利用HeLa细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗MDA5自身抗体

摘要

我们提供一种用于检测抗MDA5抗体的逐步免疫细胞化学（ICC）方法。该方法包括细胞固定、通透化、抗体孵育和成像技术，可准确检测抗MDA5自身抗体，有助于诊断肌炎患者中快速进展的间质性肺病。

摘要

抗MDA5自身抗体是皮肌炎（DM）、临床无肌病性皮肌炎（CADM）和多发性肌炎（PM）的关键生物标志物，尤其在识别快速进展性间质性肺病（RP-ILD）高风险患者方面具有重要意义。早期检测这些自身抗体对于改善患者预后至关重要，因为诊断延迟常导致不良结局。目前，放射免疫分析法是检测抗MDA5抗体的金标准，但其应用受限于高昂的成本、耗时的流程以及对专业技术的依赖。此外，印迹试验作为一种广泛使用的临床工具，在检测MDA5自身抗体时假阳性率较高，可能影响诊断准确性。为克服这些局限性，我们提出一种非放射性、高灵敏度且标准化的免疫细胞化学（ICC）确证检测方法。该方案包括：用MDA5质粒转染HeLa细胞，使用Triton X-100对细胞进行通透处理，以促进抗MDA5自身抗体与靶抗原的结合，并利用酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶）结合DAB显色剂，通过显微镜成像检测结合的抗体。ICC方法可在细胞结构内直观显示抗MDA5自身抗体，具有操作简便、成本低廉和高灵敏度的优势。本研究旨在将ICC作为补充确证手段，提高抗MDA5抗体检测的可靠性，从而优化DM、CADM和PM患者RP-ILD的诊断与预后评估策略。

引言

特发性炎症性肌病（IIM），通常称为肌炎，是一组异质性的自身免疫性疾病，其特征为慢性肌肉炎症、临床表现多样以及治疗效果各异。常见症状包括肌肉无力、耐力下降和肌痛¹。IIM 的主要亚型包括多发性肌炎（PM）和皮肌炎（DM），而临床无肌病性皮肌炎（CADM）则以类似于 DM 的特征性皮肤皮疹为表现，但无明显或仅有轻微肌肉受累。PM、DM 和 CADM 的主要并发症之一是间质性肺病（ILD），约影响 40% 的患者，且与死亡率升高相关²。

特发性炎性肌病（IIM）中间质性肺病（ILD）的临床病程和预后差异显著。与多发性肌炎（PM）相关的ILD相比，皮肌炎（DM）和临床无肌病性皮肌炎（CADM）相关的ILD（DM-/CADM-ILD）往往对治疗反应较差，预后更差。其中，急性或亚急性ILD在三个月内迅速进展³，病情尤为严重，其五年生存率仅为52%，而进展缓慢或保持稳定的慢性ILD五年生存率为87%。快速进展性ILD（RP-ILD）是急性/亚急性ILD的一种亚型，其特征为呼吸困难迅速发作，并在胸部影像学上可见广泛的肺泡损伤。RP-ILD是一种危及生命的疾病，预后不良，凸显了早期诊断和及时干预以改善患者预后的紧迫性^4,5,....

方案

1. 细胞培养与转染

1. 在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养HeLa细胞。
2. 每2–3天传代一次，或当细胞融合度达到90%–100%时进行传代。
3. 转染前24小时，将7 × 10⁴个HeLa细胞接种至24孔板的每孔中（每孔面积1.9 cm²），使细胞在转染时融合度约为90%。
4. 分别用25 µL低血清培养基稀释500 ng质粒（pENTER-MDA5）和1.5 µL转染试剂。
5. 将稀释后的DNA加入稀释后的转染试剂中（体积比1:1），充分混匀，室温孵育5分钟。
6. 将上述混合物加入前一日接种的细胞中，并立即轻轻振荡混匀，使DNA-脂质复合物均匀分布。确认细胞融合度为80%–90%。
7. 在37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中继续孵育24小时，随后进行免疫细胞化学染色（ICC）。
   注：本实验使用市售载体（pEnter-MDA5）；更多详细信息见材料表。转染效率约为50%。
   转染成功及目标蛋白表达情况可通过转染表达荧光蛋白的质粒并进行Western blot检测目标蛋白表达水平来确认。
....

