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方法文章

小鼠视网膜的冷冻切片与免疫染色

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DOI：

10.3791/67622

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2025年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Human Disease Gene Study of Sichuan Province and Department of Laboratory Medicine, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 2Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种制备小鼠视网膜冷冻切片并对感光细胞进行免疫染色的实验方案。该方法可帮助研究人员稳定地获得形态保存良好、免疫染色质量高的小鼠视网膜冷冻切片。

摘要

组织切片和免疫组织化学是利用动物模型研究视网膜疾病时组织学和病理学研究中的关键技术。这些方法能够详细观察组织形态以及特定蛋白质在组织内的定位，从而为疾病过程和机制提供重要见解。小鼠是此类研究中最常用的模型。然而，由于小鼠眼球较小，视网膜组织极为脆弱，从小鼠眼球获取高质量的视网膜切片和免疫染色图像通常具有挑战性。本研究介绍了一种改进的小鼠视网膜冷冻切片及免疫组织化学实验方案。该方案的关键步骤之一是在眼球表面涂覆一层瞬干胶，以防止在角膜去除、晶状体摘除和包埋过程中眼球发生变形。此步骤可有效保持视网膜形态结构的完整性。本方案强调了获得稳定高质量视网膜切片和优异免疫染色结果所需的关键技术要点与优化策略。

引言

冷冻切片与免疫组织化学（IHC）是生物医学研究中不可或缺的技术，尤其适用于研究视网膜等复杂的生物结构1。这些先进技术对于理解视网膜复杂的细胞组成和分子结构至关重要。它们使研究人员能够在精细水平上探究视网膜的功能与病理变化，为推动该领域的知识进步提供关键见解。

冷冻切片在维持视网膜组织形态完整性方面起着至关重要的作用。该方法可确保视网膜的精细结构保持完整，从而使切片能够高精度、高可靠性地用于后续免疫荧光研究。与其他方法（如石蜡包埋）相比，冷冻切片具有显著优势，因其能更好地保存组织形态和抗原性，特别适用于免疫组织化学染色2。冷冻切片技术已被广泛应用于多种复杂组织甚至精细细胞结构的研究3，可实现对其结构的精确分析。

免疫组织化学（IHC）是一种强大且用途广泛的实验室技术，可用于可视化特定蛋白质在组织内的定位。该技术已成为临床和科研领域的基石，广泛应用于疾病诊断、病情监测以及生物学研究。IHC实验的成功在很大程度上依赖于精细的样品制备、对组织的谨慎处理以及对免疫染色条件的精确控制。实验方案中的微小差异都可能显著影响结果的质量，因此凸显了标准化和优化的重要性1。

冷冻切片与免疫组织化学技术相结合，为研究人员探索视网膜内各种蛋白质的空间分布、表达水平及细胞间相互作用提供了无与伦比的优势。这些方法有助于深入研究视网膜发育、功能及疾病背后的分子机制。此类研究在分析年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和视网膜色素变性等视网膜疾病方面具有重要价值。通过阐明这些疾病的病理生理过程，冷冻切片与免疫组织化学技术有助于发现潜在的生物标志物，并推动新型治疗策略的开发。

尽管小鼠视网膜具有研究价值，但其操作仍面临独特挑战。由于小鼠与人类具有较高的遗传相似性，且其视网膜结构已被充分表征，因此被广泛用作眼科研究的动物模型。然而，由于小鼠视网膜组织体积小且结构脆弱，获得高质量的冷冻切片本身存在困难。本研究提供了一种针对小鼠视网膜进行冷冻切片及免疫组化（IHC）的详细方法，强调了关键的技术要点，并提出了应对这些挑战的优化策略。通过改进这些技术，研究人员可以获得稳定且高质量的结果，从而推动视网膜生物学与病理学的研究进展。

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方案

本实验遵循视力与眼科学研究协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology）制定的动物研究使用指南。实验已获得四川省人民医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本方案使用雄性 C57Bl/6J 小鼠，年龄为 2 至 3 个月，体重为 25–30 g。本研究中所用试剂与设备的完整清单见《材料表》。

