用于体外测定的人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程模型

摘要

单核细胞和巨噬细胞是具有很强可塑性和可重新编程的免疫细胞，对健康和疾病至关重要。它们通过采用特定的分化程序和表型来感知和响应广泛的刺激。我们已经标准化了一个体外模型来研究巨噬细胞极化和重编程，为研究提供了有价值的工具。

摘要

单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞是多功能的，几乎存在于所有身体组织中。它们协调先天免疫和适应性免疫的启动和解决阶段，显着影响保护性免疫和免疫介导的病理损伤。虽然组织驻留巨噬细胞是维持稳态稳态的关键作用，但在损伤或炎症损伤后，大量单核细胞从外周血募集到组织中。单核细胞衍生的巨噬细胞 （M-DM） 可以分化为许多动态亚型，其表型和功能取决于当地的组织环境。

为了比较 M-DM 分化和极化过程中的不同刺激或环境条件，我们标准化了人非极化 M-DM M0 和一些主要细胞因子极化巨噬细胞、IFNγ/LPS 衍生的 M1、IL-4 衍生的 M2a 和 IL-10 或地塞米松衍生的 M2c 的体外模型，以通过流式细胞术和实时 PCR 分析 M-DM 的偏斜重编程。我们发现 CD64 、 CD206 、 CD163 、 CD14 和 MERTK 可以通过流式细胞术清楚地区分非极化 M0 和极化 M1 、 M2a 和 M2c。此外，我们将 IRF1 和 CXCL10 定义为经典 IFNγ/LPS 衍生的 M1-、IRF4-、CCL22-和 TGM2 特异性转录物的特异性基因，以及地塞米松衍生的 M2c 的 MERTK 基因。综上所述，我们的标准化 M-DM 方案可以给出主要的体外图谱，以分析人类 M-DM 在不同刺激下的分化和极化。

引言

巨噬细胞，首先由 Metchnikoff 因其吞噬能力而发现，是后生动物生命的基础古老细胞。它们在成年哺乳动物中普遍存在，表现出显着的解剖和功能多样性。作为单核吞噬系统的一部分，巨噬细胞与树突状细胞和单核细胞一起，在各种生物过程中起着至关重要的作用，从发育和稳态到针对病原体的免疫反应^1，2。常驻巨噬细胞专门用于其组织微环境，充当哨兵，监测组织健康并响应生理变化和外部威胁。它们有限的可塑性被认为是维持组织稳态的进化适应。相比之下，募集的单核细胞更灵活，可以在炎症期间分化成不同的巨噬细胞表型。炎症和组织生态位的这种双重影响塑造了巨噬细胞的功能多样性³。因此，根据当地的组织环境，单核细胞衍生的巨噬细胞 （M-DM） 可以分化为许多亚型。局部代谢物、生长因子、细胞因子和细胞间相互作用^4，5，6 概述了它们的表型和功能。此外，巨噬细胞是抑制炎症并驱动血运重建和组织修复的因子的关键生产者^7，8。

鉴于至少三个主要的军备控制极化（外在、内在和组织环境条件），巨噬细胞极化应被视为多维²。描述巨噬细胞分化和极化的主要障碍和陷阱是文献中的异质性实验条件以及在体外和体内实验中定义巨噬细胞术语缺乏共识⁹。尽管如此，针对各种实验场景，实验标准已经开始一些统一。

为了更好地了解人类巨噬细胞领域，我们需要标准化和明确的 M-DM 体外模型来连接、分化、极化、表型和重编程，以及特定功能。我们的目标是建立人非极化 M-DM M0 和细胞因子极化巨噬细胞的标准化体外模型，以通过流式细胞术和实时 PCR 研究 M-DM 的偏斜重编程。尽管巨噬细胞极化是一个动态过程，因为它们具有高度可塑性和整合来自环境的多个信号的能力，但我们在这里表征了非极化 M-DM （M0） 和一些体外极化状态，作为经典的促炎状态，通常也称为 M1，用 IFNγ 和 LPS 诱导。同样，组织修复和调节 M2 巨噬细胞在用 IL-4 诱导时可定义为 M2a，当用地塞米松或 IL-10 刺激时可定义为 M2c。这些极化态在时间和空间上捕捉了宽广的 M-DM 环境光谱的快照，但为我们提供了一些基点来设置分析图，将测试条件定位在哪里。

