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电穿孔转染人脑皮层类器官切片用于基因功能研究

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DOI：

10.3791/67598

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2024年11月29日

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

本文内容

摘要

本文介绍了通过电穿孔技术对人脑皮层类器官切片进行急性基因操作的方法。这些皮层类器官模型特别适合显微注射，因为切片后可轻易识别出类似脑室的结构，从而能够对人类皮层发育、神经发育障碍以及皮层进化进行功能研究。

摘要

人脑皮层类器官已成为研究人类大脑发育、神经发育障碍以及人类大脑进化的重要工具。通过过表达或基因敲除来分析基因功能的研究，在动物模型中已为揭示新皮层发育调控机制提供了关键见解。本文介绍了一种通过电穿孔对切片后的人脑皮层类器官进行CRISPR/Cas9介导的急性基因敲除的详细实验方案。对皮层类器官进行切片有助于识别类似脑室结构的区域，从而便于注射及后续的电穿孔操作，因此该模型特别适用于在人类皮层发育过程中进行急性遗传操作。我们描述了向导RNA的设计方法，并在体外及皮层类器官中验证了靶向效率。in vitro（体外）和皮层类器官中的靶向效率验证均被涵盖。电穿孔操作在神经发生中期进行，可靶向发育中新皮层中的大多数主要细胞类型，包括顶端放射状胶质细胞、基底前体细胞以及神经元。综上所述，对切片后的人类皮层类器官进行电穿孔是一种强大的技术手段，可用于研究皮层发育过程中的基因功能、基因调控以及细胞形态变化。

引言

新皮层指的是大脑半球的外层覆盖结构，是哺乳动物所特有的结构。新皮层是高级认知功能的中枢1,2,3,4,5。在发育过程中，神经干细胞和前体细胞通过称为神经发生的过程产生神经元。对人类新皮层发育的功能性研究为阐明人类神经干细胞调控机制、神经病理学以及人类大脑进化提供了基础2,6,7。

传统上，人类大脑发育的研究依赖于使用死后组织进行描述性的组织学方法，而近年来的游离式组织培养系统使得能够利用人类胎儿组织开展功能性研究8,9。此外，研究发现人类胎儿脑组织具有自我组织形成长期扩增类器官的能力10。胎儿组织研究为理解人类发育过程提供了重要见解11,12，但受限的组织可获得性以及伦理考量限制了其在人类大脑发育机制研究中的广泛应用。在过去十年中，已开发出一系列方案，能够从人类多能干细胞（hPSC）包括人类诱导多能干细胞（hiPSC）生成三维神经类器官13,14。

脑类器官展现出发育中大脑的重要特征，例如脑室样结构的形成、顶-基底极性、皮层细胞构筑、放射状胶质细胞分裂过程中的核间期迁移以及神经元迁移。尤为重要的是，这些新的人类类器官模型重现了人类发育中大脑的某些特性，而这些特性在小鼠模型中难以准确模拟，包括进化上关键的神经前体细胞类型，特别是外侧放射状胶质细胞（或称基底放射状胶质细胞）7,14,15。早期脑类器官培养方案存在的一些局限性——如类器官异质性、内部核心营养供应不足以及区域身份不一致等问题——已在近期的方案改进中得到部分解决，未来几年内预计还将进一步优化15,16,17,18,19。人类脑类器官和皮层类器官已迅速成为研究人类皮层发育20、神经系统疾病21,22,23,24、脑进化25,26,27,28,29以及开展大规模筛选研究的重要模型30,31,32。

对于急性遗传操作，在新皮层发育的动物模型中主要采用两种方法：通过感染靶细胞进行病毒递送33 和 在子宫内 或 体外 电穿孔34,35DNA注射——以及近期发展的CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物注射36- 注入侧脑室，随后进行电穿孔，其优势在于可根据电穿孔电极的方向靶向大脑的特定区域。电穿孔通过短暂的电脉冲暂时增加细胞膜通透性，从而将DNA及其他带电分子导入细胞内。 在子宫内 电穿孔首次在小鼠中进行37，迅速成为发育神经生物学中广泛应用的方法。随后，该方法也被应用于其他物种，如大鼠38,39 和雪貂40,41,42一种用于研究新皮层扩张和皮层折叠的脑回型物种3,43,44,45.

电穿孔也已成为人脑类器官研究中的重要方法46。在大脑类器官中，电穿孔已被用于可视化细胞形态和神经元轴突14,47，递送基因敲低试剂22,48,49，以及通过过表达研究基因功能50。该方法不仅限于人类模型，也已应用于灵长类动物大脑类器官的遗传修饰50,51。此外，已有研究报道了在Spin Ω旋转式生物反应器中生成的皮质类器官的电穿孔方法52。

本方案中，我们概述了人皮质类器官切片的电穿孔技术15 用于皮层发育中基因功能的研究。脑区特异性类器官提高了可重复性和一致性，这对于定量分析（例如在疾病建模中）的成功至关重要。在人脑皮层类器官切片实验方案中15，应用强效的模式化信号以指导iPSC分化，获得同质的背侧前脑前体细胞，随后使用促进组织生长且含有较少指导性信号的培养基53,54皮质类器官切片已被证明可减少因类器官核心区域营养和氧气供应不足导致的细胞死亡15此外，切片支持形成含有大量基底放射状胶质细胞的脑室样结构，并通过持续的神经发生导致类似皮质板区域的扩张15该方案中的重复切片操作使得这些皮质类器官特别适用于电穿孔实验，因为脑室腔易于通过注射进行识别和靶向。切片皮质类器官的电穿孔技术已被应用于基因调控区域及皮质进化研究。26,55.

