方法文章

经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类T细胞活性的分析

DOI：

10.3791/67643

⸱

2025年3月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Radiobiology, Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN, 3Bayerischerisches Zentrum für Krebsforschung, 4Department of Radiation Oncology, Uniklinikum Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案描述了一种实验工作流程，可实现 离体 经预处理肿瘤细胞与异基因共培养体系中人T细胞刺激的分析

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞毒性T细胞在清除肿瘤细胞中发挥关键作用，因此在肿瘤免疫学研究中受到广泛关注。肿瘤组织及其肿瘤微环境（TME）中细胞毒性T细胞的频率和活性现已被确立为多种肿瘤类型的预后和预测性生物标志物。然而，众所周知，包括放疗、化疗、免疫治疗和靶向治疗在内的多种肿瘤治疗方式，不仅影响肿瘤本身的免疫原性，也对免疫系统本身产生调节作用。因此，为了全面理解T细胞在肿瘤治疗过程中的复杂作用，需要在不同治疗背景下更深入地研究肿瘤细胞与T细胞之间的相互作用。为满足这一需求，已建立一种实验方案，用于分析经预处理的肿瘤细胞共培养条件下人源细胞毒性（CD8+）T细胞的活性及增殖能力。具体而言，来自健康供体的CD8+ T细胞使用无毒增殖标记物羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行染色，并通过CD3/CD28包被的培养板进行刺激。随后，将T细胞与经预处理的肿瘤细胞进行共培养。通过检测CFSE信号分布以及表面活化标志物的表达水平，定量评估T细胞的增殖情况。 关键词：细胞毒性T细胞，CD8+ T细胞，肿瘤微环境，TME，CFSE，CD3/CD28刺激，共培养，增殖检测，肿瘤免疫，免疫治疗 通过 流式细胞术。此外，还可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞因子的释放。该方法有助于评估治疗诱导的肿瘤细胞与T细胞相互作用的变化，为深入分析肿瘤治疗方式及其在人体内的免疫原性奠定基础 离体 环境。此外，它还有助于减少临床前 体内 分析。

引言

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如今，肿瘤的发生与进展在很大程度上依赖于对宿主免疫系统的有效操控和抑制，这一观点正变得越来越明确。即使在健康的机体中，每天也会产生转化细胞。然而，形成肉眼可见的肿瘤却是一种相对罕见的事件，因为新出现的转化细胞会被机体高效地清除。在清除恶性细胞的过程中，多种免疫细胞类型发挥作用，例如细胞毒性T细胞、自然杀伤（NK）T细胞、NK细胞或巨噬细胞1,2,3。尽管如此，有时仍会出现某些转化细胞克隆，它们与宿主免疫系统处于一种平衡状态，这种状态以肿瘤细胞克隆采用多种免疫抑制策略为特征4。最终，部分转化细胞获得进一步功能，使肿瘤细胞能够主动抑制免疫应答，从而导致肿瘤的生长和扩散。这种免疫抑制由多种机制介导，包括肿瘤细胞表面表达免疫抑制性配体，或主动招募或激活免疫调节性或免疫抑制性免疫细胞群体。这种所谓的免疫编辑概念，揭示了免疫调节在肿瘤形成与生长过程中的关键作用5。

因此，免疫系统如今不仅是癌症治疗的主要关注点，而且在许多肿瘤类型和治疗背景下也成为预测性和预后性因素，这一点并不令人意外。近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为多种实体瘤（如头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）或非小细胞肺癌（NSCLC））中颇具前景的治疗选择，其目标是调控肿瘤微环境（TME），以增强抗肿瘤免疫应答效率，并降低肿瘤细胞的免疫抑制作用6。免疫检查点抑制剂旨在通过靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体1（PD1/PD-L1）通路等免疫检查点分子，增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。这一事实凸显了T细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用。例如，在HNSCC中，ICIs已成功获批用于复发性和转移性HNSCC的一线治疗7。与此一致的是，TME中细胞毒性T细胞的存在，以及肿瘤细胞和T细胞上相应表达的PD1和PD-L1，可作为HNSCC中的预测性生物标志物8,9,10。

尽管T细胞在肿瘤免疫学和肿瘤治疗中具有关键作用，但关于T细胞与肿瘤之间相互作用的许多问题仍有待阐明。目前公认，肿瘤免疫应答是一个动态过程，且肿瘤的免疫原性可在疾病进展及治疗过程中发生变化。多种治疗方式，如化疗（CT）、放疗（RT）或靶向治疗（TT），均被广泛证实可调节肿瘤细胞的免疫表型。放疗可诱导肿瘤组织中免疫检查点分子的上调，并改变肿瘤浸润细胞的频率11,12。另一方面，靶向治疗亦可通过直接调控适应性免疫应答，在肿瘤及肿瘤微环境（TME）中促进有利的改变13,14,15,16。然而，在患者中研究这些调节作用具有挑战性，因为这需要在治疗过程中反复获取肿瘤组织进行检测。因此，迫切需要建立可靠的实验模型系统，以研究肿瘤细胞和T细胞动态的免疫表型，更重要的是，研究它们之间的相互作用。

因此，为了分析T细胞活性以及肿瘤细胞与T细胞之间的相互作用，一个全面的 离体 共培养实验需要基于简单的细胞培养操作和常用的流式细胞术分析，便于在任何实验室中实施。根据现有文献，目前尚未发表任何关于T细胞与肿瘤细胞共培养的简便且广泛应用的实验方案。尽管近期已发表若干T细胞与肿瘤类器官共培养的实验方法，但三维细胞培养技术目前仍未在所有实验室中成为常规技术。因此，我们提供了一种适用于二维细胞培养的实验方案，未来亦可拓展应用于三维细胞培养。其他已有的二维共培养方案往往更为复杂，例如需要将肿瘤细胞转导表达荧光素酶17 或仅适用于血液系统恶性肿瘤（将不匹配的T细胞与白血病细胞共培养）18在本实验方案中，从正常健康供体的外周血中分离T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体进行刺激。随后，将T细胞与经（预）处理的肿瘤细胞共培养，以分析T细胞的增殖能力及其活性 通过 流式细胞术。借此，可轻松筛选不同治疗方式（如放疗、化疗或靶向治疗）对肿瘤细胞免疫表型的影响，而这些影响又会进一步作用于T细胞的活性与增殖，从而为深入的机制分析及后续选定的临床前研究提供基础。 体内 分析。本文所述的检测方法操作简便，无需使用非常规设备、技术或材料。此外，该检测方法可轻松适用于不同的肿瘤细胞系或特定的T细胞亚群（例如CD4+ T细胞）。采用此技术可实现高度的标准化和可重复性。

