毒整合位点的方法。InSET 有助于捕获全基因组慢病毒整合位点，并使用下一代测序来检测和定量侧翼序列。InSET 的设计能够大规模分析表型筛选中的整合位点丰度变化，使其成为正向遗传学和识别功能基因组元件的强大工具。InSET 的一个主要优势是它能够揭示以前未识别的基因组元件，包括蛋白质编码和非编码 RNA 的新型功能外显子，而与先前的注释无关。总体而言，InSET 在研究人类基因组和转录组的复杂复杂性方面具有重要价值，其中许多基因组元件有待功能表征。

引言

即使在后基因组时代，功能基因组学仍然是一个关键且具有挑战性的领域，很大一部分基因组区域仍然缺乏功能表征。这些挑战的一个关键原因在于人类基因组和转录组的复杂性，其特征是在蛋白质编码和非编码区都存在普遍的转录和普遍的选择性剪接^{1，2，3，4，5}。这种复杂性在RNA靶向富集研究中得到了广泛强调^{6，7，8，9}。人们越来越认识到，除了人类基因组中注释良好的片段外，许多新的基因组元件仍然未映射且功能上未注释^10，11，12

。

近年来，逆向遗传学工具取得了进步，如RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas系统^{13，14，15，16，17，18，19，20，21}. 然而，这些方法具有明显的缺点，包括非特异性效应和与生成短发夹 RNA （shRNA） 或单向导 RNA （sgRNA） 的复杂文库相关的高成本^{22，23，24，25}.此外，这些方法主要关注注释的基因组元件。相比之下，正向遗传学具有识别新的、未注释的功能基因组元件的优势。鉴于人类基因组和转录组的复杂性，以及大量新的基因组元件，这种正向遗传学的能力非常重要。

正向遗传学细胞文库通常是通过随机逆转录病毒整合生成的，这使得全基因组整合位点的有效检测对于正向遗传学测定至关重要。检测这些整合位点通常涉及基因组行走工具²⁶。虽然这些工具已经取得了重大进展，但很少有针对下一代测序 （NGS） 应用进行了优化，并随后应用于插入诱变研究。细胞系中的插入诱变通常利用反向 PCR （I-PCR） 或线性扩增介导的 PCR （LAM-PCR） 等方法来检测整合位点^27，28，29。然而，这些方法通常需要限制性内切酶消化或连接步骤，这会降低效率并在结果中引入偏差。

为了提高正向遗传学筛选中全基因组整合位点的高效检测，这里介绍了一种称为基于插入的功能元件和转录本筛选 （InSET） 方法的方法。通过将基因组行走与 NGS 相结合，InSET 能够在基于慢病毒的插入诱变文库中对慢病毒整合位点进行高通量鉴定。与现有方法相比^{27，28，29，InSET}相对简单明了，省去了限制性内切酶消化或连接步骤，更加方便易用。此外，尽管哺乳动物细胞中现有的正向遗传学筛选仅限于极少数单倍体或近单倍体细胞系^{27，28，29，30，31}，但InSET已被证明在非整倍体细胞系中有效³²。

本研究为实施 InSET 方法提供了详细的分步方案。此外，它还演示了 InSET 在插入诱变研究中的应用。InSET 是鉴定基因组元件中新外显子的强大工具，包括人类细胞系中的蛋白质编码和非编码 RNA。

方案

图 1 提供了 InSET 方法的示意图概述。为获得最佳覆盖度，从 1 μg 基因组 DNA 中制备 5 个平行文库，然后合并用于下一代测序。此过程已在之前的测试中连续成功完成，但用户可能会根据自己的判断引入暂停点。有关本研究中使用的试剂和设备的详细信息，请参阅材料表。