在电穿孔过程中，注射混合物被递送至类似脑室结构的腔内。当施加脉冲电场后，衬于脑室壁的顶端放射状胶质细胞会摄取该混合物。随着顶端放射状胶质细胞分裂并产生更为特化的细胞类型4，电穿孔的试剂将传递至基底前体细胞和神经元。电穿孔后的子代细胞在电穿孔后3天分布于脑室区（VZ）和脑室下区（SVZ），至电穿孔后7天（处于神经发生中期）时，已广泛分布于大部分皮层壁，包括类似皮层板（CP）的区域26,55。

此处，我们描述CRISPR/Cas9介导的基因敲除56 通过电穿孔法在人脑皮层类器官切片中进行26此外，电穿孔法还可用于基因过表达、通过表达荧光蛋白来观察细胞形态和细胞过程、递送质粒文库用于大规模并行报告子检测（MPRA）、递送表观基因组编辑工具，以及对细胞进行标记以实现活体成像。

方案

所有涉及人诱导性多能干细胞（hiPSC）的实验均按照1964年《赫尔辛基宣言》规定的伦理标准进行，并已获得德累斯顿大学医院伦理审查委员会批准（IRB00001473；IORG0001076；伦理批准编号SR-EK-456092021）。

1. 急性CRISPR/Cas9介导基因敲除的向导RNA设计

  1. 使用软件或在线工具设计一对靶向同一外显子的向导RNA（gRNA），其原间隔序列邻近基序（PAM）之间的距离理想为7–11 bp（避免3 bp的倍数），以提高蛋白质功能被破坏的可能性。
    注意：理想情况下应靶向编码功能结构域的外显子。作为替代方案，也可选择转录本的第一个外显子（图1A）。根据活性评分（接近1）57 和特异性评分（接近100%）58 来选择向导RNA。

2. 人类诱导性多能干细胞的培养

  1. 为生成人皮层类器官并验证gRNA功能，使用来源于健康供体的hiPSC细胞系CRTDi004-A59。
  2. 按照先前所述方法60，将iPSCs在涂有基底膜基质的6孔板中，于标准条件（37 °C，5% CO2）下，使用干细胞培养基进行培养。诱导型PSCs应在达到80%融合度时传代，使用酶进行单细胞解离，并在最初24小时内补充ROCK通路抑制剂（1:1,000）。
    注意：其他iPSC细胞系也可用于类器官生成和gRNA功能验证。

3. 从人类诱导多能干细胞中提取基因组DNA

  1. 取6孔板中2孔汇合度为80%–90%的人诱导多能干细胞（hiPSC），用于基因组DNA提取。用酶消化法将细胞从培养板上解离，制成单细胞悬液。用1 mL干细胞培养基（总体积）重悬细胞，600 × g 离心10分钟，弃上清液。
  2. 用250 µL裂解缓冲液（50 mM TrisHCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、0.5% SDS、5 mM EDTA溶于H2O）重悬细胞沉淀，并加入12.5 µL蛋白酶K（10 mg/mL储存液）。55 °C、250 rpm条件下孵育2小时。
  3. 加入100 µL 5 mM NaCl，4 °C下18,000 × g 离心10分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。
  4. 加入250 µL异丙醇，反复倒置混匀，4 °C下18,000 × g 离心15分钟。
  5. 弃上清液，用500 µL 70%乙醇（分子生物学级）洗涤沉淀，倒置离心管，4 °C下18,000 × g 离心10分钟。
  6. 最后，小心用移液器彻底吸除上清液，并将开口离心管轻压在纸巾上以去除残留液体。
  7. 室温下空气干燥沉淀10分钟，然后在100 µL无核酸酶水中37 °C溶解30分钟。
  8. 使用分光光度计测定DNA浓度。提取的基因组DNA在-20 °C可稳定保存数月。

4. 通过gRNA验证模板识别体外)

注意：作为验证gRNA成功识别模板的第一种方法，执行以下操作 体外 Cas9 反应，其中双链 DNA 被切割成两个可通过琼脂糖凝胶电泳区分的片段40,61,62.

  1. 使用高保真PCR预混液和10 µM引物，以从hiPSC（第3节）中分离的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应（PCR），扩增条件如下：98 °C预变性30 s；40个循环（98 °C变性10 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸1 min）；最后在72 °C延伸5 min，以生成所需模板。
    1. 根据PCR引物调整退火温度。确保扩增子大小为800 bp至1.5 kb，且gRNA结合位点呈不对称分布。
    2. 在1.5%琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离PCR产物，从凝胶中切下相应条带 并提取DNA26.
    3. 使用分光光度计测定提取的PCR产物的DNA浓度。
  2. 将10 µM的CRISPR RNA（crRNA，定制序列，100 µM储存液）与10 µM的tracrRNA（100 µM储存液）在无核酸酶的双链缓冲液中混合，总体积为5 µL，以组装功能性gRNA。在95 °C孵育5分钟，随后使其自然冷却至室温（RT）。
  3. 通过将步骤 4.2 中的 10 µM gRNA 与 1 µM Cas9 酶（来自 Streptococcus pyogenes，62 µM 储存液）溶于 PBS，室温下孵育 15 分钟（总体积 25 µL）。
  4. 进行该操作 体外 消化反应，将1 µM RNP复合物（来自步骤4.3）与0.1 µM DNA模板（来自步骤4.1的PCR产物）及1x Cas9核酸酶反应缓冲液（含200 mM HEPES、1 M NaCl、50 mM MgCl₂）混合2，1 mM EDTA；pH 6.5；可分装后于 -20 °C 保存。
    1. 用无核酸酶水补足至终体积 10 µL。
    2. 37 °C 下孵育反应体系 1 小时。
    3. 加入终浓度为2 mg/mL的蛋白酶K，于56 °C继续孵育10分钟，以释放Cas9酶上的DNA底物。将消化后的反应混合物储存于4 °C或-20 °C，直至最终分析。
      注意：建议使用 Cas9-RNP 与 DNA 底物 10:1 的摩尔比，以获得最佳切割效率。如有需要，用无核酸酶水将 PCR 产物稀释至所需浓度。作为阴性对照，可设置缺少 gRNA 或 Cas9 酶的反应体系。
  5. 通过2%琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶电泳观察切割产物。
    注意：理想情况下应可见两条不同大小的条带，且对于高效的gRNA，模板条带应消失或显著减少（图1B).