方案

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本实验涉及血液采集及人原代细胞的培养，因此此类分析必须获得伦理审批。本论文中展示的所有结果均在IMMO-NHD试验的伦理批准范围内，并已从所有供者处获得书面知情同意。该研究已获得埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学机构审查委员会于2022年11月9日的批准（申请编号21-415-B）。本研究中使用的HSC4肿瘤细胞来自商业可获得的细胞系。

该实验展示了T细胞与肿瘤细胞共培养实验的全部步骤，采用人头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系HSC4，并在放疗（RT）联合两种特异性激酶抑制剂的处理条件下进行。因此，细胞数量、胰酶消化时间及处理方案等参数均针对此共培养体系设定，若用于其他肿瘤细胞系，需相应调整（详见讨论部分）。所有离心步骤均在室温下进行。本研究中使用激酶抑制剂AZD0156和VE-822靶向HSC4细胞的DNA损伤修复（DDR）系统。AZD0156（Selleckchem）抑制共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM），而VE-822（Selleckchem）靶向共济失调毛细血管扩张症及Rad3相关蛋白（ATR）。这两种抑制剂均被认为有望作为增强肿瘤细胞放射敏感性的潜在药物。它们以二甲基亚砜（DMSO）溶解，并储存于-20 °C。 图1 提供了流程图的 离体 检测，详细描述了经预处理的肿瘤细胞与经CD3/CD28刺激的人CD8+ T细胞的共培养过程。所用试剂与设备列于下文 材料表.

Tumor and T cell co-culture process; cancer treatment setup; FACS, ELISA assays; timeline diagram.
图1流程图 离体 与经CD3/CD28刺激的人源CD8+ T细胞共培养的预处理肿瘤细胞的检测 第1天：接种HSC4肿瘤细胞。第2天：处理肿瘤细胞，分离人CD8+ T细胞，CFSE染色，并将T细胞接种至包被CD3/CD28的培养板中。第3天：处理肿瘤细胞。第4天：计数代表性肿瘤细胞孔，收集并计数全部T细胞，按1:1比例共培养T细胞与HSC4肿瘤细胞。第5至第8天：共培养孵育。第8天：收集共培养细胞，冻存上清液，进行基于抗体的染色，并通过流式细胞术分析细胞。 请点击此处以查看此图的放大版本。

1. 肿瘤细胞接种（第1天）

注意：时间：1 小时。将人 HSC4 肿瘤细胞从 T75 培养瓶接种至 96 孔板中。

  1. 弃去细胞培养瓶中的上清液（D10 培养基）。
  2. 用 5 mL 37 °C 预热的 PBS 洗涤肿瘤细胞，弃去 PBS。
  3. 由于 HSC4 肿瘤细胞倾向于紧密贴附于细胞培养瓶，建议采用两步消化法以确保所有细胞完全脱落。首先加入 3 mL 胰蛋白酶，将培养瓶置于 37 °C 加热板上孵育 3 分钟，然后用移液器吸弃胰蛋白酶。
  4. 再加入 3 mL 胰蛋白酶，将培养瓶放回加热板，继续孵育直至形成单细胞悬液。显微镜下检查确认是否达到单细胞悬液状态。
  5. 加入两倍体积的 D10 培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM）终止胰酶消化，充分重悬细胞，然后将细胞转移至 50 mL 离心管中。
  6. 测定单细胞悬液中的细胞数量，并根据总体积计算肿瘤细胞的总数。建议使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。
  7. 将含有肿瘤细胞的 50 mL 离心管在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  8. 用适量 D10 培养基重悬 HSC4 肿瘤细胞，使细胞浓度达到每 200 µL 培养基中含有 15,000 个细胞。
  9. 根据计划的肿瘤细胞处理条件，在两块 96 孔板中分别接种每种条件至少 3 个复孔，每孔加入含 15,000 个 HSC4 肿瘤细胞的 200 µL 培养基（1 孔为样本，1 孔为仅肿瘤细胞对照，1 孔为共培养当天的细胞计数孔）。
    注意：细胞数量取决于细胞系及其倍增时间。不同处理条件下的细胞接种量需通过预实验确定，以避免培养期间达到 100% 汇合度。
  10. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 及饱和湿度条件下培养 24 小时。

2. 肿瘤细胞的处理（第2天）

注意：时间：3-5 小时。经过 24 小时的孵育后，先前接种的 HSC4 细胞可根据所需的处理方案进行处理。在此示例中，肿瘤细胞用 ATM 或 ATR 抑制剂处理。此外，两个 96 孔板中的一个随后还接受了 2 × 5 Gy 的照射。

  1. 配制激酶抑制剂，使终浓度为 1 µM AZD0156（ATM 抑制剂）和 0.1 µM VE-822（ATR 抑制剂），用于处理肿瘤细胞。
  2. 按相应方案处理肿瘤细胞，例如，在每块培养板中，向一组样品加入 3.1 µL ATM 抑制剂，向另一组样品加入 3.1 µL ATR 抑制剂。
  3. 在 37 °C 培养 3–5 小时后，对其中一块培养板进行 5 Gy 的辐照。
  4. 再继续培养 24 小时后，对同一块培养板再次进行 5 Gy 的辐照。

3. T细胞分离（第2天）

注意：用时：4 小时。从健康成年供体的外周血（PB）经密度梯度离心获得外周血单个核细胞（PBMCs）后，使用抗 CD8 微珠通过磁珠分选法分离 CD8+ T 细胞。分离得到的 T 细胞用 CFSE 染色后，接种于包被有 CD3/CD28 的培养板中进行刺激。为了在后续步骤中节约资源和材料，估算共培养实验所需的 T 细胞数量非常重要。根据供体的不同，约 45 ml 的 EDTA 抗凝血可分离出 50,000,000 至 100,000,000 个 PBMCs，其中 CD8+ T 细胞约占总 PBMCs 数量的 10%。