尽管表面标志物和转录程序复杂而动态地结合在一起，但在体外分析 M-DM 时，我们设定 CD64、CD206、CD163、CD14 和 MERTK 可以将非极化 M0 条件与 IFNγ/LPS 诱导的 M1、IL-4 诱导的 M2a 和 IL-10 或地塞米松通过流式细胞术诱导。此外，IRF1 和 CXCL10 基因表达被定义为对 IFNγ/LPS 诱导的 M1 具有特异性;IL-4 衍生的 M2a 的 IRF4、CCL22 和 TGM2 特异性转录本;和 MERTK 基因用于地塞米松衍生的 M2c，设置额外的基点以比较受不同刺激攻击甚至与其他细胞类型共培养的 M-DM 的偏斜重编程。

方案

所有健康的志愿献血者都提供了书面知情同意书，该研究得到了阿根廷国家医学院机构伦理委员会 （IMEX-CONICET-ANM） 的批准。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅材料表。

1. 外周血单核细胞 （PBMC） 分离

注：PBMC 是从 40 mL 抗凝外周血中分离的，柠檬酸钠为 3.8%，并使用 Ficoll-Hypaque 密度梯度 （1077） 离心。该方案在 BSL2 生物安全柜的无菌条件下进行。

1. 将收到的抗凝外周血样本转移到适当的 15 mL 或 50 mL 试管中进行离心。
2. 在室温下以 200 × g 离心血样 15 分钟（加速：4 减速：2，最大为 5 时），以获得顶部富含血小板的血浆 （PRP） 和细胞组分，包括下面的红细胞和白细胞。参见 图 1.
3. 将上级部分 （PRP） 转移到 15 mL 试管中（如果要储存血浆），并以 600 × g 离心 10 分钟（最大加速和减速）以获得不含血小板的最终血浆部分。将血浆储存在 -20 °C。
4. 使用在室温下预热的无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 稀释从第一次离心中获得的细胞级分，2x（最小）至 3x（最大）。轻轻匀浆，并将稀释的级分用于 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心。
5. 将 15 mL Ficoll-Hypaque 转移到无菌的 50 mL 试管中。然后，小心缓慢地在 Ficoll 顶部加入 30 mL 稀释的血液，避免混合各相。如果使用 10 mL 或更少的稀释血液，则将 4 mL Ficoll-Hypaque 转移到 15 mL 试管中，然后加入 10 mL 稀释的血液样品><。 注意：此步骤对于获得单核级分至关重要。
6. 将含有 Ficoll 加稀释血液的试管以 600 × g 离心 25 分钟（加速度：1;减速度：0） 在室温下。
7. 用无菌的 3 mL 巴斯德吸管去除一些黄色顶层。然后，用无菌巴斯德移液管小心收集在黄色顶层和 Ficoll 层之间形成的界面（单核"环"级分）。这个"环"包含感兴趣的单核细胞 （PBMC><）。 注意：可以收集一些剩余的血浆期，但一定要避免使用 Ficoll 期，因为它可能对 PBMC 有毒。
8. 将收集的 PBMC 转移到含有至少 3 mL 无菌 1x PBS 的新 15 mL 试管中。然后，加入相应体积的无菌 1x PBS 至 12-15 mL。将 PBMC 以 600 × g（最大加速和减速）离心 10 分钟。
9. 弃去上清液并再次洗涤 PBMC。通过添加 1 mL 无菌 1x PBS 重悬细胞沉淀，然后加入额外的无菌 1x PBS 至 12-14 mL。以 600 × g （最大加速和减速） 离心管 10 分钟。
10. 弃去上清液，将 PBMC 沉淀重悬于含有 2% 灭活胎牛血清（1x PBS-2% FBS）的无菌 1x PBS 中，并使体积达到 10 mL。使用自动细胞计数器或对细胞进行计数，制备用无菌冷 1x PBS 稀释的 1：5 细胞悬液，然后用台盼蓝 （1：2） 稀释，以获得 1：10 的最终稀释度。使用光学显微镜进行计数。
11. 在 8-10 °C 下以 300 × g 离心 PBMC 悬浮液 5 分钟。将细胞重悬于所需体积的无菌冷 1x PBS-2% FBS 中，以获得 10⁸ 个细胞/mL 的最终浓度。将这些细胞保持在 4 °C 直到下一步><。 注：如果收集的 PBMC 不会在同一天使用，建议在适当的冷冻培养基（90% 的 FBS 含有 10% 的二甲基亚砜，DMSO）中以 10⁸ 个细胞/mL 的低温冻存管冷冻。在 -80 °C 下在聚乙二醇容器中储存过夜，以使细胞缓慢冻结，从而最大限度地减少细胞损伤。第二天，将细胞转移到储存盒中，并在-80°C下放置几天或转移到液氮罐中长时间储存。