5. 在人诱导性多能干细胞中验证gRNA功能

注意：建议测试靶向将用于生成皮质类器官的相同细胞系的 gRNA 的编辑效率26。为此，将含有相关 gRNA 的 RNP 复合物与表达 GFP 的质粒共转染至 hiPSCs 中，细胞培养 3 天后提取基因组 DNA 进行测序分析。每次 gRNA 测试大约需要 200,000 个细胞。细胞融合度不应超过 70%–80%，且在冻存后应至少传代两次。实验中应同时设置阴性对照（gLACZ）36,63 和模拟转染对照（仅核转染溶液，不含 RNP）。

  1. 在实验开始前2小时，在细胞培养超净台中更换含ROCK抑制剂（1:1,000）的hiPSC培养基，以提高细胞存活率。
  2. 用基底膜基质包被6孔板中适当数量的孔。
  3. 启动核转染仪（nucleofector unit）"X单位" 用于16孔条带）并选择程序 "ES 细胞，H9 如预设程序（脉冲 CB150）。选择条带中适当的孔数。
  4. 在Duplex Buffer中混合24 µM crRNA和24 µM tracrRNA以制备RNP复合物。
    1. 95 °C孵育5分钟，然后冷却至室温，步骤同4.2。
    2. 同时，用 PBS 将 Cas9 酶稀释至 8 µM。
    3. 将3 µL gRNA与3 µL Cas9混合，室温孵育15分钟以组装RNP。
      注意：gRNA与Cas9的摩尔比为3:1时，可获得最佳切割效率。若需成对测试gRNA，应分别制备每个RNP，最后将各1.5 µL的两种RNP混合。
  5. 在RNP孵育的15分钟期间，在细胞培养超净台中准备hiPSC以进行核转染。
    1. 每孔加入1.5 mL干细胞培养基，添加ROCK抑制剂（1:1,000）和1×青霉素/链霉素，替换基底膜涂层。
    2. 按照制造商说明书，在冰上配制核转染溶液的主混合液。
    3. 将hiPSCs从培养板上解离，制备成单细胞悬液（如第2节所述），并使用台盼蓝染色在Neubauer计数板中进行细胞计数。
    4. 每对gRNA对应收集200,000个活细胞，离心条件为600 × g g 5分钟。
  6. 在细胞培养超净台中，置于冰上 将3 µL RNP加入20 µL核转染溶液中，再加入0.2 µg/µL pCAG-GFP质粒。
  7. 将沉淀的细胞重悬于23 µL最终核转染混合液中，并转移至预冷的16孔核转染条带的1个孔内。
  8. 将所有条件加入条带后，将其放入生物安全柜外的核转染仪X单元中，并按下 开始 启动核转染的按钮。
  9. 随后，将核转染条带转移回细胞培养超净台中，并用6孔板中的部分培养基冲洗条带孔，将转染后的细胞转移至已准备好的6孔板中。
  10. 将hiPSC培养3天，每天更换含有1x青霉素/链霉素的培养基。24小时后，不再需要ROCK抑制剂。
  11. 在常规荧光显微镜下检测GFP信号（图1C).
    1. 第3天，通过荧光激活细胞分选（FACS）对GFP阳性细胞进行分选并收集。
    2. 用 PBS 配制含 2% FBS 的分选缓冲液，置于 4 °C 保存。
    3. 将台式离心机预冷至 4 °C。准备 1.5 mL 反应管，每管中加入含 ROCK 抑制剂（1:1,000）的 50 µL 分选缓冲液，用于在冰上收集 FACS 分选后的细胞；同时准备带细胞滤网帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管，并置于冰上。
    4. 制备核转染细胞的单细胞悬液。
    5. 将细胞重悬于1 mL含ROCK抑制剂（1:1,000）的干细胞培养基中，每样本一份 并以 600 x g 5 分钟。
    6. 移除上清液，将细胞重悬于200 µL含ROCK抑制剂（1:1,000）的分选缓冲液中，然后加入0.4 µL DAPI（2 ng/µL），用于通过FACS鉴定活细胞。
    7. 用移液器将细胞溶液经冷却的圆底管的细胞筛网帽吹打通过，以去除任何残留的细胞团块。
      注意：DAPI 可能会随着时间的推移影响细胞活力，因此在分选前最好为每个样品新鲜添加。
    8. 将10,000个活的GFP阳性（DAPI阴性）细胞分选至预先准备好的含有50 µL含ROCK抑制剂的分选缓冲液（置于冰上）的1.5 mL离心管中。
  12. 分选细胞后，直接提取基因组DNA。
    1. 将收集的分选细胞在分选缓冲液中以 600 x g 10 分钟。
    2. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL裂解缓冲液中，每样本加入12.5 µL蛋白酶K。
    3. 继续按照第3节所述操作。
    4. 最后，将DNA沉淀溶解于50 µL无核酸酶的水中。
  13. 按照步骤4.1所述，进行PCR以生成用于Sanger测序的模板。作为对照，使用来自g的DNALACZ 条件及针对目的基因的引物（与第4节中使用的引物相同）。从琼脂糖凝胶电泳中切取相应条带，通过柱纯化，送样进行Sanger测序。
  14. 使用成对全局比对法对Sanger测序结果进行比对。
    注意：成功的靶向可通过gRNA结合位点周围随机插入/缺失导致的信号重叠或序列不完整来识别图1D).

