方法文章

利用HeLa细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗MDA5自身抗体

DOI：

10.3791/67575

⸱

2025年10月31日

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1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供一种用于检测抗MDA5抗体的逐步免疫细胞化学（ICC）方法。该方法包括细胞固定、通透化、抗体孵育和成像技术，可准确检测抗MDA5自身抗体，有助于诊断肌炎患者中快速进展的间质性肺病。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

抗MDA5自身抗体是皮肌炎（DM）、临床无肌病性皮肌炎（CADM）和多发性肌炎（PM）的关键生物标志物，尤其在识别快速进展性间质性肺病（RP-ILD）高风险患者方面具有重要意义。早期检测这些自身抗体对于改善患者预后至关重要，因为诊断延迟常导致不良结局。目前，放射免疫分析法是检测抗MDA5抗体的金标准，但其应用受限于高昂的成本、耗时的流程以及对专业技术的依赖。此外，印迹试验作为一种广泛使用的临床工具，在检测MDA5自身抗体时假阳性率较高，可能影响诊断准确性。为克服这些局限性，我们提出一种非放射性、高灵敏度且标准化的免疫细胞化学（ICC）确证检测方法。该方案包括：用MDA5质粒转染HeLa细胞，使用Triton X-100对细胞进行通透处理，以促进抗MDA5自身抗体与靶抗原的结合，并利用酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶）结合DAB显色剂，通过显微镜成像检测结合的抗体。ICC方法可在细胞结构内直观显示抗MDA5自身抗体，具有操作简便、成本低廉和高灵敏度的优势。本研究旨在将ICC作为补充确证手段，提高抗MDA5抗体检测的可靠性，从而优化DM、CADM和PM患者RP-ILD的诊断与预后评估策略。

引言

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特发性炎症性肌病（IIM），通常称为肌炎，是一组异质性的自身免疫性疾病，其特征为慢性肌肉炎症、临床表现多样以及治疗效果各异。常见症状包括肌肉无力、耐力下降和肌痛1。IIM 的主要亚型包括多发性肌炎（PM）和皮肌炎（DM），而临床无肌病性皮肌炎（CADM）则以类似于 DM 的特征性皮肤皮疹为表现，但无明显或仅有轻微肌肉受累。PM、DM 和 CADM 的主要并发症之一是间质性肺病（ILD），约影响 40% 的患者，且与死亡率升高相关2。

特发性炎性肌病（IIM）中间质性肺病（ILD）的临床病程和预后差异显著。与多发性肌炎（PM）相关的ILD相比，皮肌炎（DM）和临床无肌病性皮肌炎（CADM）相关的ILD（DM-/CADM-ILD）往往对治疗反应较差，预后更差。其中，急性或亚急性ILD在三个月内迅速进展3，病情尤为严重，其五年生存率仅为52%，而进展缓慢或保持稳定的慢性ILD五年生存率为87%。快速进展性ILD（RP-ILD）是急性/亚急性ILD的一种亚型，其特征为呼吸困难迅速发作，并在胸部影像学上可见广泛的肺泡损伤。RP-ILD是一种危及生命的疾病，预后不良，凸显了早期诊断和及时干预以改善患者预后的紧迫性4,5,6。

肌炎特异性自身抗体（MSAs）已成为肌炎相关性间质性肺病（ILD）中的关键生物标志物，其中抗MDA5自身抗体具有尤为重要的意义。这些自身抗体常在多发性肌炎（PM）/皮肌炎（DM）/临床 amyopathic 皮肌炎（CADM）相关ILD患者中被检出，并可作为快速进展性ILD（RP-ILD）的重要预后指标7,8,9。MDA5（黑色素瘤分化相关基因5）是一种由干扰素诱导型基因编码的胞质模式识别受体，能够识别病毒和线粒体来源的双链RNA，从而启动干扰素介导的免疫应答10。尽管其确切的致病机制尚不明确，但目前认为抗MDA5自身抗体可干扰MDA5的正常功能，进而参与自身免疫性疾病的发病过程。

及时检测抗MDA5自身抗体对于快速识别和管理RP-ILD至关重要。传统上，使用35S-甲硫氨酸标记的K562细胞提取物进行放射性免疫沉淀（IP）被认为是检测抗MDA5自身抗体的金标准11。然而，由于该方法成本高昂，依赖专业设备和经过培训的技术人员，受到严格的放射性废物处理法规限制，且放射性标记试剂的有效期较短，因此在常规临床实践中难以推广应用。在临床实践中，印迹法常被用作替代方法；但该方法对抗MDA5自身抗体的检测存在较高的假阳性率12,13，引发人们对诊断准确性的担忧。因此，迫切需要一种可靠、非放射性的确证性检测方法，以验证阳性结果并提高诊断可信度。