2. 使用磁珠的 CD14⁺ 单核细胞分选

注意：在健康供体的 PBMC 中发现的 CD14 单核细胞的数量因年龄和性别而异。如果可用，使用细胞计数仪获得每个样品中单核细胞的百分比，然后计算分选所需 CD14 单核细胞所需的 PBMC 数量。如果没有可用的细胞计数器，则可以认为每个 PBMC 样品中 10% 的单核细胞是一种广泛的方法^{4，6，7，10，11，12，13}。

使用人 CD14 阳性选择试剂盒分离

CD14 ⁺ 单核细胞⁵。我们已经标准化了分离方案，在 100 μL 反应中使用 1 至 2 × 10⁷ 个 PBMC;对于较高的数字，请使用此比率。建议的最小反应体积为 100 μL，即使细胞数量低于 1 × 10⁷ 个 PBMC。

1. 在含有 1 mM 乙二胺四乙酸（1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA）缓冲液的 1x PBS-2% FBS 中制备浓度为 1-2 ×^{10 8} 个细胞/mL 的 PBMC 细胞悬液，并将所需量的 PBMC 转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。
2. 每 100 μL 细胞悬液中加入 10 μL 阳性选择混合物，充分混合，并在室温下孵育 15 分钟。
3. 每 100 μL 细胞悬液加入 10 μL 磁性纳米颗粒，用力上下移液 5 次以上以均匀悬浮磁性纳米颗粒，并在室温下孵育 10 分钟
   注意：不建议涡旋。
4. 加入 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA 缓冲液，使细胞悬液的总体积达到 2.5 mL。轻轻地上下移液管中的细胞 2-3 次。将试管插入磁铁分选器中，并将其分开 5 分钟。
5. 取磁铁，以一个连续的运动将其和试管倒置，丢弃上清液部分。磁性标记的细胞将留在试管内。将磁铁和管子倒置 2-3 秒，然后将它们垂直直立。
   注意：将任何悬挂的滴剂从管口留下;不要摇晃或吸干它们。
6. 从磁铁上取下试管，然后再次向试管中加入 2.5 mL 的 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA 缓冲液。轻轻地上下移液细胞悬液 2-3 次以混合。将管子插回磁铁中，并将其分开 5 分钟。
7. 在一个连续的运动中，颠倒磁力架和试管，丢弃上清液组分。从磁铁上取下试管，并将细胞重悬于适量的 1x PBS-2% FBS 缓冲液（不含 EDTA）中。肯定选择的单元格现在可以使用了。
   注：磁力架总共需要两次 5 分钟的分离。
8. 使用 1x PBS-2% FBS 缓冲液洗涤分选的 CD14 细胞，使细胞悬液达到 12-14 mL 以稀释任何剩余的 EDTA，然后以 600 × g（最大加速和减速）离心 10 分钟。
9. 弃去上清液并重复洗涤，首先用 1 mL 的 1x PBS-2% FBS 缓冲液重悬细胞沉淀，然后将体积加满至 12-14 mL。以 600 × g （最大加速和减速） 离心管 10 分钟。
10. 弃去上清液，将阳性选定的 CD14 单核细胞重悬于 2 mL 1x PBS-2% FBS 缓冲液中。使用自动细胞计数器或通过在无菌冷 1x PBS 中稀释细胞悬液 （1：5），然后使用光学显微镜在台盼蓝中 （1：2） 来计数细胞。将细胞置于冰上直至培养制备。
    注：细胞纯度可通过流式细胞术检测，取 50 μL 细胞悬液，对 CD14⁺ 细胞（克隆 HCD14）进行染色。建议纯度超过 90%。
11. 对于培养，在 8-10 °C 下以 300 × g 离心细胞悬液 5 分钟。使用补充有 10% 灭活 FBS 和 1% 青霉素-链霉素 （RPMI-10% FBS-1% P/S） 的 RPMI 1640 以 10⁶ 个细胞/mL 的浓度重悬沉淀><。 注意：使用高质量、低内毒素、热灭活的 FBS 至关重要。始终保持在冰上，以避免单核细胞在电镀前粘附在塑料壁上。