1. 捕获基因组中的慢病毒整合位点

1. 使用从基于慢病毒的插入诱变细胞文库中分离的基因组 DNA （1 μg），如之前的研究所述³²，作为在 50 μL 反应中进行线性 PCR 的模板，在 PCR 管中含有 1x Taq 缓冲液、2.5 U Taq DNA 聚合酶、4 μL dNTP 混合物（每个 2.5 mM）和 0.3 μM 生物素化引物 3-LTR_prime（表 1）在 PCR 管中><。 注：3-LTR_prime引物退火到慢病毒序列的 LTR 区域。如果它与 5' LTR 退火，则扩增的片段包括侧翼基因组序列。如果它与 3' LTR 退火，则扩增的片段包含一个内部慢病毒序列，该序列无法与宿主基因组对齐，因此在下游测序数据分析过程中会被过滤掉。该引物也可以进行修饰，以适应用于生成插入诱变细胞文库的其他类型的载体。
2. 在标准 PCR 热循环仪中进行 50 个线性 PCR 循环，开始时加入 2.5 U Taq DNA 聚合酶，25 个循环后立即再次加入。PCR 条件如下：94 °C 5 分钟;94 °C 30 秒、55 °C 30 秒和 72 °C 30 秒的 50 次循环;72 °C 持续 5 分钟
   注：为了在长时间的反应中保持 Taq DNA 聚合酶的活性，建议在反应的开始和中点添加酶。
3. 将 PCR 产物转移至新的干净 1.5 mL 离心管中。
4. 将 PCR 产物与 10 μL 生物素-链霉亲和素磁珠充分混合。
5. 将混合物在室温下孵育 2 小时，在金属浴中以 400 rpm 的速度振荡。
   注意：每 15 分钟取出试管与移液管充分混合。
6. 使用磁力架收集磁珠，然后小心地去除上清液。
7. 用 300 μL 结合/洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl （pH 7.5）、1 mM EDTA、1 M NaCl、0.1% Tween-20）洗涤珠子 6 次，并弃去上清液。
8. 用 300 μL （65 °C） 不含 DNase/RNase 的蒸馏水洗涤两次，然后弃去上清液。
9. 对于第二链合成，将珠子重悬于 24 μL 反应体积中，在 PCR ><管中含有 1x Klenow 片段缓冲液、2 μL dNTP 混合物（每个 2.5 mM）和 6.25 μM P5_N6引物（表 1）。 注：制备 100 μM P5_N6引物储备液。P5_N6引物由 5' 端的固定 P5 接头序列和 3' 端的随机六聚体序列组成。随机六聚体可与多种靶序列结合，使其适用于扩增线性 PCR 产生的各种 DNA 片段。
10. 将混合物在 PCR 热循环仪中于 15 °C 预孵育 20 分钟。
11. 加入 2 U Klenow 片段（大片段大肠杆菌 DNA 聚合酶）。
在
12. 以下条件下在 PCR 热循环仪中孵育混合物：以 0.5 °C/min 的速度从 15 °C 缓慢升至 25 °C，然后孵育 30 分钟;然后以 0.5 °C/min 的速度缓慢升温至 37 °C，然后孵育 1 小时。
13. 将 PCR 产物转移至新的干净 1.5 mL 离心管中。
14. 使用磁力架捕获磁珠，然后丢弃上清液。
15. 用 300 μL 4 °C 不含 DNase/RNase 的蒸馏水轻轻洗涤珠子。收集珠子并丢弃上清液。

