切片人皮质类器官的电穿孔用于基因功能研究

新皮层是指大脑半球的外层覆盖物，是哺乳动物独有的结构。新皮层代表高级认知功能的所在地 ^1,2,3,4,5。在发育过程中，神经干和祖细胞在称为神经发生的过程中产生神经元。调查人类新皮层发育的功能研究为阐明人类神经干细胞调节、神经病理学和人类大脑进化的潜在机制提供了基础 ^2,6,7。

从历史上看，人类大脑发育的研究依赖于使用死后组织的描述性组织学方法，而最近的自由漂浮组织培养系统能够对人类胎儿组织进行功能研究 ^8,9。此外，人类胎儿脑组织被证明具有自我组织成长期扩增类器官的能力¹⁰。胎儿组织研究为人类发育提供了重要的见解^11,12，但有限的组织可用性和伦理考虑限制了其在人脑发育机制研究中的广泛应用。在过去十年中，已经开发了允许从人多能干细胞 （hPSC） 生成三维神经类器官的方案，包括人诱导的 PSC （hiPSC）^13,14。

脑类器官显示发育中的大脑的重要特征，例如心室样结构的形成、顶基底极性、皮质细胞结构、放射状胶质细胞分裂过程中的动间核迁移和神经元迁移。重要的是，这些新的人类类器官模型概括了人类发育中的大脑在小鼠中没有很好地建模的特征，包括进化上相关的关键神经祖细胞类型，特别是基底放射状胶质细胞（或外放射状神经胶质细胞）^7,14,15。早期脑类器官方案的几个局限性——例如类器官异质性问题、内核营养供应有限以及不同的区域身份——在最近的方案进展中得到了解决，可以预期未来几年会有进一步的改进 15,16,17,18,19。人类大脑和皮质类器官已迅速成为研究人类皮层发育²⁰、神经系统疾病^{21、22、23、24} 和大脑进化^{25、26、27、28、29} 以及进行大规模筛选方法^30、31、32 的关键模型。

对于急性遗传作，两种方法主要用于新皮层发育的动物模型:通过感染靶细胞递送病毒³³ 和在子宫内或体外电穿孔^34,35。将 DNA - 以及最近的 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白 （RNP） 复合物³⁶- 注射到侧脑室中，然后进行电穿孔，提供了可以根据电穿孔电极的方向靶向大脑特定区域的优势。电穿孔涉及短暂的电脉冲，可暂时增加细胞膜通透性，从而允许将 DNA 和其他带电分子引入细胞。子宫内电穿孔首先在小鼠³⁷ 中进行，并迅速成为发育神经生物学的广泛应用方法。该方法随后也被应用于其他物种，例如大鼠^38,39 和雪貂 40,41,42，这是一种用于研究新皮层扩张和皮质折叠的脑回物种 ^3,43,44,45。

电穿孔也已成为人脑类器官研究中的重要方法⁴⁶。在脑类器官中，电穿孔已被应用于可视化细胞形态和神经元轴突^14,47，递送基因敲低试剂 22,48,49，以及通过过表达研究基因功能⁵⁰。该方法不仅限于人类模型，还已应用于灵长类动物大脑类器官的基因改造^50,51。此外，已经描述了在 Spin Ω 旋转生物反应器中产生的皮质类器官的电穿孔⁵²。

在该协议中，我们概述了切片人皮质类器官¹⁵ 的电穿孔，用于研究皮质发育中的基因功能。大脑区域特异性类器官提高了可重复性和一致性，这对于定量分析的成功至关重要，例如，在疾病建模中。在切片的人皮质类器官方案¹⁵ 中，在 iPSC 分化过程中应用有效的模式化线索以获得均匀的背前脑祖细胞群，然后应用促进组织生长且指导信号较少的培养基^53,54。皮质类器官的切片已被证明可以减少由于类器官核心中营养物质和氧气的可用性减少而导致的细胞死亡¹⁵。此外，切片支持包含丰富基底放射状胶质细胞的心室样结构的发育，持续的神经发生导致形成扩大的皮质板样区域¹⁵。该方案中的重复切片也使这些皮质类器官特别适合电穿孔，因为心室腔可以很容易地通过注射识别和靶向。切片皮质类器官的电穿孔已应用于研究基因调控区域和皮质进化^26,55。

