本方案描述了一种高效、非手术的小鼠原位移植乳腺癌患者来源异种移植瘤的方法。该技术包括酶解法解离肿瘤组织，随后直接注射至乳腺脂肪垫中，可实现高通量移植。通过全面的验证确保模型的可靠性，有助于开展针对多种乳腺癌亚型的严谨研究。
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摘要
摘要
患者来源的异种移植模型（PDX）提供了一种临床相关的方法，用于重现肿瘤涉及的细胞类型及肿瘤微环境，这对于推进乳腺癌（BC）的研究至关重要。此外，PDX模型可用于研究乳腺癌的全身性效应，而这是体外模型无法实现的。传统的乳腺癌异种移植植入方法通常需要麻醉和无菌手术操作，耗时较长、具有侵入性，并限制了PDX模型在乳腺癌研究中的可扩展性。本实验方案描述了一种简单且可扩展的小鼠原位植入乳腺癌PDX的方法。本研究采用免疫缺陷小鼠品系NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）进行PDX移植。来源于经伦理审查委员会（IRB）同意的患者的乳腺癌组织样本，经机械和酶解方法解离后，重悬于基底膜提取物（BME）与RPMI 1640培养基的混合溶液中。实验过程中，通过抓握小鼠颈背部皮肤固定动物，并在第四对腹股沟乳头处的脂肪垫区域涂抹脱毛膏以去除毛发，随后进行注射。使用26 G针头将约200万细胞（体积为100 µL）双侧原位注射至乳腺脂肪垫中。值得注意的是，该过程无需麻醉，从细胞制备到完成注射的总操作时间少于5分钟。经过数月的肿瘤生长后，将肿瘤组织切除并进行鉴定分析。验证内容包括采用免疫组织化学方法检测传统乳腺癌受体（即ER、PR、HER2）的表达状态，并由病理学家通过苏木精-伊红（H&E）染色确认肿瘤形态学特征。通过批量RNA测序和短串联重复序列（STR）分析，验证移植瘤与原始患者样本之间的遗传相似性。该PDX移植与验证方法支持高通量肿瘤植入和模型的严谨构建，有助于在多种乳腺癌亚型中开展统计效能充分的研究。
引言
每年全球有超过 200 万名女性被诊断出乳腺癌（BC）1。为了推进对 BC 的基础生物学认知，并成功将新型治疗方法转化为获批的临床治疗手段，需要使用能够保留患者肿瘤特征的临床前动物模型。已证明，当以原位移植方式植入时，患者来源的异种移植瘤（PDX）能够高度忠实地再现肿瘤的异质性，包括组织病理学特征、受体表达以及遗传异常2,3,4。重要的是，PDX 还能保留对肿瘤微环境有贡献的基质细胞，例如血管系统、免疫细胞和癌症相关成纤维细胞。尽管如此，随着传代次数的增加，这些人类基质细胞会逐渐被小鼠宿主的基质细胞所取代5。此外，PDX 模型还能够用于研究由肿瘤生长引起的全身性并发症，例如疲劳6,7，而这一点目前在体外（in vitro）模型中尚无法实现。
然而，成功的乳腺癌PDX移植需要使用免疫缺陷型小鼠品系，其中最常用的是NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）。NSG小鼠缺乏适应性免疫系统，且先天性免疫功能严重缺陷8。在其他免疫缺陷型小鼠品系（如SCID/Beige（CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl））中也已实现乳腺癌PDX移植，移植成功率相似4。
传统的BC PDX移植方法涉及将肿瘤组织片段通过手术植入乳腺脂肪垫9，该方法具有较高的成瘤成功率。然而，由于需要无菌手术操作和使用麻醉剂，该过程耗时较长，从而限制了在特定时间窗口内可进行移植的小鼠数量。鉴于PDX模型在预测肿瘤药物反应及精准医学应用中的潜在优势10，建立一种简单且可重复的、能够在小鼠间均一化移植PDX的操作流程至关重要。本文展示了将人乳腺肿瘤组织解离为单细胞悬液，并随后将其正位注射至免疫缺陷小鼠乳腺脂肪垫中的方法。
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方案
本方案遵循西弗吉尼亚大学（WVU）机构动物护理与使用委员会制定的指南。雌性 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl8周龄及以上、体重约25 g的/SzJ（NSG）小鼠用于肿瘤细胞注射。乳腺癌肿瘤组织由西弗吉尼亚大学癌症研究所（西弗吉尼亚州摩根敦）及美国国家癌症研究所合作人类组织网络提供，采集过程遵循经西弗吉尼亚大学机构审查委员会批准的方案以及西弗吉尼亚大学癌症研究所方案审查与监测委员会的要求。所有患者均签署了知情同意书。所有操作均在II级生物安全柜内按照标准个人防护装备（PPE）规程进行，确保无菌条件。本研究中所用动物、试剂和设备的详细信息见于 材料表.