2. 用巢式 PCR 构建 NGS 文库

将
1. 步骤 1.15 中的珠子重悬于 25 μL PCR 反应体积中，该体积含有 1x Taq 缓冲液、1.25 U Taq DNA 聚合酶、0.5 μM 引物 P5（表 1）、2 μL dNTP 混合物（每个 2.5 mM）和 0.5 μM 引物 3-LTR_Nest（表 1）在 PCR 管中。
2. 在以下条件下在 PCR 热循环仪中进行 PCR 反应：94 °C 3 分钟;94 °C 30 秒、55 °C 30 秒和 72 °C 30 秒的 20 个循环;72 °C 7 分钟。
3. 使用 5 μL 步骤 2.2 中的 PCR 产物作为下一轮 PCR 的模板，体积为 50 μL，含有 1x Taq 缓冲液、2.5 U Taq DNA 聚合酶、4 μL dNTP 混合物（每个 2.5 mM）、0.4 μM 引物Illumina_P5（表 1）和 0.4 μM 引物 Illumina_P7-3LTR（表 1）。
4. 在以下条件下在 PCR 热循环仪中进行 PCR 反应：94 °C 3 分钟;94 °C 30 秒、55 °C 30 秒和 72 °C 30 秒的 15 个循环;72 °C 7 分钟。
5. 将 PCR 产物转移到干净的 1.5 mL 离心管中。
   注意：可以在此步骤中暂停方案，并且样品可以储存在 -20 °C。
6. 使用 1.2 倍体积的 DNA 清洁珠纯化 PCR 产物，使最终体积达到 21 μL。
   注：从平行制备的 5 个文库中各取 10 μL PCR 产物，将它们合并在一起，纯化至最终体积为 21 μL。PCR 产物的纯化方案改编自制造商对 DNA 清洁微珠的说明（参见材料表）。
   1. 将珠子从 2-8 °C 平衡至室温 30 分钟。
   2. 通过倒置或涡旋彻底混合珠子。
   3. 将 1.2 倍体积的磁珠移液到干净的 1.5 mL 离心管中。
   4. 将 PCR 产物加入珠子中，上下吹打 10 次彻底混合。
   5. 在室温下孵育 5 分钟，使 DNA 与磁珠结合。
   6. 将样品放在磁力架上，溶液澄清后（约 5 分钟）去除上清液。
   7. 加入 200 μL 80% 乙醇洗涤珠子，在室温下孵育 30 秒，然后去除上清液><。 注意：80% 乙醇应新鲜制备。
   8. 重复步骤 2.6.7 一次。
   9. 在室温下风干珠子，打开盖子约 5 分钟。
   10. 从磁力架上取下试管，加入 22 μL 不含 DNase/RNase 的蒸馏水，上下吹打 10 次充分混合，在室温下静置 2 分钟。
   11. 将试管放在磁力架上，直到溶液澄清（约 2 分钟），然后将 21 μL 上清液转移到干净的 1.5 mL 离心管中><。 注意：可以在此步骤中暂停方案，并且样品可以储存在 -20 °C。
7. 使用 1 μL 纯化的 PCR 产物，使用荧光计和市售的 dsDNA 荧光检测试剂盒测量浓度（参见材料表）
   注：浓度测量方案遵循 dsDNA 检测试剂盒的制造商说明。
   1. 将试剂和缓冲液（试剂盒中提供）以 1：200 的比例混合，制备工作溶液。
   2. 通过将 10 μL 标准品 #1 和 10 μL 标准品 #2（在试剂盒中提供）混合制备检测标准品，每剂样品与 190 μL 工作溶液混合。轻轻涡旋混合物 2-3 秒。
   3. 通过将 1 μL 纯化的 PCR 产物与 190 μL 工作溶液混合来制备检测样品。轻轻涡旋混合物 2-3 秒。
   4. 将检测标准品和检测样品在室温下孵育 2 分钟，避光保存。
   5. 打开 Fluorometer（荧光计）。
   6. 从主菜单中选择 dsDNA High Sensitivity 程序。
   7. 校准时，将标准 #1 插入机器，按下读取标准按钮测量第一个标准，然后插入标准 #2 并按下读取标准按钮测量第二个标准。
   8. 对于样品测量，按 Run samples（运行样品）按钮进入样品测量页面。插入每个含有检测样品的试管，然后按下读取试管按钮以获得浓度。
      注意：可以在此步骤中暂停方案，并且样品可以储存在 -20 °C。
8. 使用双端 150 bp （PE150） 策略在 30 GB 规模的 Illumina 平台上进行 NGS><。 注意：此步骤通常外包给测序公司。

3. 数据分析

注意：本节以人类细胞系中的分析为例。

1. 慢病毒整合位点的映射
   1. 使用 fastp 工具过滤掉低质量碱基超过 50%（Phred 评分 <20）、超过 15 个"N"碱基或短于 150 个碱基的测序读长³³（参见材料表）。
   2. 仅选择读取 2 以 LTR 标签"GCCTTGTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      开头的双端读取 ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      注意：该序列取决于用于生成插入诱变细胞文库的载体序列。
   3. 从步骤 3.1.2 中选择的读数中修剪 LTR 标签序列。
   4. 使用默认设置的 BWA-MEM ^{34（请参见材料表）将修剪的读数与 GRCh37/hg19 对齐}。
   5. 仅保留读取 1 和读取 2 都以正确的配置和间距唯一映射到基因组的读取对，如 FLAG 147 和 FLAG 163 所示。
   6. 将插入位置定义为 trimmed read 2 的第一个对齐基底。
   7. 将每个唯一插入位点的读取计数标准化为每个样品中唯一对齐的读取总数。
2. 识别影响细胞适应性 （IACF） 的插入
   注意：在统计分析中，建议对对照和处理样品的三个生物学重复进行成对比较，以确定显着富集或耗尽的位置。上面提到的重复次数最少。建议尽可能多地使用重复，以确保结果的可靠性和准确性。
   1. 将每个位置的标准化读取计数转换为对数₁₀ 个值。
   2. 将零读数位置的对数₁₀ 值设置为 −5。
   3. 对对数₁₀ 值执行双侧配对 Student t 检验。
   4. 在 R 环境中使用 Benjamini-Hochberg 方法调整多重比较的 p 值。
   5. 选择错误发现率 （FDR） 阈值为 25% 的位置作为 IACF。
3. 鉴定影响细胞适应性的簇 （CACFs）
   注：建议对对照和处理样品进行三次生物学重复进行此分析。
   1. 使用 SICER^{35（参见材料表）确定对照样品和处理样品之间显着富集或耗尽的插入簇}，FDR 阈值为 1%。用于 SICER 分析的命令是 "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      注：上述命令中参数的含义如下：["InputDir"] ["处理过的样品插入位点床文件"] ["对照样品插入位点床文件"] ["输出目录"] ["物种"] ["冗余阈值"] ["窗口大小 （bp）"] ["片段大小"] ["有效基因组分数"] ["间隙大小 （bp）"] ["E 值"]。
   2. 使用 BEDTools suite^{36 的"intersect"功能获得至少两个生物重复共享的簇区域}（参见材料表），并将这些簇区域表示为 CACF。