在电穿孔过程中，注射混合物被输送到脑室样结构的腔。在施加脉冲电场后，混合物被排列在心室的顶端桡状神经胶质细胞吸收。随着顶端放射状胶质细胞分裂并产生更定型的细胞类型⁴，电穿孔剂会传递到基底祖细胞和神经元。电穿孔后代 3 天后分布在心室区 （VZ） 和脑室下区 （SVZ），并在电穿孔后 7 天在神经源性中期跨越大部分皮质壁，包括皮质板 （CP） 样区域^26,55。

在这里，我们描述了 CRISPR/Cas9 介导的基因破坏⁵⁶ 通过在切片的人皮质类器官中进行电穿孔²⁶。此外，电穿孔方法还可用于基因过表达、通过荧光蛋白表达实现细胞形态和细胞过程的可视化、用于大规模平行报告基因分析 （MPRA） 的质粒文库的递送、表观基因组编辑工具的递送以及用于实时成像的细胞标记。

所有涉及人诱导多能干细胞 （hiPSC） 的实验均按照 1964 年赫尔辛基宣言中概述的伦理标准进行，并经德累斯顿大学医院伦理审查委员会 （IRB00001473;IORG0001076;伦理批准号 SR-EK-456092021）。

1. 用于急性 CRISPR/Cas9 介导基因敲除的向导 RNA 设计

1. 使用软件或在线工具设计一对靶向同一外显子的向导 RNA （gRNA），理想情况下，前间隔区相邻基序 （PAM） 之间的距离为 7-11 bp（避免 3 bp 的倍数），以增加蛋白质破坏的可能性。
   注意:理想情况下，应以编码功能域的外显子为目标。或者，可以选择转录本的第一个外显子（图 1A）。根据活性评分（接近 1）⁵⁷ 和特异性评分（接近 100%）⁵⁸ 选择向导 RNA。

2. 人诱导多能干细胞的培养

1. 为了生成人类皮质类器官并验证 gRNA 功能，请使用来自健康供体的 hiPSC 细胞系 CRTDi004-A⁵⁹ 。
2. 如前所述，在标准条件（37°C，5% CO₂）下，在干细胞培养基中涂有 6 孔板的基底膜基质上培养 iPSCs。在最初的 24 小时内，应使用补充 ROCK 通路抑制剂 （1:1,000） 的单细胞解离酶以 80% 汇合度传代诱导的 PSC。
   注:其他 iPSC 细胞系可用于类器官生成和 gRNA 验证。

3. 从人诱导多能干细胞中提取基因组 DNA

1. 使用 6 孔板的 2 个 80%-90% 汇合 hiPSC 孔进行基因组 DNA 提取。用酶将细胞从板中解离，制成单细胞悬液。将细胞加入 1 mL 干细胞培养基（总体积）中，然后以 600 x g 离心 10 分钟并去除上清液。
2. 将细胞沉淀重悬于 250 μL 裂解缓冲液（50 mM TrisHCl （pH 7.5）、100 mM NaCl、0.5% SDS、5 mM EDTA 的 H₂O 溶液）和 12.5 μL 蛋白酶 K（10 mg/mL 储备液）中。在 55 °C 和 250 rpm 下孵育 2 小时。
3. 混入 100 μL 的 5 mM NaCl 中。在 4 °C 下以 18,000 x g 旋转 10 分钟，然后将上清液转移到新的 1.5 mL 反应管中。
4. 加入 250 μL 异丙醇，将试管倒置数次，并在 4 °C 下以 18,000 x g 旋转 15 分钟。
5. 取出上清液，用 500 μL 70% EtOH（分子生物学级）洗涤，倒置试管，并在 4 °C 下以 18,000 x g 旋转 10 分钟。
6. 最后，小心地吸出上清液并将打开的反应管压在纸巾上，以完全去除上清液。
7. 让沉淀在 RT 下风干 10 分钟，然后将沉淀溶解在 100 μL 无核酸酶的水中，在 37 °C 下 30 分钟。
8. 用光谱仪测量 DNA 的浓度。分离的基因组 DNA 在 -20 °C 下可稳定保存数月。

4. 通过 gRNA 验证模板识别（体外）

注:作为验证 gRNA 成功识别模板的第一种方法，进行体外 Cas9 反应，其中双链 DNA 被切割成两个片段，可以通过琼脂糖凝胶电泳 40,61,62 进行区分。