1. 肿瘤组织的高通量酶解离
- 将人肿瘤解离试剂盒中的酶 H、R 和 A 在无菌 C 管中解冻并混合。加入 200 µL 酶 H、100 µL 酶 R 和 25 µL 酶 A。再加入 4.7 mL 无菌 RPMI 1640 培养基，使终体积达到约 5 mL。
注意：可使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）替代 RPMI 1640。 - 肿瘤组织碎片可按照现有方案进行切割和冷冻9。将解冻后的肿瘤碎片及其伴随的冻存液转移至一个无菌 100 mm 培养皿的一半区域。使用无菌镊子将肿瘤碎片转移至一个无菌 5 mL 微量离心管中。
注意：可使用无菌皮下注射针头代替镊子。也可使用 35 mm 培养皿替代 5 mL 微量离心管。 - 用 1–3 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，1×）洗涤肿瘤碎片。用镊子在溶液中操作碎片，确保彻底去除残留的冻存液。
- 用镊子将洗涤后的碎片转移至一个 2 mL 微量离心管中。向肿瘤碎片中加入 1 mL 三联抗生素（TAB）溶液，并在室温下孵育 10 分钟。
注意：此步骤可根据需要省略。10× TAB 储存液可通过将 1% 庆大霉素、1% 克林霉素和 0.5% 硫酸多粘菌素 B 溶解于无菌 1× PBS 中制备。使用无菌 1× PBS 稀释为 1× TAB 工作液。 - 使用无菌 镊子将消毒后的碎片转移至一个新的 5 mL 微量离心管中。用 1–3 mL 无菌 PBS 进行第二次洗涤。将洗涤后的碎片转移至第 1.2 步中使用的 100 mm 培养皿的干燥半区。
- 使用两把无菌 10 号手术刀片彻底切碎肿瘤组织。将切碎的肿瘤碎片转移至其中一把刀片上，并将其放入含有预配酶溶液的 C 管中。牢固旋紧管盖，直至听到最终的“咔哒”声。
- 将 C 管反复倒置数次，以确保肿瘤碎片在酶溶液中均匀分布。
- 将 C 管放入机械解离仪中。倒置试管，确保所有内容物均浸没于培养基中。仪器运行时试管将保持倒置状态。
- 将试管固定在插槽中，凹面朝向操作者。如适用，将加热装置套在试管周围。
- 从触摸屏界面选择 37C_h_TDK_3 程序。该程序在 37 °C 下运行 60 分钟。对于较软的肿瘤，可使用 37C_h_TDK_1 或 2。
注意：为提高效率，建议在此解离期间准备用于注射的小鼠，即在注射部位涂抹脱毛膏。 - 解离程序完成后，检查管内物质。不应再有可见的肿瘤碎片。
注意：若仍有碎片存在，可能需要延长解离时间。在此情况下，可额外运行程序 20–30 分钟。 - 当达到充分解离后，在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5–8 分钟，使解离的细胞形成沉淀。使用真空抽吸或移液器小心去除上清液。
- 将细胞沉淀重悬于 5–10 mL 新鲜 RPMI 培养基中。将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中以便操作。在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5–8 分钟。小心吸除上清液。
注意：若细胞沉淀量较小，此步骤可省略。在此情况下，可直接将细胞重悬于所需体积的培养基中，然后与基底膜提取物（Matrigel）混合，以尽量减少细胞损失。 - 将细胞沉淀重悬于相当于最终注射体积一半的 RPMI 1640 培养基中。RPMI 1640 与 Matrigel 将按 1:1 的体积比混合，每个注射部位的最终注射体积为 100 µL。
注意：对于 4 只小鼠的双侧注射，所需总体积为 800 µL。因此，应将细胞重悬于至少 400 µL 的 RPMI 1640 中。为避免潜在的体积损失，建议在最终体积基础上额外增加 20%，同时保持 1:1 的体积比。也可使用 DMEM 或 1× PBS 替代 RPMI 1640。 - 使用血细胞计数板或自动计数法对重悬的细胞进行计数。根据需要稀释至目标注射浓度。建议每个注射部位起始细胞数约为 100 万至 200 万个。
- 在 2 mL 圆底微量离心管中，将所需体积的 RPMI 稀释细胞悬液与等体积的 Matrigel 混合。通过反复移液轻轻混匀悬液，确保均匀性。