结果

NGS 文库的质量控制评估通常由测序提供商进行，作为测序前的标准质量检查。为了证明文库质量的影响，比较了两个样品。使用标准巢式 PCR 方案制备标记为 s2-20-15 的高质量文库，该方案由两个连续的扩增步骤组成：第一个步骤 20 个循环，第二个步骤 15 个循环。相比之下，标记为 s1-30 的低质量文库是使用 30 个循环的单步 PCR 制备的，以掺入 Illumina 接头。

如表 2 所示，与高质量样品相比，通过荧光和 qPCR 测量时，低质量样品的文库浓度较低。值得注意的是，qPCR 浓度测量是比荧光测量更可靠的 NGS 文库质量指标。使用生物分析仪进一步分析文库。在低质量样品中，83 bp 左右的主峰表明接头蛋白二聚体污染（图 2）。相比之下，高质量 NGS 文库显示 150 bp 至 1500 bp 之间的主峰，反映了成功的 InSET 文库的特征（图 2）。

讨论

在正向遗传学分析中，基因组游走对于分析插入诱变细胞文库中的整合位点至关重要。I-PCR 和 LAM-PCR 等经典基因组行走方法通常需要限制性内切酶消化和连接，这可以降低文库复杂性并由于酶位点依赖性而引入偏差 27,28,29。InSET方法通过消除限制性酶切和连接步骤克服了这些限制。它类似于侧翼序列指数锚定PCR（FLEA-PCR^）37，但通过省略使用阻断寡核苷酸来避免扩增逆转录病毒内部序列，进一步简化;相反，在 NGS 数据分析期间，这些序列被删除。InSET 专为 NGS 应用而设计，非常适合检测插入诱变细胞文库中的整合位点。该方法简单明了，用户友好，大约需要 9 小时来制备 NGS 文库。

InSET方案涉及几个关键步骤：（1）线性扩增：使用生物素化引物扩增慢病毒整合位点。然后，生物素-链霉亲和素磁珠捕获这些片段，去除基因组 DNA 污染。（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G	制备结合/洗涤缓冲液
1 M Tris-HCl （Ph 8.0）	Invitrogen	15568025	制备结合/洗涤缓冲液
10&次;Klenow 片段缓冲液	宝	2140A
10 次;Taq 缓冲液	Tiangen	ET101-01-01
5 M NaCl	Invitrogen	AM9659	制备结合/洗涤缓冲液
BeaverBeads 链霉亲和素	Beaver	22307-1	1 μm
BEDTools		软件，v2	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEM			软件，v0.7.12
dNTP 混合物	Takara	4030	每个 2.5 mM
等位 dsDNA HS 检测试剂盒	Vazyme	EQ111-02
fastp			软件
HiSeq X Ten	Illumina	SY-412-1001	Illumina 平台，外包给 Novogene Corporation （北京）Klenow
Fragment	Takara	2140A
NovaSeq 6000	Illumina		20012850 Illumina 平台，外包给 Novogene Corporation （Beijing）Qubit
3.0 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q33216
SICER			软件，v1.1
Taq DNA 聚合酶	Tiangen	ET101-01-01
吐温-20	HuShi	30189328	制作结合/洗涤缓冲液
UltraPure 蒸馏水	Invitrogen	10977015
VAHTS DNA Clean Beads	Vazyme	N411-01