1. 为了生成模板，使用以下循环条件，使用高保真 PCR 预混液和 10 μM 引物对从 hiPSC 分离的基因组 DNA（第 3 部分）进行聚合酶链反应 （PCR）:在 98 °C 下初始变性 30 秒，40 个循环 [98 °C，10 秒;60 °C，30 秒;72 °C，1 分钟] 和 72 °C 下的最终伸长 5 分钟。
   1. 根据 PCR 引物调整退火温度。确保扩增子大小为 800 bp 至 1.5 kb，并且 gRNA 结合位点定位不对称。
   2. 通过在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳分离 PCR 产物，从凝胶上切下相应的条带并提取 DNA²⁶。
   3. 用光谱仪测量提取的 PCR 产物的 DNA 浓度。
2. 通过将 10 μM CRISPR RNA（crRNA，定制序列，100 μM 原液）和 10 μM tracrRNA（100 μM 原液）混合在无核酸酶的双链缓冲液（5 μL 总体积）中来组装功能性 gRNA。将混合物在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后冷却至室温 （RT）。
3. 通过在室温下（25 μL 总体积）将来自 4.2 步的 10 μM gRNA 和 1 μM Cas9 酶（来自 化脓性链球菌，62 μM 原液）在 PBS 中混合 15 分钟来制备核糖核蛋白 （RNP） 复合物。
4. 为了进行 体外 消化反应，将 1 μM RNP 复合物（来自步骤 4.3）与 0.1 μM DNA 模板（来自步骤 4.1 的 PCR 产物）和 1x Cas9 核酸酶反应缓冲液（含有 200 mM HEPES、1 M NaCl、50 mM MgCl₂、1 mM EDTA;pH 6.5;可在 -20 °C 下分装储存）。
   1. 用不含核酸酶的水填充至终体积为 10 μL。
   2. 将反应物在 37 °C 下孵育 1 小时。
   3. 加入 2 mg/mL 蛋白酶 K，并在 56 °C 下再孵育 10 分钟，以从 Cas9 酶中释放 DNA 底物。将消化的反应混合物储存在 4 °C 或 -20 °C 直至最终分析。
      注:建议使用 10:1 摩尔比的 Cas9-RNP:DNA 底物，以获得最佳切割效率。如有必要，用无核酸酶的水将 PCR 产物稀释至所需浓度。作为阴性对照，可以携带缺乏 gRNA 或 Cas9 酶的反应混合物。
5. 通过在 2% 琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳来观察裂解的产物。
   注意:理想情况下，两个不同大小的条带应该是可见的，并且模板条带应该已经消失或强烈减少，以实现高效的 gRNA（图 1B）。

5. 验证人诱导多能干细胞中的 gRNA 功能

注意:建议测试靶向产生皮质类器官的相同细胞系的 gRNA 的效率²⁶。为此，将含有相关 gRNA 的 RNP 复合物与 GFP 表达质粒共转染到 hiPSC 中，将细胞培养 3 天，随后分离基因组 DNA 用于测序分析。对于每个 gRNA 测试，大约需要 200,000 个细胞。细胞的汇合度不应超过 70%-80%，并且解冻后应至少传代两次。重要的是服用阴性对照 （gLACZ）^36,63 和模拟条件（不含 RNP 的核转染溶液）。

