高通量解离与原位移植乳腺癌患者来源的异种移植瘤

摘要

本方案描述了一种高效、非手术的小鼠原位移植乳腺癌患者来源异种移植瘤的方法。该技术包括酶解法解离肿瘤组织，随后直接注射至乳腺脂肪垫中，可实现高通量移植。通过全面的验证确保模型的可靠性，有助于开展针对多种乳腺癌亚型的严谨研究。

摘要

患者来源的异种移植模型（PDX）提供了一种临床相关的方法，用于重现肿瘤涉及的细胞类型及肿瘤微环境，这对于推进乳腺癌（BC）的研究至关重要。此外，PDX模型可用于研究乳腺癌的全身性效应，而这是体外模型无法实现的。传统的乳腺癌异种移植植入方法通常需要麻醉和无菌手术操作，耗时较长、具有侵入性，并限制了PDX模型在乳腺癌研究中的可扩展性。本实验方案描述了一种简单且可扩展的小鼠原位植入乳腺癌PDX的方法。本研究采用免疫缺陷小鼠品系NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）进行PDX移植。来源于经伦理审查委员会（IRB）同意的患者的乳腺癌组织样本，经机械和酶解方法解离后，重悬于基底膜提取物（BME）与RPMI 1640培养基的混合溶液中。实验过程中，通过抓握小鼠颈背部皮肤固定动物，并在第四对腹股沟乳头处的脂肪垫区域涂抹脱毛膏以去除毛发，随后进行注射。使用26 G针头将约200万细胞（体积为100 µL）双侧原位注射至乳腺脂肪垫中。值得注意的是，该过程无需麻醉，从细胞制备到完成注射的总操作时间少于5分钟。经过数月的肿瘤生长后，将肿瘤组织切除并进行鉴定分析。验证内容包括采用免疫组织化学方法检测传统乳腺癌受体（即ER、PR、HER2）的表达状态，并由病理学家通过苏木精-伊红（H&E）染色确认肿瘤形态学特征。通过批量RNA测序和短串联重复序列（STR）分析，验证移植瘤与原始患者样本之间的遗传相似性。该PDX移植与验证方法支持高通量肿瘤植入和模型的严谨构建，有助于在多种乳腺癌亚型中开展统计效能充分的研究。

引言

每年全球有超过 200 万名女性被诊断出乳腺癌（BC）¹。为了推进对 BC 的基础生物学认知，并成功将新型治疗方法转化为获批的临床治疗手段，需要使用能够保留患者肿瘤特征的临床前动物模型。已证明，当以原位移植方式植入时，患者来源的异种移植瘤（PDX）能够高度忠实地再现肿瘤的异质性，包括组织病理学特征、受体表达以及遗传异常^2,3,4。重要的是，PDX 还能保留对肿瘤微环境有贡献的基质细胞，例如血管系统、免疫细胞和癌症相关成纤维细胞。尽管如此，随着传代次数的增加，这些人类基质细胞会逐渐被小鼠宿主的基质细胞所取代⁵。此外，PDX 模型还能够用于研究由肿瘤生长引起的全身性并发症，例如疲劳^6,7，而这一点目前在体外（in vitro）模型中尚无法实现。

然而，成功的乳腺癌PDX移植需要使用免疫缺陷型小鼠品系，其中最常用的是NSG（NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ）。NSG小鼠缺乏适应....

方案

本方案遵循西弗吉尼亚大学（WVU）机构动物护理与使用委员会制定的指南。雌性 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl8周龄及以上、体重约25 g的/SzJ（NSG）小鼠用于肿瘤细胞注射。乳腺癌肿瘤组织由西弗吉尼亚大学癌症研究所（西弗吉尼亚州摩根敦）及美国国家癌症研究所合作人类组织网络提供，采集过程遵循经西弗吉尼亚大学机构审查委员会批准的方案以及西弗吉尼亚大学癌症研究所方案审查与监测委员会的要求。所有患者均签署了知情同意书。所有操作均在II级生物安全柜内按照标准个人防护装备（PPE）规程进行，确保无菌条件。本研究中所用动物、试剂和设备的详细信息见于 材料表.