  1. 密度梯度离心
    1. 将3-5管9 mL的健康供体EDTA抗凝血转移至两个50 mL离心管中。
    2. 用 PBS + 2% FBS 将两支离心管均加至 50 mL。
    3. 准备六个离心管（带塑料衬垫用于分离PBMC），每管加入15 mL +4 °C的冷密度梯度介质。
    4. 用步骤 3.1.2 中稀释的血液 12–15 mL 小心地覆盖密度梯度介质。
    5. 以 1200 x g 离心 g 10分钟（无需减速）。
  2. T细胞刺激用6孔板的制备
    1. 制备抗体：使用 PBS 配制浓度为 1 mg/mL 的抗 CD3 抗体（克隆株 OKT3）溶液。使用 PBS 配制浓度为 0.1 mg/mL 的抗 CD28 抗体（克隆株 28.2）溶液。
    2. 建议：在离心步骤（3.1.5）期间，同步进行T细胞刺激用包被溶液的配制及孔板的包被操作。
    3. 将5 µL CD3抗体溶液与4.995 µL PBS混合，将50 µL CD28抗体溶液与4.950 µL PBS混合（终浓度：1 µg/µL）。
    4. 向6孔板的每个孔中加入1.000 µL的两种抗体溶液。
    5. 根据预期的T细胞数量，包被6孔板中的2至3个孔，37 °C下孵育至少2小时。
  3. T细胞培养基的制备
    注意：100倍浓缩L-赖氨酸的配制：在50 mL离心管中，将200 mg盐酸L-赖氨酸溶解于50 mL蒸馏水中。使用0.2 µm注射器滤器对溶液进行除菌，再用50 mL灌注注射器将滤液转移至新的50 mL离心管中。4–8 °C保存，3个月内使用。15 mM L-精氨酸的配制：将26 mg L-精氨酸溶解于10 mL DPBS中。使用0.2 µm注射器滤器对溶液进行除菌，再用10 mL注射器将滤液转移至新的离心管中。4–8 °C保存，3个月内使用。
    1. 按照步骤1.5中提到的离心时间制备T细胞培养基。
    2. 根据预期的T细胞数量，准备约10–30 mL T细胞培养基。
    3. 将不含L-精氨酸和L-赖氨酸的RPMI培养基与10%热灭活胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、1% L-精氨酸、1% L-赖氨酸和1% L-谷氨酰胺混合。示例：25.8 mL RPMI培养基 + 3 mL FBS + 0.3 mL 青霉素-链霉素 + 0.3 mL L-精氨酸 + 0.3 mL L-赖氨酸 + 0.3 mL L-谷氨酰胺。
    4. 将剩余的培养基在4 °C保存，用于接下来两天的实验，即第4天——共培养开始。每次重新进行完整实验时，建议配制新鲜的培养基。
  4. PBMC 分离
    1. 离心后（步骤 3.1.5），将上清液转移至四个新的 50 mL 离心管中，并弃去已使用的离心管。
    2. 用 PBS + 2% FBS 将离心管加至 50 mL。
    3. 300 x g 离心 g 室温下持续 8 分钟。
    4. 弃去上清液，将细胞沉淀用各1 mL含2% FBS的PBS重悬，合并至两个离心管中。
    5. 用 PBS + 2% FCS 将离心管补至 50 mL。
    6. 以 120 x g 离心 g 室温下孵育10分钟。
    7. 弃去上清液，用 1 mL 含 2% FBS 的 PBS 小心重悬细胞沉淀，并将两份沉淀合并至一个离心管中。
    8. 用 PBS + 2% FBS 将离心管定容至 50 mL。
    9. 使用Neubauer计数板对PBMCs的总数量进行计数。建议：用台盼蓝将细胞悬液按1:10比例稀释后进行计数。
  5. CD8+ T细胞的分离
    注意：根据制造商的说明书，使用CD8 MicroBeads human结合磁性分离（MS）柱和磁性激活细胞分选plus（MACS+）缓冲液，对CD8+ T细胞进行磁性分离（参见 材料表).
    1. 离心PBMCs（细胞计数后）于300 x g 10 分钟。
    2. 弃去上清液，每10⁷个细胞用80 µL MACS+缓冲液（500 mL PBS中加入10 mM EDTA和0.5% BSA）重悬细胞沉淀7 细胞（例如，将60,000,000个PBMC重悬于6 × 80 µL = 480 µL缓冲液中）。
      注意：示例：465 mL PBS + 10 mL (0.5 M) EDTA 和 25 mL BSA 储存液。
    3. 每10个CD8加入20 µL MicroBeads7 细胞，并用移液器轻轻吹打混匀。在 4 °C 下孵育 15 分钟。
    4. 孵育后，每10个细胞加入2 mL MACS+缓冲液洗涤细胞7 细胞
    5. 以 300 x g 离心 g 室温孵育10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1,000 µL MACS+缓冲液中。
    6. 将两根MS柱置于磁架上，并在下方各放置一个15 mL离心管。
    7. 用500 µL MACS+缓冲液预处理柱子。缓冲液流经柱子后可收集于下方的离心管中。此步骤也可与步骤3.5.6平行进行。
    8. 然后，将细胞悬液等量移入已准备好的MS柱中。流穿部分可收集到相同的离心管中，其中现在含有所有未标记的CD8阴性细胞。
    9. 用 3 × 500 µL MACS+ 缓冲液冲洗层析柱。每次需在层析柱流干或停止滴液后，立即在柱顶加入新的缓冲液。
    10. 将最终收集的细胞标记为“流穿组”或“CD8阴性组”，并合并至同一离心管中。后续可用于检测分离纯度。 通过 流式细胞术
    11. 取一支新标记为“CD8+ T细胞”的15 mL离心管。将分选柱从磁铁上取下，置于该离心管上。
    12. 用 1,000 µL MACS+ 缓冲液分别冲洗含有磁标记 CD8 阳性 T 细胞的两根色谱柱。操作时，将缓冲液加入色谱柱后，立即使用厂家提供的推杆轻轻推动，将溶液从色谱柱中缓慢推出。
      注意：对两列均进行此操作，收集2 mL T细胞总悬液用于离心。
    13. 使用血细胞计数板对T细胞总数进行计数。建议：用台盼蓝按1:4比例稀释。
  6. CFSE染色T细胞
    1. 将分离的T细胞在300 x g条件下离心 g 5 分钟。
    2. 离心期间，将1.1 µL CFSE溶液加入10 mL PBS中，配制CFSE染色液，终浓度需为1 µM。
    3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1,000 µL PBS 中。以 300 x g 5 分钟。
    4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2000 µL CFSE 染色液（1 µM）中，37 °C 孵育 20 分钟。
    5. 将染色后的细胞在300 x g条件下离心 g 5 分钟后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1,000 µL PBS 中。
    6. 300 x g 离心 g 5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量T细胞培养基中，调整细胞浓度至1.5–2 × 106 约3-4 mL T细胞培养基中的T细胞。
  7. 将T细胞接种至6孔板
    1. 弃去6孔板中的包被液。
    2. 每孔接种150万至200万个分离并染色的T细胞，加入3-4 mL T细胞培养基。
    3. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 T 细胞2 接下来的48小时
      注意：始终将接种密度调整为1.5 × 10⁶ 个细胞 / 3 mL。避免以较低密度接种T细胞。较高密度接种虽可行，但需预先进行测试。