1. 实验前 2 小时更换 hiPSC 培养基以加入 ROCK 抑制剂 （1:1,000），以增加细胞在细胞培养罩中的活力。
2. 用基底膜基质包被 6 孔板的适当孔数。
3. 启动 nucleofector 单元（16 孔试纸条的"X 单元"）并选择预编程的 程序"ES cells， H9"（脉冲 CB150）。选择适当的条带孔数。
4. 通过在双链体缓冲液中混合 24 μM crRNA 和 24 μM tracrRNA 来制备 RNP 复合物。
   1. 在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后冷却至 RT，如步骤 4.2 所述。
   2. 同时，在 PBS 中将 Cas9 酶稀释至 8 μM。
   3. 混合 3 μL gRNA 和 3 μL Cas9，并在 RT 下孵育 15 分钟以组装 RNP。
      注:3:1 gRNA:Cas9 的摩尔比可提供最佳的切割效率。要成对测试 gRNA，请分别准备每个 RNP，并在最后混合 1.5 μL 每个 RNP。
5. 在 15 分钟的 RNP 孵育过程中，在细胞培养罩下准备用于成核转染的 hiPSC。
   1. 用每孔补充有 ROCK 抑制剂 （1:1,000） 和 1x 青霉素/链霉素的 1.5 mL 干细胞培养基替换基底膜涂层。
   2. 按照制造商的说明，在冰上制备核转染溶液作为预混液。
   3. 从板中分离 hiPSC 以制备单细胞悬液（如第 2 节所述），并在 Neubauer 计数室中用台盼蓝染色对细胞进行计数。
   4. 以 600 x g 的离心力沉淀每对 gRNA 200,000 个活细胞，持续 5 分钟。
6. 在细胞培养通风橱中，在冰上，将 3 μL RNP 添加到 20 μL 核转染溶液和 0.2 μg/μL pCAG-GFP 质粒中。
7. 将沉淀的细胞重悬于 23 μL 最终的核转染混合物中，并将它们转移到冰上的 16 孔核转染试纸条的 1 个孔中。
8. 一旦所有条件都位于试纸条中，将其放入通风橱外的 nucleofector machine X 装置中，然后按 开始 按钮开始核转染。
9. 随后，将 nucleofection 条带运输回细胞培养罩下，并通过用板中的一些培养基冲洗条带孔将 nucleofection 细胞转移到准备好的 6 孔板中。
10. 将 hiPSC 培养 3 天，每天更换含有 1x 青霉素/链霉素的培养基。24 小时后，不再需要 ROCK 抑制剂。
11. 在常规荧光显微镜下检查 GFP 信号（图 1C）。
    1. 第 3 天，通过荧光活化细胞分选 （FACS） 对 GFP 阳性细胞进行分类和收集。
    2. 用 PBS 中的 2% FBS 制备分选缓冲液并保持在 4 °C。
    3. 将台式离心机冷却至 4 °C。 准备 1.5 mL 反应管，其中含有 50 μL 分选缓冲液，含有 ROCK 抑制剂 （1:1,000），用于在冰上收集 FACS 后收集细胞，以及 5 mL 带有细胞过滤器盖的聚苯乙烯圆底管在冰上。
    4. 制作核染细胞的单细胞悬液。
    5. 将细胞重悬于每个样品中含有 ROCK 抑制剂 （1:1,000） 的 1 mL 干细胞培养基中，并以 600 x g 离心 5 分钟。
    6. 去除上清液，将细胞重悬于 200 μL 含 ROCK 抑制剂 （1:1,000） 的分选缓冲液中，然后加入 0.4 μL DAPI （2 ng/μL） 以通过 FACS 识别活细胞。
    7. 通过冷却圆底管的细胞过滤器盖吸取细胞溶液，以去除任何残留的细胞团块。
       注:随着时间的推移，DAPI 可能会影响细胞活力，因此，最好在分选前向每个样品中添加新鲜的样品。
    8. 将 10,000 个 GFP 阳性活细胞（DAPI 阴性）分选到先前制备的 1.5 mL 反应管中，加入 50 μL 含有 ROCK 抑制剂（在冰上）的分选缓冲液。
12. FACS 后，直接从分选的细胞中提取基因组 DNA。
    1. 将收集的、分选的细胞在分选缓冲液中以 600 x g 旋转 10 分钟。
    2. 去除上清液，并在 250 μL 裂解缓冲液和 12.5 μL 蛋白酶 K 中吸收细胞沉淀。
    3. 按照第 3 节中的说明继续作。
    4. 最后，将 DNA 沉淀溶解在 50 μL 无核酸酶水中。
13. 执行 PCR 以生成用于 Sanger 测序的模板，如步骤 4.1 中所述。作为对照，使用来自 gLACZ 条件的 DNA 和靶向目标基因的引物（与第 4 节中使用的引物相同）。从琼脂糖凝胶电泳中提取适当的条带，在柱上纯化，然后送去进行 Sanger 测序。
14. 使用成对全局比对比对 Sanger 测序结果。
    注意:成功的靶向可以通过叠加信号或由 gRNA 结合位点周围随机插入/缺失导致的不完整序列来识别（图 1D）。