1. 试剂准备

  1. 1x PBS 缓冲液
    1. 使用天平称取 8 g NaCl、1.42 g Na2HPO4、0.42 g KH2PO4 和 0.2 g KCl，转移至烧杯中，加入适量双蒸水（ddH2O）溶解各组分。将溶液倒入 1 L 容量瓶中，用 ddH2O 定容至 1 L。
  2. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液
    1. 在含有 8 mL 1x PBS 缓冲液的 15 mL 圆底管中加入 0.4 g PFA 粉末和 15 µL 1 M NaOH。将管子置于 60 °C 水浴中，使 PFA 粉末完全溶解。用 1x PBS 缓冲液定容至 10 mL。
  3. 免疫组化封闭液
    1. 将 1 mL 正常驴血清、20 µL 20% NaN2、200 µL 20% Triton X-100 和 18.78 mL 1x PBS 缓冲液混合，充分混匀。
  4. 30% 蔗糖溶液
    1. 将 15 g 蔗糖溶解于 40 mL 1x PBS 缓冲液中，再用 1x PBS 缓冲液定容至 50 mL，搅拌至完全溶解。
  5. 免疫组化二抗溶液
    1. 用配制好的封闭液将 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体按 1:300 比例稀释，DAPI 按 1:2,000 比例稀释。

2. 小鼠眼球冷冻切片

  1. 眼球解剖
    1. 麻醉一只3个月大的C57Bl/6小鼠（约25 g） 通过 按每克体重15 µL的剂量腹腔注射2%三溴乙醇。采用颈椎脱臼法处死小鼠（遵循机构批准的实验方案）。
    2. 用蓝色标记笔在巩膜上标记眼球的上方位置（图1A). 用剪刀摘除眼球。
    3. 如果眼球表面有血液，使用无绒布轻轻擦拭去除。在解剖显微镜下，小心去除附着在眼球上的眼外肌。
  2. 固定
    1. 将解剖得到的眼球转移至含有1 mL 4%多聚甲醛的2 mL圆底微量离心管中，固定10分钟。随后，将眼球转移至倒置的3 cm或6 cm培养皿中。
    2. 在解剖显微镜下，使用精细镊子和眼科剪在角膜上做一个小切口（约1-2 mm）。将眼球重新放回4% PFA溶液中，在冰上继续固定2小时（图1B).
  3. 冷冻保护
    1. 去除固定液，用1×PBS缓冲液将眼球清洗三次。将眼球转移至含有1 mL 30%蔗糖溶液的2 mL圆底微量离心管中，于4 °C进行冷冻保护。待眼球沉降至管底或过夜放置。
  4. 眼球包被
    1. 将眼球转移至一个倒置的培养皿中，使角膜面朝上。使用无绒布擦拭角膜表面多余的液体。将一段2-3 cm的网球线浸入装有氰基丙烯酸酯胶水的0.2 mL微量离心管中，随即迅速取出。
    2. 在解剖显微镜下，将残留有瞬间胶的网球线一端粘附于湿润角膜的中心位置，静置10–20秒使胶水固化。捏住网球线的另一端，将眼球浸入装有瞬间胶的200 µL微量离心管中，确保巩膜完全浸没约1秒。
    3. 迅速取出眼球并浸入PBS中（图1C）。巩膜表面的胶水会立即凝固。
  5. 角膜的摘除
    1. 用无尘布轻轻吸去凝固胶表面多余的PBS。在解剖显微镜下，用眼科剪刀剪下角膜，同时握住附着的尼龙线。
  6. 包埋
    1. 用镊子小心地从眼杯中取出晶状体。用无绒擦拭条吸去眼杯内残留的多余蔗糖溶液。将眼杯转移至装有最佳切割温度（OCT）包埋剂的包埋模具中。
    2. 用OCT完全填充眼杯。将眼杯放置在包埋模具的侧壁处，确保矢状面与模具底部平行。以巩膜上的蓝色标记作为参考。将含有眼杯的包埋模具转移至-80 °C超低温冰箱中图1D眼杯将在五分钟内被冷冻。
  7. 冷冻切片
    1. 将冷冻的眼杯转移至设定为 -20 °C 的冷冻切片机中，在舱内平衡 30 分钟。以 12 µm 厚度对眼杯进行切片。将切片贴附于带正电荷的玻璃载片上，以备后续使用。

3. 免疫组织化学染色

  1. 烘烤
    1. 将冷冻切片置于载玻片上，并在 37 °C 烤箱中烘烤 30–60 分钟，以确保组织牢固贴附于载玻片。
  2. 洗涤
    1. 使用 PAP 笔在载玻片上的切片周围画圈。将载玻片浸入盛有 1× PBS 缓冲液的考普林瓶中。将考普林瓶置于缓慢摇床上，洗涤切片 2 次，每次 10 分钟，以去除 OCT 包埋剂。
  3. 封闭与通透
    1. 将载玻片水平放置于湿盒中。向画圈区域加入封闭液，在室温下孵育 30 分钟，以实现封闭与细胞通透。
  4. 一抗孵育
    1. 小心吸除载玻片上的封闭液。加入用封闭液稀释的一抗，覆盖切片。将切片置于湿盒中，在 4 °C 下孵育过夜，以确保抗体与目标抗原充分结合。
  5. 二抗孵育
    1. 吸除一抗溶液，用 1× PBS 洗涤载玻片两次，每次 10 分钟。加入适当种类的二抗，与 DAPI 混合后用封闭液稀释，滴加至切片上。
    2. 将切片置于避光湿盒中，在室温下孵育 1 小时，使二抗结合并完成 DAPI 复染。
  6. 封片
    1. 吸除二抗溶液，用 1× PBS 冲洗载玻片 2 次，每次 10 分钟。用 Kimwipe 纸轻轻吸去载玻片上残留的 PBS。
    2. 向切片滴加适量抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片。将封片后的样品置于 4 °C 避光保存，以维持荧光信号并防止光漂白。