6. 人皮层类器官切片的制备

注意：人皮质类器官（hCO）的制备采用此前详细描述的切片新皮质类器官（SNO）方法15,60。

  1. 用1 mg/mL胶原酶在37 °C孵育30–40分钟，从6孔板的1个孔中解离出较小的hiPSC集落。同时，用基底膜基质包被一个新的6孔板。
    1. 加入1 mL干细胞培养基终止酶反应，并使用宽口吸头将集落收集至含5 mL干细胞培养基的15 mL锥形管中。
      注意：任何提及"wide-bore pipet tips"的步骤也可使用剪切后开口直径至少为2 mm的吸头完成。
    2. 待集落沉降至管底后，吸除旧培养基，并更换为新鲜的干细胞培养基。
    3. 使用宽口吸头将集落均匀分配至包被好的6孔板中，每孔加入1.5 mL干细胞培养基。
    4. 在标准条件下培养hiPSC 2–3天。
  2. 当hiPSC集落直径达到约1.5 mm时，再次使用1 mg/mL胶原酶在37 °C孵育最多1小时，将所有集落解离。
    1. 加入6 mL前脑培养基115终止酶反应，并使用宽口吸头将解离的集落收集至15 mL锥形管中。
    2. 待集落沉降后，吸除旧培养基，并用5 mL前脑培养基1洗涤。
    3. 最后，使用宽口吸头将集落转移至含有前脑培养基1（每孔3 mL）的超低吸附6孔板中，使其形成胚体（EB）。此步骤标记为人类皮层类器官实验方案的第0天。此后按照已发表的方案进行操作15。
  3. 在第7天，将EB包埋于基底膜基质中，每个"cookie"约含20个EB，并在前脑培养基2中培养1周15。第14天时，机械法将类器官从基质中释放，并继续在6孔超低吸附板中、前脑培养基315中，于120 rpm的摇床上持续培养。
  4. 从第35天开始，培养基中补充1% v/v基底膜基质。
  5. 第6周时，将类器官包埋于3%低熔点琼脂糖中，并使用振动切片机切成500 µm厚的切片（图2A，B），以支持类器官内部的氧气和营养供应。如有必要，每4周重复一次类器官切片操作。
  6. 从第70天起，将类器官在前脑培养基415中进行培养。

7. 人类皮层类器官切片的电穿孔

注意：人脑皮层类器官一旦出现类似脑室的结构即可进行注射和电穿孔操作，大约从第2周开始即可实施。对于较晚期的类器官（第5周及以上），在类器官切片后2天进行电穿孔操作效率最高，且细胞存活状态最佳26,55。切片后，类似脑室的结构易于识别，有助于注射操作（图2C、D）。此外，切片后类似脑室的结构在一段时间内仍部分保持开放状态，使多余的注射液得以排出，从而保护衬于脑室腔面的黏附连接带的完整性。切片时间安排可根据实验时间线进行调整。对于长期培养的类器官，应每隔3至4周重复切片一次。

  1. 使用微毛细管拉制仪，按照以下参数拉制用于注射的硼硅酸盐玻璃毛细管P 500，加热 600，拉速 30，速度 40，时间 1将毛细管用胶带固定后，存放于大型培养皿中。
  2. 电穿孔当天，按照步骤5.4所述方法新鲜配制CRISPR/Cas9 RNP复合物，终浓度为24 µM RNP。共电穿孔0.1 µg/µL pCAG-GFP质粒（或其他任何荧光报告基因质粒）有助于识别电穿孔成功的细胞。此外，在最终注射混合液中加入0.1%的Fast Green水溶液，以便确认混合液已成功递送。
    注意：针对每个目标基因和 g 分别配制混合液LACZ 对照
  3. 预热Tyrode's溶液（一包Tyrode's盐，1 g NaHCO₃，溶于1 L蒸馏水）3，1 L 去离子水中含 13 mL 1 M HEPES（pH 7.25）2O）升至 37 °C。将剩余的 Tyrode 溶液在 4 °C 下保存数月。
  4. 选择具有发育良好、类似心室结构的 hCO图2E）并弃去未显示脑室样结构的类器官（图 2F将最多10个类器官转移至含有台氏液的6 cm培养皿中，其余人结肠类器官保留在培养箱内。
  5. 使用微量移液器吸头将10 µL注射溶液吸入玻璃微毛细管中，并用镊子夹断毛细管的细端以打开开口。通过向台氏液中释放少量注射混合液来检查毛细管是否通畅。使用微注射仪在连续模式下进行注射，并通过脚踏开关控制注射时机。
  6. 将毛细管插入类心室结构的中心图 2C）并用脚踏开关控制，注入 0.2–0.5 µL 混合液。
    注意：每个 hCO 最多可注射 5 个脑室，每批处理 7–8 个 hCO。理想情况下应选择朝向 hCO 外侧的脑室进行注射，因为这些脑室通常发育最为完善。图 2G，H).
  7. 使用精细镊子轻推类器官以限制其移动，切勿直接夹取类器官。图2C).
  8. 注射后，使用宽口移液枪头将1-2个类器官转移至含有台罗德溶液的电穿孔室中（图2C，D).
  9. 将已注射的类器官朝向电极，使类器官外侧面向的室样区域中的顶端正放射状胶质细胞成为靶点。
  10. 将电缆连接到电穿孔室，使类器官的注射侧朝向正极（阳极； 图 2D).
  11. 按压 脉冲 按下电穿孔仪的按钮，以38 V电压进行5次电穿孔，每次持续50 ms，间隔1 s。
    注意：电穿孔参数可能取决于所用电穿孔仪的型号，可能需要进行优化。
  12. 重复注射和电穿孔步骤，直至处理完所需数量的类器官。
  13. 在室温下将电穿孔处理的类器官收集到培养基中，直至同一条件下的所有样本均处理完毕。确保类器官在孵箱外的总时间不超过30分钟。
  14. 随后，将电穿孔处理的hCOs放回适当的培养基中，在最初24小时内静置培养，不进行摇动。
    注意：转染后2-3天，应在荧光体视显微镜下观察到电穿孔的hCOs中出现GFP信号图 2H）。电穿孔后分析的时间点应根据所要回答的生物学问题来选择。电穿孔后3至7天，GFP阳性细胞分布在室管膜区（VZ）、室下区（SVZ）和皮层板（CP）中。15,60.