结果

进行检测的人员对样本的身份信息（包括样本来源的具体患者）设盲，以尽量减少评估过程中的潜在偏倚。然而，尽管健康对照样本未实施设盲，其结果始终清晰且明确。

图1A 显示了转染pENTER-MDA5质粒的HeLa细胞中MDA5的成功表达。为验证转染效率，使用商业化的抗MDA5抗体进行了免疫细胞化学（ICC）检测。约50%的转染细胞中观察到明显的棕褐色胞质染色，表明MDA5蛋白高效表达。相比之下，在相同条件下处理的未转染细胞未显示胞质染色，证实了抗体的特异性以及内源性MDA5表达的缺失。

根据ICC方案，通过放射性免疫沉淀法确认的抗MDA5阳性患者的代表性样本在表达MDA5的HeLa细胞中显示出清晰的棕色胞质染色，而非转染细胞则未被染色（图.......

讨论

我们基于免疫细胞化学（ICC）的抗MDA5自身抗体检测技术相较于传统的条带印迹分析和放射免疫分析具有显著优势。此前，Nombel等通过比较MDA5转染细胞的间接免疫荧光（IIF）与ELISA，在23例抗MDA5阳性皮肌炎患者和22例抗MDA5阴性对照组成的队列中报道了该方法的敏感性和特异性分别为96%和100%¹⁴。然而，该ELISA试剂盒并未商业化，仅限研究用途。在上述研究基础上，本研究重点在于开发并展示基于ICC的检测方案。与放射免疫分析不同，我们的ICC方法不使用放射性物质，因此更安全且更环保。此外，ICC方案相较于放射性标记检测显著缩短了检测周期，从而提高了样本处理效率，并有助于加快临床决策进程。这些特点使我们的方法成为检测抗MDA5自身抗体的一种可靠替代方案，尤其适用于特发性炎症性肌病（IIM）和快速进展性间质性肺病（RP-ILD）的诊断。

我们的免疫细胞化学技术的成功依赖于多个关键步骤。首先，高效的转染至关重要，因为表达水平不理想可能导致结果不一致。其次，固定过程必须严格控制，以保持细胞形态和抗原性。第三，与患者血浆的孵育.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板（每孔1.9 cm²）	Corning	354541
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240062
烧杯	PYREX	1000-600
锥形管（15 mL）	Corning	430052
锥形管（50 mL）	Corning	430290
去离子蒸馏水			我们的去离子蒸馏水使用Milli-Q系统自制（柱1：Quantum TEX，序列号：F4EB53476；柱2：Prepak，序列号：F1CB11442）
经鉴定的胎牛血清	Cytiva	SH30396.03
量筒（50 mL）	VITLAB	64804
Gill II 型苏木精染液	Leica	3801522
含高糖的Hyclone Dulbecco’s 改良Eagle培养基	Cytiva	SH30243.02
Lipofectamin 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019	转染试剂
MDA-5 (D74E4) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	5321
微量离心管（1.5 mL Eppendorf管）	AXYGEN	142503
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	31985070
轨道摇床（可选）	FIRSTEK	S300R
多聚甲醛	Sigma-Aldrich		1×PBS中配制成4%
PBS缓冲液	PRO TECH	ME222605
pENTER-MDA5	Vigene Biosciences Inc.	CH863586
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗人IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	109-035-003
移液器控制器	Thermo Scientific	130165
移液器	GILSON
移液器及吸头（10 µL）	QSP	104-Q
移液器及吸头（200 µL）	QSP	T090-Q
移液器及吸头（1000 µL）	QSP	111-Q
血清学移液管（5 mL）	SPL	91005
血清学移液管（10 mL）	SPL	91010
血清学移液管（25 mL）	SPL	91025
SignalStain DAB底物试剂盒	Cellsignaling	8059	PBS中配制成0.3%