4. 共培养开始（第4天）

注意：时间：2 小时。在确定 HSC4 肿瘤细胞的细胞数量后，以 1:1 的比例将 T 细胞加入 96 孔板中。

  1. 每种条件下收获一个孔，以确定具有代表性的细胞数量
    1. 弃去用于细胞计数检测的示例孔中的上清液。
    2. 首先用 100 µL PBS 洗涤细胞，然后弃去 PBS。
    3. 加入 100 µL 胰蛋白酶，于加热板上孵育 5 分钟。随后重悬细胞，并在显微镜下检查单细胞悬液；若细胞未完全脱落，可再添加 50 µL 胰蛋白酶。
    4. 一旦所有细胞均脱落，立即加入 100 µL（若此前额外添加了 50 µL 胰蛋白酶，则加入 150 µL）D10 培养基以终止胰蛋白酶反应，并进行重悬。
    5. 将孔中全部 200 µL 液体转移至 1.5 mL 样品管中，并取其中 100 µL 用于细胞计数。注意根据取样体积对测得的细胞数进行校正。
  2. 使用无毒荧光细胞示踪染料对 HSC4 肿瘤细胞进行染色
    1. 通过将 2 µL 细胞示踪剂溶解于 20 mL PBS 中（终浓度为 0.1 µM，按生产商说明）配制细胞示踪工作液（参见材料表）。
    2. 吸出含肿瘤细胞各孔中的 D10 培养基并弃去。
    3. 向肿瘤细胞孔中加入 200 µL 细胞示踪液，在 37 °C 下孵育 20 分钟。
    4. 孵育结束后，弃去染色液，并加入 100 µL PBS 洗涤一次，随后弃去 PBS。
    5. 向每孔加入 200 µL 新鲜 D10 培养基。
  3. T 细胞的收获（6 孔板）
    1. 轻轻吹打重悬 T 细胞及其培养基；大多数 T 细胞处于悬浮状态，可直接通过移液将其从孔中收集。
    2. 在显微镜下检查各孔是否已无残留细胞；若仍有细胞附着，可加入 1,000 µL 胰蛋白酶，将培养板置于 37 °C 加热板上直至 T 细胞完全脱落，随后加入 1,000 µL PBS 或 T 细胞培养基以终止反应（可选）。
    3. 使用血球计数板（Neubauer 计数室）对 T 细胞进行计数。然后以 300 × g 离心 5 分钟。
    4. 将 T 细胞重悬于 T 细胞培养基中（使用第 2 天 T 细胞分离时配制的相同培养基），调整至终浓度为每 20 µL 含 10,000 个 T 细胞。
  4. 将 T 细胞加入 HSC4 肿瘤细胞（96 孔板）
    1. 根据先前测定的肿瘤细胞数量，按 1:1 的比例向肿瘤细胞孔中加入所需数量的 T 细胞。
    2. 每种条件下保留一个不含 T 细胞的肿瘤细胞孔作为“仅肿瘤细胞”对照。该“仅肿瘤细胞”对照可用于流式数据的精确设门。
    3. 向一个空孔中加入 200 µL T 细胞悬液作为“仅 T 细胞”对照（含 200,000 个 T 细胞）。该“仅 T 细胞”对照可用于流式数据的精确设门。
    4. 将共培养体系在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 96 小时。

5. 通过流式细胞术定量分析T细胞增殖（第7天）

注意：时间：3小时。将共培养体系继续孵育96小时后，收集各孔细胞，并使用包含不同抗体的抗体混合物进行染色，具体抗体选择取决于研究假设（例如抗-CD3、CD8、HLA-DR和CD25抗体）。随后，通过多色流式细胞术分析细胞。

  1. 为每个待收获的孔准备并标记一批流式管和微量离心管。
  2. 细胞收获
    1. 将细胞在培养基中重悬，然后转移至流式管中。
    2. 用 100 µL PBS 洗涤细胞，随后将洗涤液转移至流式管中。
    3. 向孔中加入 100 µL 胰蛋白酶，于加热板（37 °C）孵育 5 分钟。
    4. 重悬细胞，然后在显微镜下观察是否所有细胞均已脱落。若是，则将胰酶消化后的细胞悬液转移至流式管中。
    5. 在显微镜下检查所有孔是否均已空置；若未完全清空，则重复步骤 5.2.3–5.2.4。
  3. 收集共培养上清液用于后续实验
    1. 将装有细胞的管在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
    2. 小心吸取约 300 µL 上清液，转移至另一批微量离心管中，并于 -20 °C 冷冻保存。该上清液后续可用于如 ELISA 等实验，以定量分析分泌的细胞因子。
  4. 使用抗体对细胞染色以进行流式细胞术
    1. 配制抗体混合液：将 5 µL anti-CD3-Krome Orange、0.5 µL anti-CD8-PerCP-Cy5.5、1 µL anti-HLA-DR-APCVio770 和 2.5 µL anti-CD25-PE-Dazzle 加入 91 µL PBS/FACS 缓冲液中。
    2. 向每管中加入 200 µL FACS 缓冲液（含 2% FBS 和 2% EDTA 的 PBS），并重悬细胞。
    3. 再次在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL 预先配制的抗体混合液（步骤 5.4.1）中，在 4 °C 冰箱中避光孵育 30–45 分钟。
    4. 孵育结束后，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。
    5. 使用能够区分上述所有荧光标记抗体及 CSFE 信号的流式细胞仪进行检测。