8. 电穿孔人脑皮层类器官的固定与冷冻切片

  1. 在2 mL离心管中，用4%多聚甲醛（PFA）于室温固定电穿孔后的类器官30分钟。
    注意：PFA具有毒性和致癌性。所有涉及PFA的操作均应在通风橱中进行。强烈建议佩戴腈类手套和护目镜。
  2. 用PBS洗涤一次，每次5分钟，并将组织置于含30%蔗糖的PBS中（经无菌过滤），4 °C保存，直至组织完全被蔗糖饱和。
  3. 将固定后的类器官包埋于冷冻组织包埋介质中，加入含15%蔗糖的PBS，于干冰上制成包埋块。
  4. 在冷冻切片机上制备20–30 µm的切片，并将组织切片收集至防脱载玻片上26,64。
    备注：本实验方案可在固定后的类器官已浸入蔗糖溶液（4 °C下可稳定保存数月）或已包埋于包埋介质中（冷冻包埋块可密封于防潮袋中，在-20 °C保存数月至数年）时暂停。

9. 电穿孔人皮质类器官的免疫组织化学分析

  1. 进行免疫组织化学分析26,64时，在水浴中于70 °C条件下使用柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% 吐温-20，溶于dH2O，pH 6.0）进行抗原修复，持续1小时。
  2. 用PBS洗涤一次，每次5分钟，然后短暂干燥载玻片，并用蜡笔圈出组织区域。
  3. 使用PBS（pH 7.4）中含0.1 M甘氨酸的溶液在室温下封闭30分钟，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  4. 用封闭液（10%马血清，0.1%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇溶于PBS）覆盖组织区域，在室温下孵育30分钟。
  5. 将一抗用封闭液稀释后加入，于4 °C条件下孵育过夜。
  6. 次日，用PBS洗涤三次，每次5分钟；加入二抗和DAPI的封闭液，在室温下孵育1小时，再用PBS洗涤三次，每次5分钟。
  7. 将载玻片用封片剂封片，并在荧光显微镜下观察成像（图3）。
    注意：建议加入针对注射混合物中所用荧光染料的抗体，以识别靶向细胞，因为固定后内源性信号通常会被淬灭。用于免疫荧光染色的抗体和染料如图3所示，列于表1中。

10. 在蛋白质水平验证 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除

  1. 为了在蛋白质水平验证基因敲除效果，对电转染的类器官进行靶蛋白的免疫组织化学染色（图3I）。
  2. 使用相同的成像参数对gLACZ对照组和靶向类器官进行成像，以便比较荧光强度（图3I，J）。应按照区域特异性方式进行，以比较其对发育中新皮层不同细胞类型的影响。使用ImageJ/Fiji软件（插件Cell Counter）进行细胞计数，或利用StarDist插件进行分割分析65。

结果

CRISPR/Cas9介导的基因敲除需要设计gRNA。通常，针对目的基因的首个外显子之一，使用一对间隔为7-11 bp（避免3 bp的倍数）的gRNA进行靶向，效果较好（图1A）。作为初步测试，可检测gRNA对模板的识别效率 体外 使用 PCR 模板26,40,62. 在琼脂糖凝胶上可观察到模板DNA的减少以及切割后DNA产物的出现，表明高效的靶向定位和Cas9介导的切割图1B）。可进一步在用于皮质类器官生成的iPSC细胞系中进行gRNA验证。该过程需要对iPSC进行核转染，可通过成功的荧光报告基因表达进行观察图1C）。可通过Sanger测序验证对目标位点的有效靶向，结果表现为色谱图在靶向位点附近突然终止或出现重叠峰图1D），由非同源末端连接修复双链断裂所导致的一系列插入缺失突变（indels）引起66. 向导RNA效率检测 体外 在iPSC细胞中，有助于筛选用于皮层类器官基因敲除的高效gRNA配对。

在电穿孔之前，需对皮质类器官进行切片，以利于识别脑室腔并注入电穿孔混合液（图 2A-C）。注射后的类器官随后转移至电穿孔腔室（图 2D）。进行电穿孔时，应选用具有明显发育良好的类脑室结构的皮质类器官（图 2E），而缺乏可见结构的皮质类器官则应弃用（图 2F）。电穿孔混合液中含有染料，可在操作过程中可视化被注射的脑室（图 2G）。在培养 1–3 天后，成功靶向的脑室可通过荧光显微镜下观察内源性 GFP 信号而被识别（图 2H）。

为了进行深入的组织学分析，可对冷冻切片进行免疫组织化学染色。理想情况下，一个电穿孔的皮层类器官中应存在多个靶向的脑室结构（图3A，B）。最佳的电穿孔应靶向类器官外侧区域、朝向外侧的类脑室结构（图3C），因为这些通常是扩张最明显的脑室。在某些情况下，电穿孔可能导致过度的细胞死亡（图3D，E），例如当质粒浓度过高或电穿孔参数不理想时。朝向类器官内部的电穿孔（图3F）通常涉及的类脑室结构扩张程度较外侧区域小。根据我们的经验，将定量分析集中于类器官的明确定义区域有助于减少变异性。有时，电穿孔可能导致顶面结构破坏（图3G），例如当注射体积过大导致脑室破裂，或电脉冲过强引起细胞去层化。最后，当两个相邻的脑室同时被靶向时（图3H），可能难以界定皮层区域的边界以及被靶向细胞的来源。

免疫组织化学可用于在目标细胞的蛋白水平验证CRISPR/Cas9介导的基因敲除是否成功（图3I），此处以靶向Polycomb抑制复合物1（PRC1）的PCGF4蛋白为例67。可在对照组与实验组条件下，分析GFP阳性细胞中的信号强度（图3J）。或者，若无合适的一抗可用，则可通过FACS从皮层类器官60中分离靶向细胞，并进一步通过Sanger测序或高通量测序进行分析36。此外，也可通过蛋白质印迹法（Western blotting）分析蛋白水平的降低情况。