3. 单核细胞衍生的巨噬细胞 （M-DM） 分化和极化

注意：通过将 2.5 ×^{10 5} 个 CD14 ⁺ 单核细胞接种在含有 500 μL RPMI-10% FBS-1% P/S 的 48 孔板中进行 M-DM 培养，并在 37 °C 的加湿培养箱中培养 CO₂ （5%） 培养 7 天。选择经过处理的板以增强单核细胞对板的粘附。

1. 定义要运行的所有实验条件，包括基础 M-DM （M0）、炎性 M1、组织修复 M2a、调节 M2c 和所需测试条件的孔。
2. 移液 250 μL 步骤 2.11 中制备的细胞悬液，在每个孔中接种 2.5 ×^{10 5} 个 CD14 ⁺ 单核细胞。
3. 向每个孔中加入 250 μL RPMI-10% FBS-1% P/S 和 50 ng/mL M-CSF，以完成 500 μL 的总体积。
4. 将细胞培养板在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育 4 天，以进行巨噬细胞分化的第一步><。 注：定期检查细胞培养物分化，以查看形态变化是否如预期发生，或者是否存在不需要的未贴壁细胞。
5. 在 M-DM 培养的第 4 天更换一半的培养基（250 μL RPMI-10% FBS-1% P/S）。添加用于极化条件的细胞因子或试剂并培养 3 天（终点为第 7 天）：M1 的 LPS （1 ng/mL） 加 IFNγ （50 ng/mL），M2a 的 IL-4 （40 ng/mL），M2c 的 IL-10 （50 ng/mL） 或地塞米松 （0.1 μM）。
6. 在第 7 天收获 M-DM 以进行表型表征，按照接下来两个步骤中的指示收集它们用于 mRNA 表达，或进行功能测定。

4. 通过流式细胞术对极化 M-DM 进行表面表型表征

1. 丢弃总培养基体积（500 μL 48 孔板）并加入 200 μL 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA 缓冲液用于细胞收获。在冰上孵育 20 分钟，然后加入 200 μL 1x PBS-2% FBS 稀释 EDTA 缓冲液。通过在 1.5 mL 微管中上下移液来收集 M-DM。用 1x PBS-2% FBS 洗涤这些收获的细胞一次，并以 800 × g 离心 3 分钟。
2. 用 200 μL 的 1x PBS-5% FBS 重悬 M-DM 沉淀，并将它们转移到 96 孔圆底微孔板中，在室温下封闭 15 分钟。将细胞以 800 × g 离心 3 分钟。
3. 在 1x PBS-2% FBS 中制备直接偶联抗体的适当组合。用 50 μL 抗体组合对每个孔或条件 （1x） 进行染色，并在 4 °C 下避光孵育 30 分钟><。 注：在这里，抗体组由 CD11b-APC/Cy7、CD64-APC、CD163-PerCP/Cy5.5、CD206-AlexaFluor 488、CD14-PECy7 和 MERTK-生物素加链霉亲和素-PE 组成。梯度抗体浓度列于表 1 中。
4. 通过加入 150 μL 的 1x PBS 洗涤染色的 M-DM，并以 800 × g 离心 3 分钟。
5. 为了测量细胞活力，加入 100 μL 可固定活力染料 Zombie Violet（1x PBS 中 1：1,000），并在 4 °C 下在黑暗中孵育 30 分钟。
6. 通过加入 100 μL 1x PBS 洗涤染色细胞，并以 800 × g 离心 3 分钟。使用 200 μL 1x PBS 重复洗涤程序。
7. 用 100 μL 固定剂试剂（来自固定剂/透化试剂盒）重悬 M-DM 沉淀，并在冰上和黑暗中孵育 20 分钟><来固定。 注：为了实现适当的固定，必须正确地匀浆细胞沉淀。
8. 通过添加 100 μL 的 1x PBS-2% FBS 洗涤 M-DM，并以 800 × g 离心 3 分钟。使用 200 μL 的 1x PBS-2% FBS 重复洗涤程序。
将
9. M-DM 沉淀重悬于 200 μL 的 1x PBS 中，并在流式细胞仪中运行染色的细胞。