注意：根据前一步骤，将 400 µL 稀释细胞悬液加入 400 µL Matrigel 中。需考虑将使用的注射针数量及其相关的体积损耗。Matrigel 应始终置于冰上。在细胞重悬前不要使其解冻，否则会迅速凝固。建议分装成小份（例如 120 µL），以便快速解冻并在 2 mL 管中混合。 - 将细胞悬液置于冰上，直至准备进行注射。
2. 解离型PDX的原位腹股沟乳腺脂肪垫注射
- 使用已校准的天平测定每只小鼠的质量。在目标注射部位涂抹一层薄薄的脱毛膏。用无菌棉签以顺时针和逆时针交替按摩的方式揉搓，以促进毛发快速脱落。
- 使用浸有无菌生理盐水的纱布海绵清除多余的毛发和脱毛膏。确保注射区域的毛发完全去除。
注意：脱毛膏接触皮肤的时间不得超过60秒，以防止皮肤刺激。可在使用脱毛膏前先对小鼠进行剃毛，以进一步缩短暴露时间。此步骤可在肿瘤组织解离过程中进行，以优化时间效率，并尽量减少细胞悬液在冰上储存的时间。
- 使用浸有无菌生理盐水的纱布海绵清除多余的毛发和脱毛膏。确保注射区域的毛发完全去除。
- 对每只小鼠进行彻底的视觉检查，评估其是否适合注射。观察是否存在疼痛、痛苦、疾病或其他禁忌症的迹象。
- 使用一支1 mL注射器（不带针头），轻柔地将细胞悬液上下抽吸数次，以确保均匀混合。将26 G针头连接至1 mL注射器，吸取所需注射体积。通过轻敲或弹动注射器的方式排除其中的气泡。
注意：建议每支注射器的液体量不超过600 µL，以便于单手操作注射。 - 将准备好的注射器水平放置在冰盒上方，针头朝向远离操作者的方向。将冰盒和针头置于操作者惯用手或偏好的注射手同侧。将小鼠从笼中取出，并使用酒精棉片对注射区域进行消毒。
- 牢固地抓住小鼠颈背部的皮肤以固定其身体，确保充分固定，从而清晰暴露乳腺脂肪垫。腹股沟乳腺脂肪垫从乳头延伸至髋部顶端，在皮肤下方该区域可见为柔软、粉红色的组织。
注意：助手操作员可使用扁头镊子夹住并提起含有脂肪垫的皮肤。该技术有助于确保执行注射的操作员准确靶向脂肪垫。 - 将小鼠置于仰卧位。将针头（斜面朝上）以45度角插入，指向髋部方向，位置位于脂肪垫后方约0.5–1 cm处，可根据针头长度适当调整。
- 将针头推进至脂肪垫内。以可控的方式注入所需体积的细胞悬液。高效的注射速度有助于减少因长时间固定引起的小鼠躁动。
注意：为尽量减少动物应激，持续手动固定的最长时间不应超过30秒。若固定时间超过30秒，应将动物放回笼中恢复，之后再进行第二次尝试。
- 将针头推进至脂肪垫内。以可控的方式注入所需体积的细胞悬液。高效的注射速度有助于减少因长时间固定引起的小鼠躁动。
- 注射完成后，将针头旋转180度（斜面朝下）。保持针头位置短暂片刻后再缓慢拔出，以尽量减少细胞从注射部位流失。如出现出血情况，必要时可使用普通纱布或止血纱布进行处理。
- 如需进行双侧注射，请对对侧脂肪垫重复步骤2.6和2.7。对于多只动物，根据需要重复步骤2.2–2.7。
3. 随访程序
- 将所有锐器丢弃至指定的锐器容器中，其余物品应丢弃至适当的废弃物容器中。
- 注射过程中若发生出血，需在操作后至少监测小鼠1小时，以确保止血完成。
- 每周定期监测体重变化，当肿瘤生长至可触及程度时，开始评估肿瘤体积。
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结果
本研究概述了一种高效且无需手术的原位移植患者来源乳腺癌异种移植瘤至小鼠的方法。乳腺肿瘤组织经人源特异性酶消化并辅以机械震荡解离后，重悬于体积比为1:1的Matrigel与RPMI 1640培养基混合液中，并原位注射至NSG小鼠腹股沟乳腺脂肪垫内图1 和 图2）。为确保PDX模型的保真度，采用既定的组织病理学和基因组学技术，验证了原始患者肿瘤样本与传代肿瘤之间的一致性。通过免疫组织化学（IHC）染色对标准乳腺癌受体（包括雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2））进行受体表达谱分析（图3）。细胞形态通过苏木精和伊红（H&E&E）对肿瘤切片进行染色，并由资深病理学家对染色切片进行判读。通过批量RNA测序和短串联重复序列（STR）鉴定验证了遗传特征的保留以及人源细胞的存留 (
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讨论