CRISPR基因编辑；gRNA效率；凝胶电泳；GFP荧光；测序数据分析
图1急性CRISPR/Cas9介导基因敲除的向导RNA设计与验证 (A) 靶向目的基因外显子的两条向导RNA（gRNA）设计策略示意图。黑色箭头表示用于gRNA验证的模板制备过程中所用的PCR引物。BgRNA 效率的验证 体外PCR扩增的模板经RNP复合物消化。成功切割后，琼脂糖凝胶电泳可观察到两条不同大小的条带（左），而低效率的gRNA则模板保持未切割状态（右）。(C明场图像（左）、GFP荧光图像（中）及合并图像（右），显示人诱导性多能干细胞（hiPSCs）在使用RNP复合物与GFP质粒进行核转染后3天的表达情况。比例尺： 350 µm. (D通过Sanger测序对GFP阳性细胞中扩增的DNA进行gRNA效率验证。当双链DNA成功被切割后，测序结果从gRNA靶向位点开始显示出重叠的信号峰（上图，KO1）；而在靶向未成功的情况下，DNA测序峰图与对照相比在gRNA靶向位点处无变化（下图，KO2）。 LACZ 对照 请点击此处以查看此图的放大版本。

人脑类器官培养：切片、注射、电穿孔；实验示意图与结果。
图 2：人皮质类器官切片后的电穿孔。（A）人皮质类器官（hCOs）电穿孔操作流程示意图。首先，将 hCOs 切成 500-µm 厚的切片。两天后，将含有 GFP 表达质粒和快绿（Fast Green）的核糖核蛋白（RNP）混合物注射至类器官外周区域优先形成的类脑室结构腔内。进行电穿孔时，将 hCOs 置于电穿孔室中。经过数天培养后，可在电穿孔区域检测到 GFP 信号。（B）hCOs 振动切片图像。将类器官包埋于培养基中含 3% 低熔点琼脂糖的琼脂块中（左）。将琼脂块切成 500-µm 厚的切片（中）。使用宽口移液吸头将切片后的类器官转移回培养皿中（右）。（C）将含有 RNP、pCAG-GFP 和 0.1% 快绿的混合物注射至类器官类脑室结构中的图像。类器官浸没于 Tyrode 溶液中，用细玻璃毛细管插入类脑室结构中心腔内（左）。使用镊子固定类器官（左和中）。以类器官外周的脑室为靶点（中）。注射后的类器官用宽口移液吸头转移至电穿孔室，或后续转移至培养皿中（右）。（D）电穿孔室图像，由一个玻璃培养皿和两个粘附在玻璃上的金属刀片构成。金属刀片作为电极，并带有用于连接电穿孔仪电缆的孔。通过绿色阴影可见的 hCO 注射侧应朝向阳极（正极，红色电缆）（右）。（E）具有发育良好类脑室结构的 hCOs 的代表性图像。较亮的环状区域代表类似脑室区的区域。类脑室结构中心的深色圆圈代表腔室，应作为注射靶点。（F）缺乏发育良好类脑室结构的 hCOs 的代表性图像，建议不将其用于后续实验。（G）注射电穿孔混合物后 hCOs 的代表性图像，其中可通过快绿染料观察到靶向区域（橙色箭头）。（H）电穿孔后 24 小时 hCOs 中天然 GFP 信号的代表性图像。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

DAPI/GFP显微镜下的胚胎模式化阶段；细胞死亡、脑室形成分析。
图3：电穿孔处理的人类皮层类器官切片的免疫组织化学分析。（A）示意图显示一个带有绿色荧光信号的电穿孔人类皮层类器官（hCO）。（B）电穿孔后7天，经冷冻切片处理的hCO的DAPI染色（灰色）及GFP免疫荧光（绿色），可见多个电穿孔的脑室结构。（C-H）不同电穿孔结果的示例图像，经GFP（绿色）和细胞核（DAPI，灰色）染色。（C）一次理想的电穿孔结果，细胞核完整（见插图1，D），具有未受破坏的类脑室结构，且电穿孔细胞位于类器官外侧区域，该区域通常最为扩张。（E）显示电穿孔区域出现大规模细胞死亡的hCO示例（亦见插图2，D），表现为小而DAPI密集且形态扭曲的细胞核。（F）成功将电穿孔靶向类器官内部的示例，由于皮层板样区域与相邻脑室融合，通常较难解析。（G）电穿孔区域中心出现断裂的类脑室结构（橙色箭头）。（H）一个包含多个较小脑室的hCO示例，这些脑室部分融合，因此难以定量。（I）电穿孔7天后，对靶向LACZ（gLACZ KO，左侧）或PCGF4（gPCGF4 KO，右侧）的RNP复合物进行CRISPR/Cas9介导的基因敲除后，DAPI染色（灰色）、GFP免疫荧光（绿色）和PCGF4染色（洋红色）的结果。圈出的细胞显示PCGF4信号强度降低，表明基因成功敲除。在LACZ对照组（左侧）中可见均匀的信号。（J）该图显示了对照组（gLACZ KO）和PCGF4敲除组（gPCGF4 KO）GFP阳性细胞中PCGF4免疫荧光强度的定量结果，以gLACZ条件下的PCGF4中位表达水平为参照。每个点代表一个细胞。数据来自同一hiPSC细胞系的两个不同批次的3-4个类器官（灰色和黑色）。**** p < 0.0001，Mann-Whitney检验。所有图像均使用激光扫描共聚焦显微镜（B，C）或荧光显微镜（E-I）采集。图像为10-15 µm厚z轴层叠的最大强度投影。白色虚线表示朝向脑室腔的顶面以及hCO的外表面。橙色虚线表示融合脑室中的VZ/SVZ边界。比例尺：100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

抗体/染料稀释比例
Chicken anti-GFP1:2,000
Mouse anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken1:1,000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit1:1,000
DAPI1 mg/mL 储存液；1:1,000

表1：免疫荧光染色所用抗体与染料及其稀释比例。

讨论

人脑类器官和皮质类器官已成为研究人类新皮质发育的关键模型7,16,17。在人类疾病建模中，同基因型的人诱导多能干细胞（hiPSC）系及其衍生的类器官已成为金标准68。然而，由于建立新的iPSC细胞系耗时且成本高昂，对皮质类器官模型进行急性基因功能干预的方法已被广泛应用。