为弥补这一不足，我们提出将免疫细胞化学（ICC）作为抗MDA5自身抗体的补充确证检测方法。该方法包括用MDA5质粒转染HeLa细胞，将细胞与患者血浆孵育，然后使用酶标记的二抗（例如辣根过氧化物酶）结合显色底物，通过光学显微镜观察结合的抗MDA5自身抗体。ICC提供了一种非放射性、高灵敏度且标准化的平台，可用于可视化细胞内不同区室中的抗MDA5自身抗体。通过将ICC与印迹实验相结合，该方法旨在降低假阳性率，提高诊断准确性，从而最终改善患者的临床管理和治疗效果。

本研究的目的是建立一种稳健且非放射性的抗MDA5自身抗体检测方案，以克服现有检测方法的局限性，为临床医生提供一种实用且可靠的工具，用于对多发性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）和临床无肌病性皮肌炎（CADM）患者中的快速进展性间质性肺病（RP-ILD）进行早期诊断。在配套视频解说中，这种危及生命的病程被通俗地描述为“快速死亡”；从科学角度而言，其对应的是快速进展性间质性肺病（RP-ILD）。本研究基于已有证据，有望显著改善临床实践中的预后评估和治疗决策。

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方案

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1. 细胞培养与转染

  1. 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养HeLa细胞。
  2. 每2–3天传代一次，或当细胞融合度达到90%–100%时进行传代。
  3. 转染前24小时，将7 × 104个HeLa细胞接种至24孔板的每孔中（每孔面积1.9 cm2），使细胞在转染时融合度约为90%。
  4. 分别用25 µL低血清培养基稀释500 ng质粒（pENTER-MDA5）和1.5 µL转染试剂。
  5. 将稀释后的DNA加入稀释后的转染试剂中（体积比1:1），充分混匀，室温孵育5分钟。
  6. 将上述混合物加入前一日接种的细胞中，并立即轻轻振荡混匀，使DNA-脂质复合物均匀分布。确认细胞融合度为80%–90%。
  7. 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中继续孵育24小时，随后进行免疫细胞化学染色（ICC）。
    注：本实验使用市售载体（pEnter-MDA5）；更多详细信息见材料表。转染效率约为50%。
    转染成功及目标蛋白表达情况可通过转染表达荧光蛋白的质粒并进行Western blot检测目标蛋白表达水平来确认。

2. 细胞固定

  1. 孵育后，用 PBS 洗涤细胞 2 次，以去除残留的培养基。
    注意：可通过在旋转摇床上轻轻震荡培养板进行洗涤。
  2. 用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。
    注意：多聚甲醛具有毒性，请遵循适当的处理规范。
  3. 吸除固定液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。

3. 细胞通透化

  1. 加入 Triton X-100 试剂（PBS 中含 0.3%），室温孵育 10 分钟。
  2. 10 分钟后，弃去去垢剂。
  3. 加入 PBS 洗涤细胞一次。

4. 细胞封闭

  1. 使用含10%胎牛血清的PBS（1×）进行封闭，在室温下孵育细胞1小时。
  2. 移除封闭剂，然后加入PBS洗涤细胞一次。

5. 患者抗体的杂交

  1. 将稀释后的患者血浆加入细胞中。使用前务必用 PBS 将患者样本稀释（1:5,000，溶于 PBS）。
    注意：可根据需要调整稀释比例以增强信号或降低背景。为确保结果无偏倚，进行检测的工作人员对样本来源（患者或健康个体）不知情。
  2. 在 4 °C 下孵育样本 12–16 小时（过夜）。
  3. 孵育结束后，移除患者样本，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。

6. 二抗杂交

  1. 用稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（以PBS按1:250稀释）处理细胞，并于室温孵育1小时。
  2. 1小时后，弃去二抗溶液。
  3. 用PBS洗涤3次。

7. 细胞染色

  1. 洗涤细胞后，每孔加入 300 µL DAB 工作液对细胞进行染色。
    注意：该溶液是根据制造商说明书将 DAB 染色原浓缩液与 DAB 稀释液混合配制而成。
  2. 染色 5 分钟后，移除染液，用去离子蒸馏水冲洗，并振荡 5 分钟。

8. 细胞复染

  1. 用稀释的苏木精对细胞核进行复染。
    注：我们使用10倍稀释的苏木精Gill II，染色过程持续5分钟。
  2. 5分钟后，弃去苏木精溶液，然后用去离子蒸馏水洗涤2次，每次5分钟。