本文介绍了一种高效、高通量的方法，用于将膀胱癌（BC）患者来源的异种移植瘤（PDX）原位植入免疫缺陷小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫中。该优化的工作流程使单名研究人员每天可完成数十只小鼠的PDX植入，从而支持大规模且具有足够统计效能的研究。同时解离并植入多个不同PDX的能力，也有助于实现精准肿瘤学研究策略。除时间效率更高外，肿瘤组织的解离还可产生细胞类型均一的悬浮液，并在各小鼠间实现均匀分布。根据我们的经验，这种均一性有助于提高移植成功率和肿瘤生长速率的一致性。
尽管该方案通常有效，但在某些情况下可能需要进行调整。例如，机械解离仪的标准运行时间1小时有时不足以完全解离肿瘤组织。在牢固握住C管的同时，将其朝下甩动数次，以使散落的组织聚集到管底。如果仍可见组织碎片，则继续解离，并每隔15分钟重新检查一次。需要注意的是，某些组织（尤其是纤维性或脂肪性组织）可能难以解离，需手动去除，以防止注射时堵塞针头。
建议使用尽可能小的针头（27 G 或 26 G）以减轻动物痛苦，并降低细胞从注射部位回流的风险，从而避免影响移植成功率和肿瘤生长速度。然而，...
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披露
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢提供肿瘤样本用于建立PDX模型的患者们的慷慨贡献。Emidio Pistilli感谢Hannah Wilson博士（MD/PhD）此前的重要贡献。本研究得到了以下机构的支持：美国关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS），资助号R01AR079445（Pistilli）；西弗吉尼亚大学基因组核心设施（U54GM104942）；西弗吉尼亚大学动物模型与影像设施（P20GM121322、U54GM104942、P20GM144230、P30GM103488）；美国普通医学科学研究所（NIGMS），资助号P20GM121322（Lockman）。图1使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 结核菌素注射器 | BD | 305945 | 无菌 |
| 1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | Gibco | 10010023 | 无菌 |
| 2.0 mL 圆底微量离心管 | Eppendorf | 0030123620 | 无菌 |
| 26 G 针头，½ 英寸 | BD | 305111 | 无菌 |
| 5.0 mL 微量管 | Eppendorf | 0030119401 | 无菌 |
| 8 周龄及以上 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 小鼠 | The Jackson Laboratory | #005557 | |
| 酒精消毒片 | Fisher Scientific | 22-363-750 | 无菌 |
| 基底膜提取物（Matrigel） | Cultrex | 3632-005-02 | |
| 棉签，6 英寸 | Fisher Scientific | 22-029-553 | 无菌 |
| 中等长度无齿弯镊，152 mm | Electron Microscopy Sciences | 50-365-845 | 无菌 |
| 脱毛膏 | Nair | ||
| gentleMACS C 管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| 带加热模块的 gentleMACS Octo 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| 10 号手术刀片 | Fisher Scientific | 12-000-162 | 无菌 |
| 无纺纱布海绵，4×4 英寸 | Fisher Scientific | 22-028-558 | 无菌 |
| RPMI 1640 1× + L-谷氨酰胺 | Gibco | 11875093 | 无菌 |
| 人源肿瘤组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
参考文献
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