6. 门控策略与数据分析

  1. 排除双联体并鉴定正确的T细胞群体（图2A).
    1. 根据前向散射排除双联体细胞群体 与侧向散射面积（FSC-A） 与. SSC-A）（单细胞）
    2. 基于前向散射绘制“单细胞”以鉴定T细胞 与侧向散射面积（FSC-A） 与. SSC-A)（T细胞）。
      注意：为了获得最佳的尺寸排阻效果，应平行测量“仅T细胞”和“仅肿瘤细胞”样本（图2B).
    3. 将CD3表达与SSC-A作图以区分T细胞。进一步通过将CD8信号与SSC-A作图来鉴定CD8阳性T细胞。所有T细胞均为CD3+/CD8+（CD8+ T细胞）。图2A).
    4. 将所有“CD8+ T细胞”的CFSE信号绘制成直方图。
      注意：对非增殖亚群（CFSE信号最强）、增殖亚群（所有CFSE信号降低的T细胞）以及高度增殖亚群（所有第4代及以后的T细胞）进行设门分析th 或较弱的CFSE峰。
  2. T细胞群体中活性相关表面标志物的分析
    1. 遵循设门步骤（步骤 6.1）图3A).
    2. 选项A：选择“CD8+ T细胞”作为输入，通过将相应的表面标志物荧光信号与SSC-A特性进行绘图，分析其CD25或HLA-DR表达情况。
      注意：如果可检测到明显的 CD25 高表达亚群，建议对 CD25 高表达群体设门。该原则同样适用于 T 细胞上 HLA-DR 的设门/分析图3B).
    3. 选项B：选择“CD8+ T细胞”作为输入，通过将相应的表面标志物荧光信号与SSC-A特性进行绘图，分析其CD25或HLA-DR表达情况。
      注意：若无法检测到明显的亚群（取决于所分析的表面标志物），则建议分析整个T细胞群体平均荧光强度（MFI）的偏移情况图3C).

Flow cytometry analysis of T cell proliferation using CFSE; diagram with histograms and scatter plots.
图2CFSE标记的预刺激T细胞与经预处理的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤细胞共培养96小时后，分析其增殖的流式细胞术设门策略。 T细胞和肿瘤细胞在96孔板中共培养96小时后收集，使用T细胞特异性表面标志物染色，并通过流式细胞仪进行检测。A) 根据FSC-A/FSC-H排除双联体，首先通过细胞大小（FSC-A/SSC-A）圈选T细胞。进一步分析T细胞的CD3（抗CD3 Krome Orange）和CD8（抗CD8 PerCP-Cy5.5）表达。将CD3+/CD8+ T细胞绘制于直方图中，并分析CFSE信号强度。CFSE信号代表具有不同增殖行为的T细胞亚群。CFSE信号最强的T细胞定义为“非增殖性”细胞。所有因细胞分裂导致信号减半而形成明显峰形的CFSE信号降低的亚群，统称为“增殖性”细胞。分裂超过三次（出现超过三个CFSE信号峰）的T细胞定义为“高度增殖性”细胞。B作为对照，额外检测仅含预刺激T细胞和仅含预处理肿瘤细胞的样本。可通过FSC-A参数根据细胞大小区分T细胞和HSC4肿瘤细胞。 与. SCC-A 信号。此外，通过与同种异体肿瘤细胞单独共培养，分析未受刺激的 CD8+ T 细胞，以检测 T 细胞活化情况。C作为对照，将未受刺激的CFSE标记T细胞与共培养平行孵育96小时。D未刺激的CFSE标记T细胞与预处理的肿瘤细胞共培养。96小时后收集细胞，按标准流程检测CFSE信号。未刺激的T细胞无论单独培养或与预处理的肿瘤细胞共培养均未出现增殖。 请点击此处以查看此图的放大版本。

T细胞分选、荧光偏移分析、CD25和HLA-DR标志物的流式细胞术示意图。
图3：与经预处理的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞共培养96小时后，与T细胞活性相关的表面标志物（CD25和HLA-DR）表达的分选策略。（A）根据前向散射面积（FSC-A）与高度（FSC-H）特征排除双联体，首先依据细胞大小（FSC-A/SSC-A）对T细胞进行分选。随后进一步分析T细胞表面CD3（抗CD3 Krome Orange）和CD8（抗CD8 PerCP-Cy5.5）的表达。可在两种不同条件下对T细胞表面活性标志物CD25（抗CD25 PEDazzle594）和HLA-DR（抗HLA-DR APC-Vio770）进行分选。（B）基于密度图，对所有CD8+ T细胞中特定CD25high或HLA-DRhigh亚群的比例进行分选。（C）或者，可对整个CD8+ T细胞群体的两种活性标志物进行平均荧光强度（MFI）偏移的检测。图中展示了与HSC4肿瘤细胞共培养后T细胞表面标志物表达分析的代表性结果。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

