使用 HeLa 细胞和免疫细胞化学与光学显微镜检测抗 MDA5 自身抗体

特发性炎症性肌病 （IIM），通常称为肌炎，是一组异质性自身免疫性疾病，其特征是慢性肌肉炎症、多变的临床表现和不同的治疗结果。常见症状包括肌肉无力、耐力下降和肌痛¹.IIM 的主要亚型包括多发性肌炎 （PM） 和皮肌炎 （DM），而临床上肌病性皮肌炎 （CADM） 的特征性皮疹与 DM 相似，但肌肉受累很少或没有肌肉受累。PM、DM 和 CADM 的主要并发症是间质性肺病 （ILD），它影响了大约 40% 的患者，并与死亡率增加有关²。

IIM 中 ILD 的临床病程和预后差异很大。与 PM 相关的 ILD 相比，与 DM 和 CADM （DM-/CADM-ILD） 相关的 ILD 往往更难治疗，预后更差。其中，急性或亚急性间质性病在三个月内快速进展³ 尤其严重，据报道的五年生存率仅为 52%，而慢性间质性质性质性质性质快速进展性 ILD （RP-ILD） 是急性/亚急性 ILD 的一种亚型，其特征是呼吸困难快速发作，胸部影像学上可见广泛的肺泡损伤。RP-ILD 是一种危及生命的疾病，预后不良，强调迫切需要早期诊断和及时干预以改善患者的预后 ^4,5,6。

肌炎特异性自身抗体 （MSA） 已成为肌炎相关 ILD 的关键生物标志物，其中抗 MDA5 自身抗体发挥着尤为重要的作用。这些自身抗体在PM-/DM-/CADM-ILD患者中经常检测到，是RP-ILD^的重要预后指标^7,8,9。MDA5（黑色素瘤分化相关基因 5）是一种胞质模式识别受体，由干扰素诱导基因编码，可检测病毒和线粒体双链 RNA，启动干扰素介导的免疫反应¹⁰。尽管确切的致病机制尚不清楚，但抗 MDA5 自身抗体被认为会破坏 MDA5 功能，从而促进自身免疫发病机制。

及时检测抗MDA5自身抗体对于RP-ILD的早期识别和管理至关重要。传统上，使用 ³⁵种 S-蛋氨酸标记的 K562 细胞提取物进行放射性标记的免疫沉淀 （IP） 被认为是检测抗 MDA5 自身抗体的金标准¹¹。然而，由于成本高、依赖专业设备和训练有素的人员、严格的放射性废物处理法规以及放射性标记试剂的保质期有限，这种方法对于常规临床使用来说是不切实际的。在临床实践中，印迹测定通常用作替代方案;然而，它们与抗 MDA5 自身抗体的高假阳性率^12,13 相关，引发了对诊断准确性的担忧。因此，迫切需要一种可靠的、非放射性的验证性检测来验证阳性结果并提高诊断信心。

为了解决这一差距，我们建议使用免疫细胞化学 （ICC） 作为抗 MDA5 自身抗体的补充验证测试。该方法包括用MDA5构建体转染HeLa细胞，将细胞与患者血浆孵育，并使用酶偶联二抗（例如辣根过氧化物酶）结合显色底物检测结合的抗MDA5自身抗体，以便在光学显微镜下进行可视化。ICC 提供了一个非放射性、高灵敏度和标准化平台，用于可视化细胞区室内的抗 MDA5 自身抗体。通过将 ICC 与印迹测定相结合，该方法旨在降低假阳性率，提高诊断准确性，并最终增强患者的临床管理和结果。

本研究的目的是建立一种强大的非放射性方案来检测抗 MDA5 自身抗体，解决当前检测方法的局限性，并为临床医生提供实用可靠的工具来早期诊断 PM、DM 和 CADM 患者的 RP-ILD。在随附的视频旁白中，这种危及生命的过程被通俗地描述为“快速死亡”;从科学上讲，它对应于快速进展性 ILD （RP-ILD）。这项工作建立在现有证据的基础上，有可能显着改善临床实践中的预后评估和治疗决策。