4. 成像

  1. 使用激光扫描共聚焦显微镜获取免疫染色视网膜切片的荧光信号。调整成像参数以获得最佳分辨率和灵敏度，确保捕获清晰且分明的荧光信号。
  2. 确保使用适当的滤光片以检测实验中所用荧光染料的特定波长。

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结果

按照上述方案，将1月龄野生型C57Bl/6J小鼠的眼球用4% PFA固定。固定后的样品包埋于OCT中并进行冷冻切片。切片使用抗PDE6B抗体进行免疫染色，并用DAPI复染以标记细胞核。PDE6B是一种光转导蛋白，特异性表达于视杆感光细胞中4。与传统方案相比，该方案显著改善了小鼠视网膜的形态结构以及免疫荧光图像的质量，具有高度一致性。代表性结果展示了使用抗PDE6B抗体对视网膜冷冻切片进行免疫染色的成功效果（图2）。感光细胞的外节结构被抗PDE6B抗体清晰标记。所有感光细胞外节在形态上均保持完整，单个节段可清晰分辨。切片中未观察到视网膜脱离现象。此外，内节结构和外核层也保持完整。

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讨论

影响组织切片质量的因素有多种，包括固定液的成分、固定时间和冷冻保护时间，以及包埋方法5。从小鼠体内摘除眼球时，必须去除附着在眼球上的眼外肌及其他结缔组织。如果这些组织未被彻底清除，在从眼眶中取出眼球时可能导致眼球变形，进而引发视网膜脱离。在固定过程中，应在角膜上做一个切口以释放眼内压（IOP）。若不进行此切口，眼球可能发生收缩，导致变形和视网膜脱离。固定期间，眼球通透性增加，眼内压会促使房水从眼内腔流出。通过在角膜上做切口，可缓解眼球内部压力，有助于防止收缩，并使固定液更有效地渗透至眼内腔，实现最佳固定效果。

视网膜由10层结构上各不相同且极为精细的组织构成。为了保持其形态完整性，正确固定组织至关重要。PFA溶液常被用作固定剂6，因为它可以新鲜配制。应避免使用预先配好的福尔马林溶液，因其容易发生氧化7，可能导致固定效果不佳，从而破坏视网膜的形态结构。此外，固定时间不应超过2小时，因为过长的固定时间可能引起过度的自发荧光，尤其是在视网膜色素上...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究项目受到国家自然科学基金（82371059（H.Z.），82102470（J.W.））和四川省科技计划项目（2023JDZH0002（H.Z.））的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
-80 °C 冷冻箱HaierDW-86L626
黏附显微镜载玻片CITOTEST80312-3161
Alexa488-山羊抗兔ProteintechSA00006-2
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室664
冷冻切片机LeicaN/A
冷冻切片机LEICAN/A
DAPI细胞信号技术公司4083S
体视显微镜ZEISS3943030830
驴血清SolarbioS9100
包埋模具赛默飞世尔科技1841
精细解剖剪真实世界数据S13001-10
精细镊子真实世界数据F11020-11
Fluoromount 水性封片剂Sigma-AldrichF4680
培养箱上海跃进N/A
KClSigma-Aldrich1049330500
KH2PO4Sigma-Aldrich1048771000
Kimwipes赛默飞世尔科技FIS-06666
激光共聚焦显微镜ZEISSN/A
显微镜盖玻片CITOTEST80340-3610
Na2HPO4Sigma-Aldrich1065860500
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHSigma-Aldrich1091371003
O.C.T. 包埋剂樱花4583
防蜡笔Sigma-AldrichZ672548
PFASigma-Aldrich441244
兔抗PDE6BProteintech22063-1-AP
摇床SCILOGEX8042210200
弹簧剪真实世界数据S11036-08
蔗糖BioFroxx1245GR500
超级胶水德利7147S
网球拍线（1.24 mm）GosenTS761
三溴乙醇MacklinT831042
Triton X-100SolarbioIT9100

参考文献

  1. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
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