9. 观察

  1. 使用光学显微镜观察染色结果。
    注意：真阳性结果显示表达 MDA5 的 HeLa 细胞内有明显的棕褐色染色；这证实患者样本中存在抗 MDA5 自身抗体。阴性结果表现为 HeLa 细胞无棕褐色染色，表明无抗 MDA5 自身抗体。假阳性结果表现为无论是否表达 MDA5，所有细胞均出现广泛的棕褐色染色。这种非特异性染色可见于其他自身免疫性疾病，必须与真阳性结果加以区分，以避免误诊。

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结果

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进行检测的人员对样本的身份信息（包括样本来源的具体患者）设盲，以尽量减少评估过程中的潜在偏倚。然而，尽管健康对照样本未实施设盲，其结果始终清晰且明确。

图1A 显示了转染pENTER-MDA5质粒的HeLa细胞中MDA5的成功表达。为验证转染效率，使用商业化的抗MDA5抗体进行了免疫细胞化学（ICC）检测。约50%的转染细胞中观察到明显的棕褐色胞质染色，表明MDA5蛋白高效表达。相比之下，在相同条件下处理的未转染细胞未显示胞质染色，证实了抗体的特异性以及内源性MDA5表达的缺失。

根据ICC方案，通过放射性免疫沉淀法确认的抗MDA5阳性患者的代表性样本在表达MDA5的HeLa细胞中显示出清晰的棕色胞质染色，而非转染细胞则未被染色（图...

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讨论

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我们基于免疫细胞化学（ICC）的抗MDA5自身抗体检测技术相较于传统的条带印迹分析和放射免疫分析具有显著优势。此前，Nombel等通过比较MDA5转染细胞的间接免疫荧光（IIF）与ELISA，在23例抗MDA5阳性皮肌炎患者和22例抗MDA5阴性对照组成的队列中报道了该方法的敏感性和特异性分别为96%和100%14。然而，该ELISA试剂盒并未商业化，仅限研究用途。在上述研究基础上，本研究重点在于开发并展示基于ICC的检测方案。与放射免疫分析不同，我们的ICC方法不使用放射性物质，因此更安全且更环保。此外，ICC方案相较于放射性标记检测显著缩短了检测周期，从而提高了样本处理效率，并有助于加快临床决策进程。这些特点使我们的方法成为检测抗MDA5自身抗体的一种可靠替代方案，尤其适用于特发性炎症性肌病（IIM）和快速进展性间质性肺病（RP-ILD）的诊断。

我们的免疫细胞化学技术的成功依赖于多个关键步骤。首先，高效的转染至关重要，因为表达水平不理想可能导致结果不一致。其次，固定过程必须严格控制，以保持细胞形态和抗原性。第三，与患者血浆的孵育...

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披露

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作者声明无竞争利益。

本手稿的部分内容在 OpenAI 的 GPT-4 协助下完成。作者对内容进行了审阅和修改，以确保其准确性和原创性。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了中国台湾国家科学与技术委员会授予许哲林的资助（项目编号：NSTC 114-2320-B-039-038 和 NSTC 113-2320-B-039-032）。本研究还部分得到了中国医药大学及附属医院授予许哲林的资助（项目编号：CMU113-MF-89 和 C1110812016-12）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板（每孔1.9 cm²）Corning354541
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062
烧杯PYREX1000-600
锥形管（15 mL）Corning430052
锥形管（50 mL）Corning430290
去离子蒸馏水我们的去离子蒸馏水使用Milli-Q系统自制（柱1：Quantum TEX，序列号：F4EB53476；柱2：Prepak，序列号：F1CB11442）
经鉴定的胎牛血清CytivaSH30396.03
量筒（50 mL）VITLAB64804
Gill II 型苏木精染液Leica3801522
含高糖的Hyclone Dulbecco’s 改良Eagle培养基CytivaSH30243.02
Lipofectamin 2000 转染试剂Invitrogen11668019转染试剂
MDA-5 (D74E4) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology5321
微量离心管（1.5 mL Eppendorf管）AXYGEN142503
Opti-MEM I 低血清培养基Gibco31985070
轨道摇床（可选）FIRSTEKS300R
多聚甲醛Sigma-Aldrich1×PBS中配制成4%
PBS缓冲液PRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗人IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch109-035-003
移液器控制器Thermo Scientific130165
移液器 GILSON
移液器及吸头（10 µL）QSP104-Q
移液器及吸头（200 µL）QSPT090-Q
移液器及吸头（1000 µL）QSP111-Q
血清学移液管（5 mL）SPL91005
血清学移液管（10 mL）SPL91010
血清学移液管（25 mL）SPL91025
SignalStain DAB底物试剂盒Cellsignaling8059PBS中配制成0.3%

参考文献

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  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
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  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
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Triton X 100 DAB

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