将来源于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的HSC4肿瘤细胞接种并过夜培养。24小时后，用激酶抑制剂处理细胞。3小时后，施加前两剂每次5 Gy的辐射剂量。24小时后，施加第二剂辐射，细胞再次过夜培养。与此同时，在共培养开始前48小时，从健康供体血液中分离T细胞。首先，使用密度梯度离心管和无菌分离介质分离外周血单个核细胞（PBMCs）。使用细胞计数板对PBMCs进行计数，并利用CD8+ T细胞分离试剂盒分离CD8+ T细胞。分离得到的CD8+ T细胞随后用CFSE（1 µM）染色并再次计数。将T细胞以1.5 × 106 个细胞/3 mL的密度接种于预先包被CD3/CD28的培养板孔中。经48小时刺激后，收集T细胞，计数，并重悬至10,000个细胞/10 µL的密度。此外，取部分接种的肿瘤细胞孔进行收集和计数，并为所有剩余孔更换培养基。按1:1的比例将T细胞加入肿瘤细胞中。共培养96小时后，收集共培养体系，上清液于-20 °C保存，细胞则进行染色并用流式细胞术检测（图1）。

通过排阻体积及CD3/CD8阳性来鉴定T细胞。CD3+/CD8+阳性细胞的CFSE信号显示了非增殖性T细胞（高CFSE信号）以及不同亚群的增殖性T细胞（CFSE信号强度降低）的分布情况。以HSC4 HNSCC细胞系为例测量了增殖性T细胞的比例（图4A）。所有至少经历一次分裂的T细胞被定义为“增殖性”T细胞。经历超过3次分裂的T细胞被定义为“高度增殖性”T细胞（图4B）。对于HPV阴性的HSC4细胞系，当T细胞与经照射的肿瘤细胞共培养时，其增殖率略有升高。与经放疗联合ATM抑制处理的HSC4细胞和T细胞共培养相比，经放疗联合ATR抑制处理的HSC4细胞与T细胞共培养可显著促进T细胞的连续增殖。在“高度增殖性”T细胞亚群中，HSC4细胞经放疗联合ATR抑制预处理对刺激T细胞增殖的效果最为显著（图4B）。

HSC4 T细胞增殖柱状图；ATM/ATR抑制剂的数据分析，RT影响评估。
图4：CFSE标记T细胞的增殖情况，用于分析HSC4处理对T细胞增殖的影响。（A）与经预处理的HPV阴性HSC4肿瘤细胞共培养96小时后，增殖T细胞的比例。与接受RT或RT联合ATRi处理的HSC4肿瘤细胞共培养相比，经RT+ATMi处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞增殖显著降低。（B）HSC4肿瘤细胞接受放疗（RT）后，诱导出更高比例的高增殖性T细胞（超过三次细胞分裂）。在与经RT+ATRi预处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，高增殖性T细胞的比例最高。柱状图显示了四次独立实验的数据，T细胞来自四位独立的健康供体（n = 4；均值 ± 标准差）。（*p≤ 0.05，**p≤ 0.01，***p≤ 0.001，****p≤ 0.0001；对于非正态分布数据，采用双尾Mann-Whitney-U检验，对所有实验条件进行相互比较以评估统计学显著性）。请点击此处查看该图的放大版本。

基于增殖的CFSE丢失可用于量化T细胞增殖速率。此外，一些细胞表面标志物被描述为与T细胞活性相关，例如CD25和HLA-DR。因此，通过流式细胞术分析了所有CD3+和CD8+ T细胞表面的CD25和HLA-DR表达（图5）。如果能够检测到明显的CD25high或HLA-DRhigh亚群，则可通过设门圈定这些高表达细胞来量化其表达（图3B）。若无法检测到明显的亚群，则可测量整个细胞群的平均荧光强度（MFI），并量化不同条件下MFI的变化（图3C）。

以CD25和HLA-DR的MFI所确定的表达水平为例，在与预处理的HSC4肿瘤细胞共培养96小时后进行了分析（图5）。T细胞与经放疗（RT）处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞上CD25的表达显著下调。值得注意的是，与ATR抑制剂（ATRi）预处理相比，仅使用ATM抑制剂（ATMi）对肿瘤细胞进行预处理即可显著降低CD25的表达水平。在与RT联合应用的情况下，尽管RT本身导致T细胞上CD25表达下降，但RT联合ATMi处理组中CD25的表达高于RT联合ATRi组（图5A）。关于T细胞上HLA-DR的表达，RT总体上引起HLA-DR的上调；但当RT与ATMi或ATRi联合使用时，则观察到不同的表达模式（图5B）。与单独RT或RT联合ATMi处理相比，HSC4细胞经RT联合ATRi预处理后与T细胞共培养，可显著提高HLA-DR的表达水平。

HLA-DR 和 CD25 表达箱线图、T 细胞共培养、肿瘤细胞、MFI、统计分析
图 5：T 细胞与经预处理的 HSC4 肿瘤细胞共培养 96 小时后，其表面活化标志物 CD25 和 HLA-DR 的表达情况。 CD25 和 HLA-DR 的表达水平基于整个 T 细胞群体 MFI 的偏移进行分析。HSC4 细胞接受放疗（RT）后，导致 T 细胞表面 CD25 表达降低，而 HLA-DR 表达升高。与 RT 联合 ATR 抑制剂（ATRi）相比，RT 联合 ATM 抑制剂（ATMi）处理组表现出显著不同的表达模式。箱线图展示了来自四次独立实验的数据，T 细胞来源于四位独立的健康供体（n = 4；均值 ± 标准差）。所有实验条件之间采用双尾 Mann-Whitney-U 检验对非正态分布数据进行比较分析（*p≤ 0.050）。请点击此处查看该图的放大版本。

这些数据示例性地表明，对肿瘤细胞（本例中为HSC4 HNSCC细胞）的处理会影响肿瘤细胞的免疫原性。可通过将肿瘤细胞与预先激活的T细胞共培养来监测这一影响，根据所采用的肿瘤细胞处理方案，人T细胞会表现出不同的增殖行为以及激活标志物的表达。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所展示的实验方案提供了一种快速简便的方法，用于在与经预处理的肿瘤细胞共培养的条件下，分析T细胞的增殖能力及其活化状态。通过该方法可轻松筛选不同治疗方式（如放疗RT、化疗CT或靶向治疗TT）对T细胞活性和增殖的影响，为后续深入评估具有潜力的治疗策略奠定免疫学分析基础。本论文展示的代表性结果证实，该同种异体T细胞共培养实验体系性能良好。在与不同预处理的人源HSC4（头颈部鳞状细胞癌HNSCC）细胞共培养时，T细胞的增殖水平及活性均表现出显著差异（图4 和 图5）。研究发现，HSC4细胞经放疗RT单独处理或联合靶向治疗TT处理后，可促进T细胞的增殖，尤其是高增殖能力T细胞亚群的扩增（图4）。与增殖率的定量结果一致，不同处理方案对T细胞的活化状态也产生了差异性影响。总体而言，放疗RT的应用导致T细胞表面CD25表达显著下调，而HLA-DR的表达则上调。放疗会在受照射的肿瘤细胞中诱导DNA损伤，进而引发细胞应激反应，包括释放与应激和损伤相关的分子及细胞因子，并上调免疫调节性细胞表面配体的表达19。