1. 细胞培养和转染

1. 在加湿的 5% CO₂ 气氛中，使用 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基在 37°C 下在 37 °C 下维持 HeLa 细胞。
2. 每 2-3 天传代一次细胞，或当细胞达到 90%-100% 汇合度时传代细胞。
3. 转染前 24 小时在 24 孔板（1.9 cm²/孔）的每个孔中接种 7 ×^{10 个 4} HeLa 细胞，使细胞达到约 90% 的汇合度。
4. 在 25 μL 还原血清培养基中稀释 500 ng 质粒 （pENTER-MDA5） 和 1.5 μL 转染试剂。
5. 将稀释的DNA加入稀释的转染试剂中（1：1的比例）。充分混合并孵育5分钟。
6. 将混合物添加到前一天接种的细胞中，并搅拌以立即混合DNA-脂质复合物。确认细胞汇合度为 80%-90%。
7. 将细胞在37°C下在加湿的5%CO₂ 气氛中孵育24小时，然后继续进行ICC。
   注意：我们使用了市售载体（pEnter-MDA5）;更多信息可以在 材料表中找到。 转染效率为 ~50%。
   可以通过用表达荧光蛋白的质粒转染细胞并进行蛋白质印迹以可视化靶蛋白的表达来确定转染和靶蛋白的表达是否成功。

2. 细胞固定

1. 孵育后，用PBS洗涤细胞2次以去除任何残留的培养基。
   注意：可以通过在轨道振动器上摇动板来进行洗涤。
2. 将细胞固定在PBS中的4%多聚甲醛中。将细胞在室温下放置 15 分钟。
   注意：多聚甲醛有毒。使用适当的处理指南。
3. 吸出固定试剂并使用 PBS 洗涤细胞 2 次。

3. 细胞透化

1. 加入 Triton X-100 试剂（0.3% PBS 溶液），让细胞在室温下静置 10 分钟。
2. 10 分钟后，处理掉洗涤剂。
3. 加入PBS洗涤细胞一次。

4. 细胞阻断

1. 用 PBS （1x） 中的 10% 胎牛血清进行封闭，并在室温下孵育细胞 1 小时。
2. 取出封闭试剂，然后加入PBS洗涤细胞一次。

5. 患者抗体的杂交

1. 将稀释的患者血浆添加到细胞中。使用前请务必在 PBS 中稀释患者样品（PBS 中 1：5,000 稀释）。
   注意：根据需要调整稀释度以增强信号或减少背景。为确保结果公正，进行测试的工作人员不知道哪些样本属于患者，哪些样本来自健康个体。
2. 将样品在4°C下孵育12-16小时（过夜）。
3. 孵育期后，取出患者样本并用PBS洗涤细胞3次。

6.二抗杂交

1. 用稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG（PBS中1：250稀释）处理细胞，并在室温下放置细胞1小时。
2. 一小时后，处理二抗。
3. 用 PBS 3 次冲洗。

7. 细胞染色

1. 洗涤细胞后，用 300 μL DAB 工作溶液/孔对细胞进行染色。
   注意：该溶液是根据制造商的说明通过混合DAB显色原浓缩物和DAB稀释剂制备的。
2. 将细胞染色5分钟后，除去染料，用去离子蒸馏水冲洗，然后摇晃5分钟。

8. 细胞复染

1. 用稀释的苏木精复染细胞核。
   注意：我们使用苏木精鳃II以10倍稀释度进行，并等待5分钟进行染色过程。
2. 5分钟后，处理苏木精，然后用去离子蒸馏水洗涤2 x 5分钟。

9. 观察

1. 使用光学显微镜观察染色结果。
   注意：真阳性显示表达MDA5的HeLa细胞内有强烈的棕色染色;这证实了患者样本中的抗 MDA5 自身抗体。阴性结果显示HeLa细胞没有棕色染色，表明没有抗MDA5自身抗体。假阳性结果显示所有细胞中均存在广泛的棕色染色，无论 MDA5 表达如何。这种在其他自身免疫性疾病中可见的非特异性染色必须与真阳性区分开来，以避免误诊。

进行测试的人员对样本的身份不知情，包括从样本中获取样本的特定患者，以尽量减少评估过程中的潜在偏差。然而，虽然健康对照样本没有进行盲法，但它们始终产生清晰明确的结果。