大脑类器官和皮质类器官的电穿孔技术14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 易于实施，许多传统上使用动物模型进行功能研究的实验室都已配备所需的工具。用于注射 体内，通常以侧脑室为靶点34,36,37,39,40,41,42这些结构在皮质类器官中以类似脑室的结构建模，具有可注射的中央腔。皮质类器官的电穿孔主要靶向衬于脑室腔壁细胞的末端足，通常是顶端放射状胶质细胞。69靶向效率在不同实验间存在差异，但通常在电穿孔后3至7天，每个类器官可获得数百至一千个GFP阳性细胞。人类神经前体细胞的细胞周期持续时间大约是小鼠的两倍，小鼠顶端放射状胶质细胞的细胞周期为14小时，而基底前体细胞为23小时。70因此，转染3天后，主要为顶侧放射状胶质细胞和中间前体细胞呈GFP阳性，而7天后GFP阳性细胞则分布于类器官的各个区域。电穿孔数月后仍可观察到GFP信号，此时GFP阳性细胞主要为分散于整个类器官中的神经元，使我们能够分析单个细胞的形态。在明场显微镜下可识别出类似脑室区域的阶段，可实现对衬于脑室壁的神经前体细胞的有效靶向。在本实验方案中15，这在皮质类器官发育的第2周至第12周是可行的，此后脑室会缩小并不再可见。对于有经验的实验人员，一次操作可成功注射50至80个类器官。

尽管顶端放射状胶质细胞的子代在细胞分裂过程中可继承基因操作试剂，但使用标准电穿孔方法无法直接靶向成熟的细胞（如神经元和星形胶质细胞）。因此，病毒靶向技术已被应用于神经系统中的有丝后细胞33,71。其中，重组腺相关病毒（AAVs）因其易于制备且能高效转导终末分化的细胞，被广泛用于神经系统中的基因转移71。此外，AAVs 可靶向特定的神经元亚群。不同的病毒靶向方法，包括使用腺病毒、仙台病毒和慢病毒，已在脑类器官和皮层类器官中得到应用15,25,29,30,32,47,72,73,74。

脑类器官培养方案的一个局限性在于，由于氧气和营养供应受限，类器官中心容易形成坏死核心。已有多种策略被用于改善类器官中心区域的细胞存活率，包括将类器官培养于旋转式生物反应器中14,54、与内皮细胞共培养或采用生物工程手段模拟血管化75,76、将类器官移植至啮齿类动物模型18,77，以及对类器官进行切片处理15,47。在本研究中，我们采用了人源皮层类器官切片方案，该方法已被证明可显著减少类器官核心区域的缺氧状况，并支持脑室样结构和皮层板样区域的扩展15。此外，对脑类器官进行切片也有利于对位于脑室下区的基底放射状胶质细胞进行活体成像，从而构建细胞命运决定图谱72。同样，活体成像技术也被用于研究在气液界面培养的切片脑类器官，该培养方式有助于神经元存活和轴突发育47。我们发现，人源皮层类器官的切片处理还使这类模型特别适用于电穿孔操作，因为在切片后脑室样结构可被清晰识别。对皮层类器官进行电穿孔可实现DNA质粒的导入，这些质粒传统上用于基因过表达，而近期也被用于递送完整的质粒文库55，以及递送CRISPR/Cas9基因编辑工具以失活特定基因功能26。

CRISPR/Cas9 技术革新了基因功能的研究56,57,58,63,66在本方案中，我们概述了gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物的应用36 用于人脑皮层类器官中急性基因失活。gRNA效率的初步验证已进行 体外首先在体外试管中进行，其次在诱导多能干细胞（iPSCs）中进行。我们发现，这些简单的初步测试有助于筛选出有潜力的gRNA配对，尤其是在缺乏有效抗体的情况下。随着越来越多针对CRISPR/Cas9介导基因敲除的工具被充分表征，未来这些初始验证步骤或许可以省略。尽管从iPSCs中分离的目标DNA区域进行高通量测序具有更高的定量性和信息含量，但我们发现，在gRNA的预筛选阶段，Sanger测序通常能提供更快的结果。最终，在皮层类器官中验证CRISPR/Cas9编辑的高效性，并在目标细胞中确认蛋白水平的降低，是证明CRISPR/Cas9介导基因敲除成功的最确凿证据。