将放疗（RT）与以DNA修复抑制剂形式存在的靶向治疗（TT）相结合，可进一步增强并维持这些效应，因为肿瘤细胞无法有效修复放疗引起的DNA损伤。这可能进一步促进并维持免疫原性因子的分泌以及免疫原性细胞表面配体的表达20。与此一致，我们先前已证明，使用放疗联合DNA损伤抑制剂处理肿瘤细胞（HNSCC）可改变肿瘤细胞表面的免疫表型。免疫表型的调控包括免疫刺激分子ICOS-L以及免疫抑制分子PD-L1的调节11。作为对肿瘤细胞免疫表型改变的响应，T细胞也可能调节其细胞表面活化标志物的表达。此外，放疗已被广泛证实可刺激促炎性细胞因子（如IFNγ或IL-6）的释放，这些细胞因子反过来影响T细胞的增殖和活性21。T细胞表面活化标志物的表达是一个高度动态的过程。Zimmerman等人的研究数据22显示，CD25在刺激后24小时高度表达，但在刺激后96小时再次下调。这一结果与我们的发现一致。相比之下，HLA-DR是一种晚期活化标志物，通常出现在CD25和CD69表达升高之后23。值得注意的是，与RT + ATMi相比，RT + ATRi组合可显著上调T细胞上的HLA-DR表达。该发现与Dillion等人的研究结果一致，后者证明了ATRi与RT联用在诱导炎性肿瘤微环境（TME）方面具有协同作用24。仅使用激酶抑制剂处理肿瘤细胞对T细胞活性和增殖的调节作用较弱（图5）。这可能是因为DNA修复抑制剂ATMi和ATRi主要作为放疗诱导的DNA损伤的增强剂发挥作用，因此在单药治疗时免疫原性较弱。我们此前已证实单独使用ATMi或ATRi的毒性极低11。综上所述，这些结果证实了放疗（以及联合DNA损伤抑制剂的靶向治疗）具有免疫原性潜力，并进一步表明该实验体系适用于筛选不同治疗方式在人头颈部肿瘤细胞中的免疫刺激能力。

尽管本文介绍的方法简便且可靠，但在实验方案中仍有一些关键步骤需要预先考虑。在T细胞分离过程以及流式细胞术分析过程中，必须保持较高浓度的EDTA。因此，建议将供体血液采集至含EDTA的抗凝采血管中，并使用添加了10 mM EDTA的MACS缓冲液，以确保高效地分离T细胞，并获得均一的单细胞悬液用于流式细胞术检测。此外，T细胞培养基的成分对T细胞的增殖能力至关重要。在测试了多种培养基配方后发现，低浓度L-精氨酸和L-赖氨酸的培养基可获得最佳的T细胞增殖信号，因为L-精氨酸对T细胞的代谢和存活具有关键作用，需以适宜的浓度提供25,26。然而需要注意的是，L-精氨酸和L-赖氨酸溶液长期不稳定，应在3个月内使用完毕。为了达到最佳刺激效果，每次T细胞培养实验均需新鲜配制添加氨基酸的T细胞培养基。此外，T细胞和肿瘤细胞的细胞数量也是影响实验结果读出的关键因素，必须予以充分考虑。

对于肿瘤细胞，一方面，共培养实验结束时，希望细胞融合度达到70%至80%。肿瘤细胞过度生长可能导致分泌抑制细胞生长的因子，从而影响T细胞的增殖速率。由于肿瘤细胞的生长高度依赖于特定的细胞系，我们建议在不同孔板中以及不同处理条件下，充分测试相应肿瘤细胞系的生长行为。此外，肿瘤细胞与T细胞应以1:1的比例进行共培养。因此，必须为每种处理条件额外接种一孔肿瘤细胞，用于在共培养开始当天测定细胞数量，从而确保为不同处理条件接种适当数量的T细胞。关于T细胞的数量，需注意从健康供体中分离得到的T细胞数量存在较大的个体差异。T细胞约占健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）的45%至70%27。因此，在采血时就应大致估算所需T细胞的数量。此外，T细胞的密度对其活化效率和存活至关重要。因此，在共培养开始前的初始刺激阶段，应将T细胞以每6孔板孔3 mL T细胞培养基中至少接种150万个细胞的浓度进行培养。允许使用更高的T细胞密度，但应避免更低的密度。T细胞的活化情况也可通过显微镜下形态学观察进行评估，因为活化的T细胞倾向于形成细胞簇。