1. 肿瘤组织的高通量酶解离

1. 将人肿瘤解离试剂盒中的酶 H、R 和 A 在无菌 C 管中解冻并混合。加入 200 µL 酶 H、100 µL 酶 R 和 25 µL 酶 A。再加入 4.7 mL 无菌 RPMI 1640 培养基，使终体积达到约 5 mL。
   注意：可使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）替代 RPMI 1640。
2. 肿瘤组织碎片可按照现有方案进行切割和冷冻⁹。将解冻后的肿瘤碎片及其伴随的冻存液转移至一个无菌 100 mm 培养皿的一半区域。使....

结果

本研究概述了一种高效且无需手术的原位移植患者来源乳腺癌异种移植瘤至小鼠的方法。乳腺肿瘤组织经人源特异性酶消化并辅以机械震荡解离后，重悬于体积比为1:1的Matrigel与RPMI 1640培养基混合液中，并原位注射至NSG小鼠腹股沟乳腺脂肪垫内图1 和 图2）。为确保PDX模型的保真度，采用既定的组织病理学和基因组学技术，验证了原始患者肿瘤样本与传代肿瘤之间的一致性。通过免疫组织化学（IHC）染色对标准乳腺癌受体（包括雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2））进行受体表达谱分析（图3）。细胞形态通过苏木精和伊红（H&E&E）对肿瘤切片进行染色，并由资深病理学家对染色切片进行判读。通过批量RNA测序和短串联重复序列（STR）鉴定验证了遗传特征的保留以及人源细胞的存留 (

讨论

本文介绍了一种高效、高通量的方法，用于将膀胱癌（BC）患者来源的异种移植瘤（PDX）原位植入免疫缺陷小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫中。该优化的工作流程使单名研究人员每天可完成数十只小鼠的PDX植入，从而支持大规模且具有足够统计效能的研究。同时解离并植入多个不同PDX的能力，也有助于实现精准肿瘤学研究策略。除时间效率更高外，肿瘤组织的解离还可产生细胞类型均一的悬浮液，并在各小鼠间实现均匀分布。根据我们的经验，这种均一性有助于提高移植成功率和肿瘤生长速率的一致性。

尽管该方案通常有效，但在某些情况下可能需要进行调整。例如，机械解离仪的标准运行时间1小时有时不足以完全解离肿瘤组织。在牢固握住C管的同时，将其朝下甩动数次，以使散落的组织聚集到管底。如果仍可见组织碎片，则继续解离，并每隔15分钟重新检查一次。需要注意的是，某些组织（尤其是纤维性或脂肪性组织）可能难以解离，需手动去除，以防止注射时堵塞针头。

建议使用尽可能小的针头（27 G 或 26 G）以减轻动物痛苦，并降低细胞从注射部位回流的风险，从而避免影响移植成功率和肿瘤生长速度。然而，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 结核菌素注射器	BD	305945	无菌
1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Gibco	10010023	无菌
2.0 mL 圆底微量离心管	Eppendorf	0030123620	无菌
26 G 针头，½ 英寸	BD	305111	无菌
5.0 mL 微量管	Eppendorf	0030119401	无菌
8 周龄及以上 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 小鼠	The Jackson Laboratory	#005557
酒精消毒片	Fisher Scientific	22-363-750	无菌
基底膜提取物（Matrigel）	Cultrex	3632-005-02
棉签，6 英寸	Fisher Scientific	22-029-553	无菌
中等长度无齿弯镊，152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	无菌
脱毛膏	Nair
gentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237
带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-096-427
10 号手术刀片	Fisher Scientific	12-000-162	无菌
无纺纱布海绵，4×4 英寸	Fisher Scientific	22-028-558	无菌
RPMI 1640 1× + L-谷氨酰胺	Gibco	11875093	无菌
人源肿瘤组织解离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-095-929