从化脓性汗腺炎隧道中分离微生物的综合方法

摘要

我们展示了一种成功分离难养且厌氧微生物的方法，这些微生物来源于化脓性汗腺炎患者切除组织中的皮肤窦道（管道）。

摘要

化脓性汗腺炎（Hidradenitis Suppurativa，HS）是一种致残性疾病，其特征为疼痛性结节和脓肿，并进展为皮肤真皮层内的窦道（隧道），导致显著的不适、恶臭分泌物、畸形、挛缩和瘢痕，严重降低患者生活质量。HS 与皮肤微生物组的改变相关，影响免疫调节以及皮肤对有害细菌的防御能力。尽管该病发病率较高，但 HS 微生物组在疾病病理过程中的作用及其对治疗反应有限的原因仍 largely 未知。迄今为止，针对 HS 组织的多项 16S rRNA 测序研究仅达到属水平的分辨率，发现革兰氏阴性厌氧菌增加而皮肤共生菌减少。深入理解 HS 患者中的微生物失调对于优化治疗策略至关重要。这需要采用双重方法来评估 HS 微生物组，包括细菌物种的分离，而后者在聚焦于皮肤疾病的转化研究中常被忽视。从 HS 组织中分离单个微生物对于阐明细菌在 HS 发病机制中的作用至关重要。本文重点介绍可重复的方法，用于成功从 HS 窦道组织中分离厌氧病原体，为理解细菌在 HS 中的作用提供初始且最关键的步骤。该方法为深入研究微生物在 HS 中的作用以及开发更有效、个性化的治疗策略铺平道路，以应对这一慢性疾病复杂的微生物负荷。

引言

化脓性汗腺炎（Hidradenitis Suppurativa，HS）是一种常见的皮肤疾病，其特征为皮下结节和脓肿，可进展为在皮肤真皮层和皮下组织内形成的窦道（隧道状结构），导致显著疼痛、产生脓性分泌物、外观畸形以及严重的身心社会后遗症^1,2。HS 对女性及皮肤色素较多的人群影响尤为严重，通常在青少年晚期或成年早期发病²。该病不仅具有严重的躯体症状，还带来深远的心理社会影响，包括抑郁、焦虑和社会孤立，显著降低患者生活质量³。在疾病晚期形成的 HS 窦道显著降低了患者对目前获批生物制剂治疗的应答概率，而手术切除仍是唯一有效的治疗手段^4,5。

多项研究已对与化脓性汗腺炎（HS）隧道相关的微生物组进行了表征，结果显示厌氧致病菌占主导地位，而皮肤共生菌的丰度降低^6,7,8，近期研究在隧道中进一步鉴定出卟啉单胞菌属（Porphyromonas spp.，I型）和普雷沃菌属（Prevotella spp.，IV型）等多种菌属⁹。另一项研究发现，HS微生物组的组成随组织取样深度的不同而存在差异，证实了隧道组织中微生物组成的独特性¹⁰。此外，已有研究表明，菌群失调会影响HS中的免疫反应，进一步揭示了微生物在疾病发病机制中的作用^11,12,13,14。尽管长期使用克林霉素、利福平和四环素类进行全身性抗生素治疗已在临床应用，并显示出可减少患者引流隧道数量的效果^15,16，但关于HS中抗生素耐药性厌氧致病菌的数据仍属未知。迄今为止，尚未有从HS隧道中成功分离出细菌菌株的报道，这限制了对新型抗菌治疗策略的研究以及对致病菌在HS发病机制中作用的深入评估。对病原体分离方法进行标准化，不仅有助于真正理解细菌在HS发病机制中的作用，也将推动更具靶向性和更优疗效的干预措施的转化应用。

本文重点介绍一种成功从化脓性汗腺炎（HS）隧道组织中分离微生物的方法。分离单一细菌种类是了解这些微生物在HS病理过程中所起作用的关键初始步骤。该方法为深入研究微生物在HS中的作用奠定了基础，并有助于开发更有针对性、更有效的个体化治疗策略，以应对这一慢性疾病中的细菌病原体。