图1A 展示了MDA5在转染pENTER-MDA5构建体的HeLa细胞中的成功表达。为了验证转染效率，使用商业抗 MDA5 抗体进行 ICC。在大约 50% 的转染细胞中观察到强烈的棕色细胞质染色，表明 MDA5 蛋白表达稳定。相比之下，在相同条件下处理的未转染细胞没有显示细胞质染色，证实了抗体的特异性和内源性MDA5的不表达。

按照ICC方案，来自抗MDA5阳性的代表性样本，通过放射性标记的免疫沉淀证实，在表达MDA5的HeLa细胞中显示出透明的棕色细胞质染色，而未转染的细胞保持未染色（图1B）。这种染色模式表明患者血浆中存在抗 MDA5 自身抗体，并与使用 35种 S-蛋氨酸标记的 K562 细胞提取物的既定金标准检测一致。

补充表 S1 总结了患者特征，其中概述了临床诊断、抗 MDA5 抗体状态，并分为三组：抗 MDA5 阳性、假阳性和健康对照。除了抗体状态外，补充表 S1 现在还总结了患者人口统计数据，包括每个队列的年龄、性别和潜在诊断。抗体反应性根据条带强度半定量分为弱 （1+）、中度 （2+） 或强 （3+），反映抗体水平的增加。这为解释 ICC 结果提供了临床背景，同时保持了本研究的主要方法论重点。研究队列包括 10 名确诊抗 MDA5 自身抗体的患者（阳性组）、5 名通过商业印迹检测产生假阳性结果的自身免疫性疾病患者（假阳性组）和 10 名健康个体（健康对照组）。每个样品与阳性和阴性对照一起进行测试，并使用放射性标记的免疫沉淀进行独立验证。对于具有清晰和确凿染色结果的样品，单次ICC运行被认为足够了。在染色不明确或临界的情况下，进行进一步的测试，包括连续稀释和重复 ICC 测定，以确保准确解释。这种方法在验证基于ICC的检测方法的性能时确保了方法的严谨性和资源效率。

假阳性结果如 图 2 所示。在这些样本中，使用了特发性炎症性肌病 （IIM） 以外的自身免疫性疾病患者的血浆。与 图1不同，无论MDA5表达状态如何，在所有细胞中都广泛观察到棕色细胞质染色。这种染色模式表明非特异性结合，并突出了患有其他自身免疫性疾病的患者样本中假阳性的可能性。阴性结果如 图 3 所示，其中测试了来自健康个体的血浆。在转染或未转染的HeLa细胞中几乎没有观察到棕色细胞质染色，表明这些样品中不存在抗MDA5自身抗体。

图1：使用ICC验证MDA5表达和检测抗MDA5自身抗体。（A）使用商业抗MDA5抗体对用表达MDA5的质粒转染的HeLa细胞进行染色。观察到强烈的棕色细胞质染色，表明 MDA5 蛋白表达强劲。相比之下，在相同条件下处理的未转染细胞没有表现出染色，证实了抗体特异性和内源性MDA5的不表达。 （B）将转染MDA5的HeLa细胞与通过放射性标记免疫沉淀证实抗MDA5阳性的患者的血浆一起孵育。观察到清晰的细胞质棕色染色，表明患者样本中存在抗 MDA5 自身抗体。比例尺 = 50 μm。缩写：ICC = 免疫细胞化学。请点击此处查看此图的大图。

图 2：使用来自 IIM 以外的自身免疫性疾病患者的血浆检测假阳性信号。 在转染和未转染的细胞中均观察到广泛的棕色细胞质染色，表明非特异性抗体结合。这些结果说明了当使用与抗 MDA5 阳性 IIM 患者无关的自身免疫性疾病患者的血浆时，在线印迹测定中检测假阳性的可能性。比例尺 = 50 μm。缩写：IIM = 特发性炎症性肌病。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：来自健康对照个体的血浆阴性染色结果。 用MDA5转染并与健康个体血浆孵育的HeLa细胞几乎没有显示出棕色细胞质染色。 请点击此处查看此图的大图。

补充表 S1：患者特征。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有需要声明的竞争利益。

该手稿的部分内容是在 OpenAI 的 GPT-4 的帮助下生成的。作者对内容进行了审查和编辑，以确保准确性和原创性。