由于该方法是一种用于研究不同肿瘤细胞系及治疗方式免疫刺激能力的简化实验体系，因此存在一些需要考虑的局限性。首先，该检测基于异基因系统，即供体T细胞与相应的肿瘤细胞系之间的人类白细胞抗原（HLA）不匹配。因此，这种HLA不匹配本身可能已足以诱导T细胞活化，进而引起T细胞增殖，而无需肿瘤细胞经处理后提供额外的刺激信号。28为量化这一非预期效应，将分离的T细胞与HSC4细胞系共培养，但未预先使用CD28和CD3抗体进行刺激。结果发现，在此条件下几乎未诱导T细胞增殖，表明在该特定实验体系中，HLA不匹配对T细胞活化的影响较小。此外，尽管处于同种异体环境下，仍观察到不同肿瘤细胞处理方式所导致的T细胞增殖与活化存在显著差异。然而，在建立该检测方法时，应在实验初期对T细胞可能由同种异体反应诱导的增殖进行测试与定量。推荐设置“仅T细胞”和“仅肿瘤细胞”对照组，以实现充分的设门分析，且此类对照在每次实验重复中均为必需。但需注意，同种异体共培养系统缺乏对肿瘤特异性抗原的识别，因此该体系可能无法准确反映体内实际发生的特异性抗肿瘤免疫应答 体内 在患者中29,30为进一步改进，可采用更复杂的自体共培养方法。在此方法中，需培养患者来源的肿瘤活检组织，并将其与来自同一患者外周血分离的T细胞进行共培养。28然而，这种实验方法不仅在原代肿瘤细胞的培养方面可能存在挑战，而且在患者来源生物材料的可获得性方面也存在困难。另一个需要考虑的局限性是共培养体系中肿瘤细胞与T细胞的比例。由于推荐的细胞比例为1:1，该比例并不能反映患者肿瘤微环境（TME）中的生理状况。31然而，这一局限性必须被接受，因为当T细胞数量较低时，增殖率和活化状态的变化无法被量化。

在肿瘤免疫学领域，该检测方法提供了一种简便快速的实验手段，可用于筛选不同治疗方式的免疫原性 体外 因此，不仅可以通过对免疫原性方面最有前景的方法进行预筛选来节省时间，而且还可以 体内 实验。由于只有前景良好的治疗方案才会在动物模型中进一步研究，以反映机体整体的免疫系统，因此可减少动物模型的使用。此外，由于该检测基于人原代细胞和人癌细胞系，其结果相较于基于其他模型系统和物种的检测，可能更易于转化为临床应用。

未来，该检测方法可进行调整和优化，以回答更具体的研究问题。例如，可对T细胞进行处理，以更贴近患者体内的治疗情境。由于肿瘤反应性T细胞主要存在于肿瘤微环境（TME）中，它们同样会受到放射治疗（RT）等局部治疗的影响，也可能受到化疗（CT）或靶向治疗（TT）等全身性治疗的影响。32进一步改进该检测方法是将T细胞与肿瘤细胞系来源的肿瘤球体共培养，甚至与患者来源的肿瘤类器官共培养。这些三维培养模型在结构上更接近患者体内的肿瘤组织。28最后，实验的读出结果 通过 流式细胞术可轻松地进行调整，以进一步研究T细胞表面的其他分子，或通过分析肿瘤细胞上免疫检查点分子的表达情况。除了确定T细胞的免疫表型外，还可以利用共培养实验中的细胞培养上清液，定量检测分泌的细胞因子或趋化因子，从而更深入地了解T细胞的活性。总之，本方案提供了一种全面、稳健且简便的T细胞与肿瘤细胞共培养检测方法，可用于筛选不同癌症治疗方式的免疫原性。由于该检测方法可根据特定的研究问题进行调整，因此非常适用于肿瘤免疫学这一广泛领域的研究应用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究部分由埃尔兰根临床研究跨学科中心（IZKF Erlangen）和巴伐利亚癌症研究中心（BZKF）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL Cellstar 离心管Greiner Bio-One GmbH188271
50 mL Cellstar 离心管Greiner Bio-One GmbH227261
6 孔细胞培养板，无菌，带盖Greiner Bio-One GmbH657160
96 孔细胞培养板，无菌，F 型底，带盖Greiner Bio-One GmbH655180
AZD0156Selleck Chemicals GmbHS8375
Berzosertib (VE-822)Selleck Chemicals GmbHS7102
CASYcupsOMNI Life Science GmbH & Co KG 5651794
CASYtonOMNI Life Science GmbH & Co KG 5651808
CD25a, PE-Dazzle594, 小鼠 IgG1Biolegend356126
CD28-UNLBBeckmann Coulter, Inc.IM1376
CD3a, Krome Orange, 小鼠 IgG1Beckmann Coulter, Inc.B00068
CD3e 单克隆抗体Thermo-Fisher Scientific, Inc.MA1-10176
CD4, APC, 抗人小鼠 IgG1BD Pharmingen555349
CD8 MicroBeads，人源Miltenyi Biotec, Inc.130-045-201
CD8a, PerCP-Cy5.5, 小鼠 IgG1Biolegend300924
CellTracker Deep Red 染料Thermo Fisher Scientific, Inc.C34565
CFSE Merck KGaA (Sigma-Aldrich)21888
DMEM（Dulbecco´s 改良 Eagle´s 培养基）PAN-Biotech GmbHP04-02500
DxFlex 流式细胞仪（带自动进样器）Beckmann Coulter, Inc.C44326, C02846
EDTA 二钠盐二水合物Carl Roth GmbH + Co. KG8043.2
FBS superior  Merck KGaA (Sigma-Aldrich)S0615-500ML
FBS superior  Merck KGaA (Sigma-Aldrich) S0615-100ML用于制备热灭活 FBS。56 °C 下加热 30 分钟并混匀，以灭活补体蛋白。
Graph Pad Prism（版本号 9）GraphPad Software-
HLA-DR、DP、DQ 抗体，抗人，APC-Vio770Miltenyi Biotec, Inc.130-123-550
Kaluza（版本号 2.1）Beckmann Coulter, Inc.-
L-精氨酸Merck KGaA (Sigma-Aldrich)A8094-25G
L-赖氨酸单盐酸盐Merck KGaA (Sigma-Aldrich)L5626-100G
MACS BSA 储存液Miltenyi Biotec, Inc.130-091-376
MS 柱Miltenyi Biotec, Inc.130-042-201
改良 Neubauer 计数板Paul Marienfeld GmbH & Co. KG 640010
PBSMerck KGaA (Sigma-Aldrich)D8537-500mL
青霉素-链霉素Thermo-Fisher Scientific, Inc.1514-122
ROTISep 1077Carl Roth GmbH + Co. KG0642.2
RPMI-1640 培养基Merck KGaA (Sigma-Aldrich)R1790
SepMate 50 mL 离心管Stemcell Technologies85450
台盼蓝Merck KGaA (Sigma-Aldrich)T6146-25G
胰蛋白酶Thermo-Fisher Scientific, Inc.15400054

参考文献

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T CD8 T CFSE

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