方案

本方案已获得迈阿密大学机构审查委员会（IRB）的批准（方案编号：20200187）。在实施操作前，已与患者（n = 18，平均年龄 ± 标准差 = 30.9 ± 9.4 岁，女性 12 人，男性 6 人）或其法定监护人就研究内容进行充分讨论，解答其可能存在的疑虑或问题后，获取了知情同意。

1. 患者样本采集

1. 处理切除组织前，应采取严格的无菌预防措施，以尽量降低污染风险。操作组织的人员应穿戴实验服、口罩和手术帽，并使用无菌手套和无菌器械接触组织。
2. 为控制无菌条件，处理组织前将预先高压灭菌的镊子浸入厌氧转运管中（材料表）。
3. 使用无菌镊子从被诊断为化脓性汗腺炎（HS）窦道的患者病灶区域，通过手术刀或CO₂激光切除皮肤组织，并立即置于无菌培养皿中以供后续处理。
4. 在手术中心或门诊诊所内，使用预先高压灭菌的镊子探查皮肤，识别切除组织内的窦道结构，如图1A所示。
5. 组织切除后，立即在已识别的窦道部位取6 mm的全层皮肤钻孔活检样本，并将其浸入含有还原剂的半固体缓冲培养基中，装入厌氧转运玻璃管，以优化厌氧菌种在进一步分析过程中的存活率。
6. 将装有窦道组织的厌氧管置于冰上，运送至实验室。
7. 按以下所述进行样本记录：
   1. 在操作当天，收集患者信息，包括人口学资料、年龄、自报种族/族裔以及当前用药情况，不得包含任何个人身份信息。切除组织的部位应与身体部位图一并记录，因为HS窦道可出现在多个身体部位。在组织处理前后，从样本两侧拍摄切除组织的照片，并记录从窦道获取活检样本的位置。样本到达实验室后，将编码后的组织样本信息录入电子安全数据库，不得包含任何个人身份信息。