对切片的人类皮质类器官进行电穿孔，可实现急性基因操作，用于基因功能获得和功能缺失研究，细胞形态及神经元轴突的可视化，质粒文库的递送以进行筛选和大规模并行报告基因检测，细胞标记以用于活体成像，以及表观基因组编辑工具的递送。因此，对切片的人类皮质类器官进行电穿孔是一种强大的方法，可揭示人类皮质发育、神经发育障碍以及皮质进化过程中的机制性见解。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢CRTD和德累斯顿概念（Dresden Concept）合作伙伴所提供的卓越支持，特别是干细胞工程设施的K. Neumann及其团队、光学显微镜设施的H. Hartmann及其团队、流式细胞术设施的A. Gompf及其团队，以及马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所（MPI-CBG）车间的Hartmut Wolf在电穿孔腔室构建方面提供的帮助。我们感谢Joshua Schmidt对本文稿提出的反馈意见。MA感谢德累斯顿工业大学再生疗法中心、德国研究基金会（DFG，Emmy Noether项目，AL 2231/1-1）以及Schram基金会提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL PP 离心管，锥形Corning430791
4D-核转染核心单元Lonza
4D-核转染 X 单元Lonza
5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞过滤帽CorningFalcon 352235
6 孔板，nunclon 处理Thermo Fisher140675用于 hiPSC 培养
6 孔板，超低吸附Corning3471用于类器官培养
A83-01STEMCELL Technologies72022前脑培养基 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
空气压缩机Aerotec
Alexa Fluor 488 驴抗鸡 IgY（IgG）（H+L）Jackson Immuno Research703-545-155二抗，RRID: AB_2340375；稀释比例 1:1000
Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG（H+L）InvitrogenA-31572二抗，RRID: AB_162543；稀释比例 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA，2 nmolIntegrated DNA technologies定制设计（订购为 2 nmol）
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNAIntegrated DNA technologies10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 核酸酶 V3Integrated DNA technologies1081060100 µg，来源于化脓性链球菌
两性霉素 B（Fungizone）Gibco15290018前脑培养基 2、3 和 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
抗-GFP 一抗（鸡，多克隆）Abcamab13970RRID: AB_300798；稀释比例 1:2000
抗-PCGF4 一抗（小鼠，单克隆）Millipore05-637 RRID: AB_309865；稀释比例 1:300
ApoTome 荧光显微镜Zeiss
抗坏血酸Sigma Aldrich1043003前脑培养基 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27 补充剂（+ 维生素 A）Gibco17504044前脑培养基 3、4   (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
香蕉转 Micrograbber 电缆套件Harvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-热循环仪（PCR 仪）Analytik Jena846-2-070-723
毛细管，含细丝的硼硅酸盐玻璃，外径 1.2 mm；内径 0.69 mm；长度 10 cmScience ProductsBF120-69-10需拉制至特定厚度
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052前脑培养基 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IV 型胶原酶Gibco17104019
CRTDi004-A中国台湾 CMCB DD 干细胞工程设施https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A来自健康供体的单细胞适应性 hiPSC 系
DAPIRoche102362760011 mg/mL 储液，免疫荧光使用时稀释 1:1000
二丁酰-cAMPSTEMCELL Technologies73884前脑培养基 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12，含 HEPESFisher Scientific31330095前脑培养基 1、2 和 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
背侧形态发生素（Dorsomorphin）STEMCELL Technologies72102前脑培养基 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 镊子，直头，11 cmFine Science Tools11295-51
ECM 830 方波电穿孔系统Harvard Apparatus BTX45-2052
乙醇Sigma Aldrich32205-1L-M
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma AldrichEDS-500G
快绿 FCFSigma AldrichF7252
胎牛血清（FBS）GE Healthcare SH30070.03 
Flaming/Brown 微量移液管拉制仪Sutter Instrument Co.P-97用于微毛细管的拉制
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a Geneious软件版本 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG；下划线核苷酸 = PAM
GlutaMAXGibco 35050038前脑培养基 1、2、3 和 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
甘氨酸Sigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1本文5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG（对应图 3I+J 中的 KO 图像）
gPCGF4 KO2本文5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG（对应图 3I+J 中的 KO 图像）
HEPES实验室自制1 M 储液
马血清，热灭活Gibco26050088
人 GDNF 重组蛋白Thermo Fisher450-10前脑培养基 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
人/小鼠/大鼠 BDNF 重组蛋白Thermo Fisher450-02前脑培养基 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
盐酸（HCl）Sigma Aldrich258148用于配制 TrisHCl
ImmEdge（蜡）笔Vector LaboraoriesH-4000
人胰岛素溶液Sigma Aldrich I9278前脑培养基 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
异丙醇Fisher ScientificBP2618-1
Knockout 血清替代物Gibco 10828-010前脑培养基 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
激光扫描共聚焦 980 显微镜Zeiss
低熔点琼脂糖，超纯Thermo Fisher16520100用于 hCOs 振动切片时的包埋
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无 LDEVCorning354230用于类器官培养
Matrigel hESC 认证基质，无 LDEVCorning354277用于 hiPSC 培养
MgCl2，1 MThermo FisherAM9530G
微量注射器 PicoPump + 脚踏开关World Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader 移液器吸头 0.5 至 20 µLEppendorf5242956003用于玻璃毛细管的加样
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850干细胞培养基
N-2 补充剂Gibco17502048前脑培养基 2 和 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next 高保真 2x PCR 主混合液 New England BiolabsM0541S
Neubauer 计数室Brand718605
Neurobasal 培养基Gibco21103049前脑培养基 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
非必需氨基酸Gibco 11140050前脑培养基 1、2、3 和 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
无核酸酶双链缓冲液Integrated DNA technologies1072570
O.C.T. 化合物Tissue-Tek4583冷冻组织标本的包埋介质
P3 原代细胞 4D-核转染 X 试剂盒 SLonzaV4XP-3032
多聚甲醛Fisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way 包埋模具 截短型 T12Polysciences Inc.18986-1用于 hCOs 振动切片和冷冻切片的包埋
青霉素-链霉素（10,000 U/mL） Gibco15140122前脑培养基 1、2、3 和 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15，以及核转染后干细胞培养基
培养皿 60 mm x 15 mm，无通气孔，无菌CorningBP50-02
培养皿铂金电极室，5 mm 间隙Harvard Apparatus BTX45-0504
磷酸盐缓冲液（PBS）实验室自制
蛋白酶 KSigma AldrichP2308来源于灰色链霉菌；10 mg/mL 储液
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28706
RHO/ROCK 通路抑制剂（Y-27632）STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232前脑培养基 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
二水合柠檬酸钠Sigma AldrichW302600-1KG-K
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma AldrichL3771
蔗糖 Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus 粘附载玻片Fisher Scientific10149870
SZX10 配 KL 300 LEDOlympusSZX10或替代体视显微镜
恒温振荡器Grant bioPSC24N
吐温-XSigma AldrichT9284又称 Octoxinol 9
Trizma 碱Sigma AldrichT1503用于配制 TrisHCl
台盼蓝溶液，0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express 酶（1x）Thermo Fisher12604021用于制备单细胞悬液的解离酶
吐温 20Sigma AldrichP1379又称聚山梨酯 20
台氏盐Sigma AldrichT2145-10x1l
振动切片机（vibratome）LeicaVT1200 S
宽口 1000 µL 通用滤芯吸头CorningTF-1005-WB-R-S
β-巯基乙醇Gibco 21985-023前脑培养基 1、3 和 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15

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