6. 切片人类皮质类器官的产生

注:人类皮质类器官 （hCO） 是根据切片新皮质类器官 （SNO） 方法生成的，如前所述^15,60。

1. 通过在培养箱中于 37 °C 孵育 30-40 分钟，从含有 1 mg/mL 胶原酶的 6 孔板的 1 个孔中分离小的 hiPSC 集落。同时，用基底膜基质包被新的 6 孔板。
   1. 用 1 mL 干细胞培养基终止酶，并在 15 mL 锥形管中用大口径尖端收集 5 mL 干细胞培养基中的菌落。
      注意:任何提及"大口径移液器吸头"的步骤也可以在吸头切成直径至少 2 mm 的开口的情况下进行。
   2. 一旦菌落沉降到底部，去除旧培养基并用新鲜的干细胞培养基替换。
   3. 使用宽口径吸头，将菌落均匀分布在包被的 6 孔板上，每孔加入 1.5 mL 干细胞培养基。
   4. 在标准条件下将 hiPSC 培养 2-3 天。
2. 一旦 hiPSC 集落的直径达到约 1.5 mm，通过在 37 °C 下孵育长达 1 小时，再次用 1 mg/mL 胶原酶分离所有集落。
   1. 用 6 mL 前脑培养基 1¹⁵ 终止酶，并使用大口径吸头将分离的菌落收集在 15 mL 锥形管中。
   2. 菌落沉淀后，去除旧培养基并用 5 mL 前脑培养基 1 洗涤。
   3. 最后，将菌落转移到超低附着 6 孔板中，每孔含有 3 mL 前脑培养基 1，带有宽口径尖端，让它们形成胚状体 （EB）。此步骤表示人类皮质类器官方案的第 0 天。从这里开始，遵循发布的协议¹⁵.
3. 第 7 天，将 EB 包埋在基底膜基质中，每个"饼干"约 20 个 EB，并在前脑培养基 2 ¹⁵ 中培养 1 周。在第 14 天，从基质中机械释放类器官，并在轨道振荡器上继续在前脑培养基 3¹⁵ 的 6 孔超低附着板中以 120 rpm 的速度培养。
4. 从第 35 天开始，将 1% v/v 基底膜基质补充到培养基中。
5. 在第 6 周，将类器官嵌入 3% 低熔点琼脂糖中，并在振动切片机上切成 500 μm 厚的切片（图 2A、B），这支持整个类器官的氧气和营养供应。如有必要，每 4 周重复一次类器官切片。
6. 从第 70 天开始，在前脑培养基中培养类器官 4¹⁵。

7. 切片人皮质类器官的电穿孔

注意:一旦看到心室样结构，就可以注射和电穿孔人类皮质类器官，大约从第 2 周开始。对于后期类器官（第 5 周及以上），在类器官切片后 2 天进行电穿孔最有效，细胞活力最佳^26,55。切片后，心室样结构很容易识别，这有助于注射过程（图 2C、D）。此外，心室样结构在切片后一段时间内保持部分开放，允许多余的注射液逸出，从而保护了心室内衬粘附连接带的完整性。切片时间表可以更改以匹配实验时间表。对于长期培养，应每 3-4 周重复切片。

1. 使用以下设置在微毛细管拉拔器上拉动硼硅酸盐玻璃毛细管进行注射:P 500，加热 600，拉动 30，速度 40，时间 1。使用胶带将毛细管储存在大培养皿中以进行固定。
2. 在电穿孔当天，如步骤 5.4 所述新鲜制备 CRISPRR/Cas9 RNP 复合物，终浓度为 24 μM RNP。0.1 μg/μL pCAG-GFP 质粒（或任何其他荧光报告基因）的共电穿孔支持电穿孔细胞的鉴定。此外，在最终进样混合物中加入 0.1% 固绿水溶液，以确认混合物成功输送。
   注:为每个感兴趣的基因和 gLACZ 对照制作单独的混合物。
3. 将 Tyrode 溶液（一包 Tyrode 盐、1 g NaHCO₃、13 mL 1 M HEPES pH 7.25 在 1 L dH₂O 中）预热至 37 °C。 将剩余的 Tyrode 溶液在 4 °C 下储存数月。
4. 选择具有发达心室样结构的 hCO（图 2E）并丢弃任何不显示心室样结构的类器官（图 2F）。将最多 10 个类器官转移到含有 Tyrode 溶液的 6 cm 培养皿中，并将剩余的 hCO 保存在培养箱中。
5. 在微量加载器移液器吸头的帮助下，用 10 μL 注射溶液填充玻璃微毛细管，然后用镊子捏掉薄端打开毛细管。通过将一些注射混合物释放到 Tyrode 溶液中来检查毛细管是否开放。使用显微注射器在连续设置中进行注射，并通过脚踏开关控制门控。
6. 将毛细管插入心室样结构的中心（图 2C），然后按下脚踏开关注入 0.2-0.5 μL 的混合物。
   注意:每个 hCO 最多可注射 5 个心室，每个重复总共可注射 7-8 个 hCO。理想情况下，应针对面向 hCO 外部的心室，因为这些心室通常是最发达的（图 2G，H）。
7. 使用细镊子将类器官推向以限制运动。实际上不要抓住类器官（图 2C）。
8. 注射后，使用宽口径移液器吸头将 1-2 个类器官转移到含有 Tyrode 溶液的电穿孔室中（图 2C、D）。
9. 将注射的类器官定向到电极，以便针对面向类器官外部的心室样区域的顶端放射状神经胶质细胞。
10. 将电缆连接到电穿孔室，使类器官的注射面朝向正极（阳极; 图 2D）。
11. 按下电穿孔仪的 脉冲 按钮，以 5 个 38 V 脉冲电穿孔，每个脉冲 50 毫秒，间隔 1 秒。
    注:电穿孔设置可能取决于可用的电穿孔仪，可能需要优化。
12. 重复注射和电穿孔步骤，直到处理所需数量的类器官。
13. 在 RT 下将电穿孔的类器官收集在培养基中，直到相同条件下的所有样品都已处理完。确保它们在培养箱外的总时间不超过 30 分钟。
14. 随后，将电穿孔的 hCO 放回适当的培养基中，并在前 24 小时内不摇晃地培养它们。
    注意:2-3 天后，GFP 信号应在荧光立体镜下的电穿孔 hCO 中可见（图 2H）。电穿孔后分析的时间点应根据要回答的生物学问题进行选择。3-7 天后，GFP 阳性细胞位于 VZ、SVZ 和 CP^15,60 之间。