2. HS 皮肤组织处理

1. 设置与接种
   1. 穿戴实验服和手套，并将头发扎起以避免污染。将血琼脂平板（包括含卡那霉素和万古霉素的湖相布鲁氏菌血琼脂（LKV 琼脂）、含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA II SB 琼脂）、脑心浸出液琼脂（BHI）以及含 5% 羊血的苯乙醇醇琼脂（PEA））在 37 °C 培养箱中预热 10 分钟。在处理组织前，用 70% 乙醇清洁生物安全柜。
   2. 琼脂平板预热后，在平板底部或侧面标记编码后的样本名称和日期。将已灭菌的镊子、手术刀、预灭菌接种环以及琼脂平板放入生物安全柜中。
   3. 用无菌镊子从厌氧转运管中取出 6 mm 打孔活检组织，将镊子浸入培养基中。使用无菌手术刀迅速将组织切成约 1 mm² 大小的小块。将组织放入含有 500 µL 加强型梭菌培养基（RCM）的无菌微量离心管中，并短暂涡旋震荡。
      注：未采用均质化处理，因为样本在有氧环境中暴露时间较长，可能导致额外通气并潜在损失厌氧菌。
   4. 使用新的无菌接种环，将含有细菌的组织悬液在 TSA II 5% SB、LKV、PEA 加 5% SB 和 BHI 琼脂平板上进行连续四区划线接种。
   5. 利用剩余的切碎组织悬液，通过向冻存管中加入 20% v/v 无菌甘油和 80% v/v 组织悬液制备甘油菌种保存液。将甘油保存液储存在 -80 °C。若分离出的细菌活力有限，可使用组织保存样本重复分离。
   6. 将所有平板置于含 CO₂ 包的厌氧培养箱中，37 °C 培养。每 2–3 天观察一次平板，预计厌氧菌在接种后 7–14 天内生长。通过拍照记录菌落形态。
2. 组织保存
   1. 使用 8 mm 打孔活检获取通过隧道及远离隧道区域的额外全层皮肤样本，用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本制备和组织学评估，因为较大的组织样本更有可能完整捕获隧道结构。
   2. 额外保存 6 mm 打孔活检样本，用于 DNA（速冻）、RNA（置于 RNA later 中）和蛋白质提取（速冻）。
3. 菌落维持
   1. 当原始平板上观察到菌落时，拍照并记录不同菌落形态¹⁷。通常预期可观察到 10–15 种不同的菌落形态（见图 1）。
   2. 准备预热的 LKV、BHI、PEA 加 5% SB 和 TSA II 5% SB 琼脂平板（材料表）。在每块平板上标记样本编号、活检部位和日期。
   3. 使用无菌移液器吸头挑取单个菌落，并在其原始生长的同类型平板上以之字形划线接种。随后，使用同一吸头上的菌落作为 16S rDNA PCR 扩增的模板，按以下步骤操作。
   4. 使用新的无菌移液器吸头，从所有类型的琼脂平板上选择具有不同形态的单个菌落，重复步骤 2.3.3。再次在划线后立即用带有剩余菌落的吸头浸入专用 PCR 板孔中，作为 PCR 扩增的模板。
   5. 对每种不同形态的菌落重复步骤 2.3.3–2.3.4，直至所有四种 琼脂平板上的特定形态菌落均完成划线，且相应的 PCR 孔均已接种。
   6. 将新接种的琼脂平板置于含 CO₂ 包的厌氧培养箱中，37 °C 培养。待菌落生长后，在保存菌种前确认分离菌落的纯度（见下文）。若接种菌落形态不均一，重复步骤 2.3.3。根据菌落生长情况，每 4–5 天重复转接一次，直至菌落外观一致。
4. 通过 16S rDNA 菌落扩增子测序鉴定细菌种类
   1. 配制 PCR 板主混合液，每孔包含 2.5 µL 10 µM 的 16S rDNA V1–V3 正向引物（5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'）和反向引物（5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'；10 µM）、12.5 µL 2× 主混合聚合酶和 10 µL 微生物 DNA-free 水，总体积为每菌落 25 µL。
   2. 计算所有选定菌落、阴性对照（无模板）和阳性对照（可使用任意实验室菌株；我们通常使用 Staphylococcus aureus USA300）所需 PCR 主混合液的总体积。
   3. 将 PCR 板带入生物安全柜，覆盖孔板以防止污染。使用无菌移液器吸头挑取单个菌落用于接种。立即用力吹打混匀，将菌落重悬于已预加主混合液的指定孔中。同一吸头可用于亚培养和 PCR 取样。
   4. 对所有单个化脓性汗腺炎（HS）菌落和阳性对照重复步骤 2.4.3。
   5. 运行 PCR 程序：95 °C 初始变性 5 分钟以裂解选定菌落，随后进行 40 个循环（95 °C 15 秒，54 °C 1 分钟），最终 4 °C 循环可选。也可使用相同程序设置的热循环仪。
   6. 对扩增后的 qPCR 产物进行凝胶电泳，验证扩增片段大小，预期为 311 bp（图 2）。根据制造商说明书，使用 PCR 纯化试剂盒纯化成功扩增的 16S rDNA 片段。
   7. 将纯化的 PCR 产物送检，使用 16S rDNA V1–V3 正向和反向引物进行 16S 核糖体 RNA Sanger 测序。
5. 细菌保存
   注：营养要求苛刻的厌氧菌在琼脂平板上的存活能力有限。
   1. 为确保在获得测序结果（用于确认物种身份）前菌株得以保存，需从单个菌落制备琼脂平板并确认纯度以建立保存菌种。在优化液体培养基中生长条件的同时，平行从琼脂平板直接制备保存菌种。
   2. 为制备步骤 2.3 所得平板的保存菌种，使用 6 mm 无菌接种环尽可能多地挑取均一菌落。随后，在冻存管中将 细菌剧烈重悬于 800 µL 含 20% 无菌甘油的 RCM 中，并于 -80 °C 保存 以建立细菌保存菌种。
      注：此步骤确保在获得测序表征数据前及时保存营养要求苛刻的病原体。
   3. 在菌株分类确认后，优化其在液体培养中的生长并从单个菌落制备保存菌种。

结果

本研究中，我们描述了一种从化脓性汗腺炎（HS）窦道中分离和鉴定厌氧菌的实验方案。该方案具有创新性和重要意义，为研究这些细菌的功能和毒力提供了可能 体外, 离体，以及 体内 皮肤感染模型以增进我们对微生物在HS发病机制中作用的理解。首先，我们使用无菌镊子探查切除皮肤中的隧道以确定其存在图1A）。我们将窦道与结节和脓肿区分开来，因为后两者不与皮肤表面下方相通。通过窦道取6 mm全层皮肤穿刺活检，并在厌氧条件下保存，用于细菌培养，培养基选用LKV琼脂，主要用于选择革兰阴性菌，如 卟啉单胞菌属 sp. 和 普雷沃菌属 sp. TSA II 5% SB 琼脂平板可支持革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，包括 Peptoniphilus sp. 和 链球菌 sp. 所形成的菌落形态各异，包括不同颜色（如黑色、黄色、白色等）、大小和透明度，有或无溶血圈图1B。在3天内生长的菌落不太可能是兼性厌氧菌，通常包括 <...

讨论

本研究中，我们提出了一种分离和培养化脓性汗腺炎（HS）隧道定植细菌的新方法。该可重复的方法不仅有助于深入表征存在于这些病理性结构中的菌株，还将推动后续功能研究，以探索特定微生物在HS发病机制中的作用。本方案的关键步骤包括在厌氧培养基中进行组织采集与运输，这有助于保存来自HS隧道的活性苛养微生物。与所有研究一样，本研究也存在局限性，包括与外科手术相关的因素，例如皮肤消毒剂和局部麻醉药的使用可能影响组织微生物组，此外患者不同的环境暴露、卫生习惯、用药情况、疾病严重程度及合并症也可能产生影响¹⁹。另外，考虑到激光手术过程中产生的热量可能影响微生物活性，我们在组织取样时选择远离切除部位的HS病灶区域，以避免对微生物组组成造成潜在干扰。HS患者还常接受局部和/或全身抗生素以及免疫抑制药物治疗，这些因素均可能影响皮肤定植情况²⁰。因此，样本采集与处理过程的标准化显得尤为重要¹⁸。我们亦认识到，有一定比例的细菌无法培养。然而，本方案已优化，旨在分离在HS微生物组研究中被鉴定出的最具代表性的菌种。本研究分离自H...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6毫米活检打孔器	INTEGRA	33-36	可使用其他供应商产品
8毫米活检打孔器	INTEGRA	33-37	可使用其他供应商产品
琼脂糖	Sigma Aldrich	A9539	可使用其他供应商产品
厌氧培养箱	BD	260672
厌氧转运培养基	Anaerobic Systems	AS-911
脑心浸出液琼脂	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 气体发生包	BD	260678
Difco 加强型梭菌培养基	BD	218081
甘油	SIGMA	G5516-1L	可使用其他供应商产品
硬壳PCR板	BIO-RAD	HSP9601	可使用其他供应商产品
培养箱	VWR	Symphony	任何经校准的培养箱均可使用
接种环	VWR	76544-926	可使用其他供应商产品
LKV琼脂	HARDY Diagnostics	A60
无DNA微生物用水	Qiagen	338132
Nunc 冻存管	Thermo scientific	377267	可使用其他供应商产品
PCR仪（CFX Connect 实时系统）	BIO-RAD	CFX Connect 光学模块	普通热循环仪也可使用
PEA琼脂	HARDY Diagnostics	A93
Q5 高保真2X预混液	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR纯化试剂盒	QIAGEN	28104
加强型梭菌培养基	BD	218081
细头镊子	Millipore Sigma	F4017	可使用其他供应商产品
含5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA II）	Thermo scientific	221261