8. 电穿孔人皮质类器官的固定和冷冻切片

1. 在 2 mL 反应管中，在 RT 下将电穿孔类器官在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中固定 30 分钟。
   注意:PFA 有毒且致癌。在通风橱下执行任何涉及 PFA 的步骤。强烈建议使用丁腈手套和安全护目镜。
2. 在 PBS 中洗涤一次 5 分钟，然后在 4 °C 下储存在无菌过滤的 30% 蔗糖中的 PBS 中，直到组织完全被蔗糖饱和。
3. 将固定的类器官包埋在冷冻组织标本的包埋培养基中，加上 15% 蔗糖的 PBS 溶液，分块在干冰上。
4. 在低温恒温器上准备 20-30 μm 切片，并将组织收集在载玻片^26,64 上。
   注意:一旦固定的类器官在蔗糖中（在 4 °C 下稳定数月）或嵌入包埋介质中（冷冻块可以在 -20 °C 下储存在密封袋中数月至数年），就可以暂停该方案。

9. 电穿孔人皮质类器官的免疫组织化学分析

1. 对于免疫组织化学分析^26,64，在柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% 聚山梨酯 20 in dH₂O，pH 6.0）中于 70 °C 在水浴中进行抗原修复 1 小时。
2. 在 PBS 中洗涤一次 5 分钟，然后短暂干燥载玻片并用蜡笔圈出切片。
3. 在 RT 下使用 0.1 M 甘氨酸的 PBS 溶液 （pH 7.4） 淬灭 30 分钟，然后用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
4. 用封闭缓冲液（10% 马血清、0.1% Octoxinol 9 的 PBS 溶液）覆盖切片，并在室温下孵育 30 分钟。
5. 在封闭缓冲液中制备一抗，并在 4 °C 下在切片上孵育过夜。
6. 第二天，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，在封闭缓冲液中与二抗和 DAPI 在 RT 下孵育 1 小时，然后再次用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
7. 将载玻片安装在安装介质中并在荧光显微镜上成像（图 3）。
   注:建议在注射混合物中加入针对荧光团的抗体，以识别目标细胞，因为天然信号通常在固定后被淬灭。表 1 列出了用于免疫荧光染色的抗体和染料，如图 3 所示。

10. 在蛋白质水平验证 CRISPR/Cas9 介导的敲除

1. 为了验证蛋白质水平的敲除，请在电穿孔类器官上对靶蛋白进行免疫组织化学（图 3I）。
2. 使用相同的设置对 gLACZ 对照和目标类器官进行成像，以便比较荧光强度（图 3I、J）。以区域特异性的方式执行此作，以比较对发育中的新皮层的不同细胞类型的影响。在 ImageJ/Fiji（插件 Cell Counter）中计数细胞，或使用 StarDist 插件⁶⁵ 进行分割。

CRISPR/Cas9 介导的基因消融需要 gRNA 的设计。通常，用一对间隔 7-11 bp 的 gRNA 靶向目标基因的第一个外显子之一（避免 3 bp 的倍数）效果很好（图 1A）。作为第一次测试，可以使用 PCR 模板在体外询问 gRNA 对模板识别的效率 26,40,62。在琼脂糖凝胶上模板 DNA 的还原和裂解的 DNA 产物的外观中可以看到有效的靶向和 Cas9 介导的切割（图 1B）。可以在用于皮质类器官生成的 iPSC 细胞系中进行进一步的 gRNA 检测。这需要 iPSC 的核转染，这可以通过成功的荧光报告基因表达来可视化（图 1C）。可以通过 Sanger 测序验证目标基因座的有效靶向，从而产生一个色谱图，该色谱图突然结束或叠加在靶向位点周围（图 1D），这是由非同源末端连接66 的双链断裂修复的插入缺失谱产生的。体外和 iPSC 细胞中的 Guide RNA 效率测试有助于选择用于皮质类器官基因消融的高效 gRNA 对。

在电穿孔之前，将皮质类器官切片，这支持识别用于注射电穿孔混合物的脑室腔（图 2A-C）。然后将注射的类器官转移到电穿孔室（图 2D）。对于电穿孔，应使用具有发达心室样结构的皮质类器官（图 2E），而应丢弃缺乏可见结构的皮质类器官（图 2F）。电穿孔混合物含有一种染料，可以在手术过程中可视化注射的心室（图 2G）。培养 1-3 天后，在荧光显微镜下通过天然 GFP 信号可以看到成功靶向的心室（图 2H）。

为了进行深入的组织学分析，可以进行冷冻切片的免疫组化。理想情况下，电穿孔皮质类器官中存在多个目标心室（图 3A、B）。最佳的电穿孔针对面向外部的类器官外部区域中的心室样结构（图 3C），因为这些通常是最扩张的心室。在某些情况下，电穿孔可能导致细胞过度死亡（图 3D、E），例如，当质粒浓度过高或电穿孔设置不理想时。与外部相比，面向类器官内部的电穿孔（图 3F）通常涉及脑室样结构的较小扩展区域。根据我们的经验，将定量分析集中在类器官的定义区域以减少变异性是有帮助的。有时，电穿孔可能会导致顶端表面的破坏（图 3G），例如，当注射量过高时，导致心室破裂，或者当电脉冲太强时，导致细胞分层。最后，当两个相邻的心室成为目标时（图 3H），可能很难分配皮质区的边界和目标细胞的来源。

免疫组织化学可用于验证 CRISPR/Cas9 介导的在目标细胞中蛋白质水平上的成功敲除（图 3I），此处通过靶向多梳抑制复合物 1 （PRC1） 蛋白 PCGF467 来举例说明。可以在对照与实验条件下分析 GFP 阳性细胞中的信号强度（图 3J）。或者，如果没有合适的抗体可用，可以通过 FACS 从皮质类器官60 中分离靶细胞，并通过 Sanger 或下一代测序36 进一步分析。此外，也可以使用 Western blotting 分析蛋白质水平的降低。

图 1:急性 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除的向导 RNA 设计和验证。 （A） 向导 RNA （gRNA） 设计策略的示意图，其中两个 gRNA 靶向目标基因的外显子。黑色箭头表示用于 gRNA 验证的模板制备的 PCR 引物。（B） 体外 gRNA 效率的验证。PCR 扩增的模板用 RNP 复合物消化。成功切割后，凝胶电泳后可以看到两个不同大小的条带（左），而低效 gRNA 的模板仍未切割（右）。（C） 用 RNP 复合物和 GFP 质粒进行核fect 3 天后人诱导多能干细胞 （hiPSC） 的明场图像（左）、GFP 荧光（中）和合并图像（右）。比例尺:350 μm。（D） 通过对 GFP 阳性细胞扩增的 DNA 进行 Sanger 测序来验证 hiPSC 中 gRNA 的效率。成功切割双链 DNA 后，测序轨迹显示从 gRNA 靶位点（上图，KO1）开始的叠加信号。在靶向不成功的情况下，与 LACZ 对照相比，DNA 序列轨迹保持不变（下图，KO2）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:切片人皮质类器官的电穿孔。 （A） 显示人皮质类器官 （hCO） 电穿孔工作流程的示意图。首先，将 hCO 切成 500 μm 厚的切片。两天后，将含有 GFP 表达质粒和 Fast Green 的 RNP 混合物注射到脑室样结构的管腔中，优先在 hCO 的外部区域。对于电穿孔，将 hCO 放置在电穿孔室中。培养数天后，可在电穿孔区域检测到 GFP 信号。（B） hCO 振动切片机的图像。类器官以块状形式包埋在培养基中的 3% 低熔点琼脂糖中（左）。将块切成 500 μm 厚的切片（中间）。切片的类器官通过宽口径移液器尖端（右）转移回培养皿中。（C） 显示将含有 RNP、pCAG-GFP 和 0.1% Fast Green 的混合物注射到类器官的脑室样结构中的图像。类器官浸没在 Tyrode 溶液中，并将薄玻璃毛细管插入心室样结构中心的管腔中（左）。镊子用于稳定类器官（左和中）。类器官外部的心室是目标（中）。注射的类器官被转移到电穿孔室，或者稍后转移到培养皿中，使用大口径移液器吸头（右）。（D） 电穿孔室的图像，它由一个玻璃培养皿和两个粘在玻璃上的金属刀片组成。金属刀片用作电极，并包含用于连接电缆以连接到电穿孔仪的孔。hCO 的注入面，通过绿色阴影可见，应面向阳极（正极，红色电缆）（右）。（E） hCO 的代表性图像显示发育良好的脑室样结构。较浅的环代表心室区样区域。心室样结构中心较暗的圆圈代表管腔，应作为注射目标。（F） 缺乏发达的心室样结构的 hCO 的代表性图像，我们建议不要将其包含在进一步的实验中。（G） 注射电穿孔混合物后 hCO 的代表性图像，其中目标区域通过快速绿（橙色箭头）可见。（H） hCO 的代表性图像显示电穿孔后 24 小时的天然 GFP 信号。比例尺:100 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:电穿孔切片人皮质类器官的免疫组织化学分析。（A） 表示具有绿色荧光信号的电穿孔人皮质类器官 （hCO） 的示意图。（B） 电穿孔后 7 天，具有多个电穿孔心室的冷冻切片 hCO 的 DAPI 染色（灰色）和 GFP 免疫荧光（绿色）。（C-H）不同电穿孔结果的示例图像，GFP（绿色）和细胞核（DAPI，灰色）染色。（C） 具有完整细胞核的最佳电穿孔（参见插入 1、D）、未被破坏的心室状结构以及面向类器官外部的区域的电穿孔细胞，这通常最为扩大。（E） hCO 在电穿孔区域显示大量细胞死亡的示例（另见插页 2、D），其特征是小的、DAPI 密集和扭曲的细胞核。（F） 成功定向到类器官内部的电穿孔，由于皮质板状区域与相邻心室合并，这通常更难解释。（G） 电穿孔区域中心心室样结构被破坏（橙色箭头）。（H） hCO 包含多个部分合并的较小心室的 hCO 示例，因此难以量化。（I） 靶向 LACZ（gLACZ KO，左）或 PCGF4（gPCGF4 KO，右）的 RNP 复合物电穿孔 7 天后，GFP（绿色）和 PCGF4（品红色）的 DAPI 染色（灰色）和免疫荧光用于 CRISPR/Cas9 介导的敲除。圆圈细胞突出显示 PCGF4 强度降低，表明基因消融成功。在 LACZ 控件（左）中可以看到均匀信号。（J） 该图显示了对照 （gLACZ KO） 和 PCGF4 的 KO （gPCGF4 KO） 在 GFP 阳性细胞中免疫荧光后相对于 gLACZ 条件下 PCGF4 中位表达的定量 PCGF4 强度。每个点代表一个单元格。来自同一 hiPSC 系的两个不同批次（灰色和黑色）的 3-4 个类器官的数据。p < 0.0001，Mann-Whitney 检验。所有图像均使用激光扫描共聚焦 （B、C） 或荧光 （E-I） 显微镜采集。这些图像表示 10-15 μm 厚的 z 堆栈的最大强度投影。白色虚线表示面向心室腔的顶端表面和 hCO 的外表面。橙色虚线表示合并脑室中的 VZ/SVZ 边界。比例尺:100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

表 1:用于免疫荧光染色的抗体和染料及其稀释度列表。

作者声明他们没有利益冲突。