5. 通过 qPCR 区分 M-DM 极化的基因程序谱

注意：在培养的第 7 天，使用 RNA 提取试剂可以收获 2.5 × 10^{个 5 个} M-DM，以分离高质量的总 RNA。也可以使用其他方法进行 RNA 分离，例如基于柱的 RNA 提取和洗脱试剂盒。

1. 直接添加 350 μL 提取试剂，丢弃总培养基体积和裂解的 M-DM。将此细胞悬液匀浆并转移到 1.5 mL 不含 RNase/DNase 的微管中，然后继续进行 RNA 分离><。 注：如果不在同一天进行 RNA 分离，则步骤 5.1 中的样品可在 4 °C 或 -20 °C 下储存长达一年。
2. 为了使核蛋白复合物完全解离，将步骤 5.1 中的匀浆样品在 25 °C 下孵育 5 分钟
3. 向每个样品中加入 70 μL 氯仿。盖紧每根试管以防止渗漏，并通过摇动试管彻底混合内容物。将样品孵育 2-3 分钟，然后将样品在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。此步骤将相完全分离为下层苯酚-氯仿相、间相和无色上层水相><。 注：氯仿的体积基于裂解步骤中使用的每 1 mL 提取试剂中 0.2 mL 氯仿的比率。
4. 将含有 RNA 的水相转移到新的 1.5 mL 不含 RNase/DNase 的微管中。
   注：取水相时留有少量，以避免转移任何界面层或有机层。
5. 向每个样品中加入 175 μL 异丙醇以沉淀 RNA。在 4 °C 下孵育 10 分钟，或在 -20 °C 下过夜><。 注：异丙醇的体积基于 0.5 mL 异丙醇/mL 初始提取试剂的比率。
6. 将样品在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。白色凝胶状总 RNA 沉淀将在试管底部沉淀。使用微量移液器小心取出并丢弃上清液。
将
7. 白色凝胶状沉淀重悬于 350 μL 75% 乙醇（每 1 mL 提取试剂 （v/v）中 1 mL，用于裂解）洗涤 RNA><。 注：RNA 可在 -20 °C 下在 75% 乙醇中储存长达 1 年，或在 4 °C 下储存长达 1 周。
8. 短暂涡旋重悬的沉淀，并在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。使用微量移液管去除并丢弃上清液。将 RNA 沉淀风干或真空 5-10 分钟
   注：要溶解 RNA，请避免 RNA 沉淀过度干燥。
9. 通过上下吹打，将沉淀重悬于 20-30 μL 不含 RNase 的水中。在 55-60 °C 的水浴或加热块中孵育 10-15 分钟。继续测量 RNA 浓度并将 RNA 储存在 -70 °C。
10. 使用 cDNA 合成试剂盒在 20 μL 反应体积中使用 100-500 ng RNA（分别为最小和最大）进行逆转录（cDNA 拷贝）。
11. 使用 1 μL cDNA （5-25 ng） 进行实时 PCR 反应。
    1. 使用 5 μL SYBR 绿色混合物 （2x）、0.2 μL 每种引物（正向和反向）和 3.6 μL 无核酸酶水为每管 （1x） 制备反应混合物。根据样品编号缩放所有组分。充分混合反应混合物，将 9 μL 分装到每个 qPCR 管中，最后分装 1 μL cDNA，以达到 10 μL 的最终总体积。
    2. 在实时PCR仪器上按如下方式对热循环方案进行编程：98°C下2-3分钟（1x）;98°C下5-15秒，60°C下15-30秒（35-40x）;最后包括熔解曲线分析（65-95°C），增量为0.5°C，步长为2-5秒/步，或使用仪器的默认设置><。 注：该反应采用通用 SYBR Green 混合物进行标准化。推荐用于 M-DM 极化分析的引物列于表 2 中。
12. 使用真核翻译延伸因子 1 alpha 1 （EEF1A1） 作为参考基因对结果进行归一化，并通过解离曲线分析检查扩增产物的特异性。
    注：解离曲线分析可以确认反应中仅存在一种 qPCR 扩增产物。

结果

基于我们多年来在巨噬细胞表征方面的工作，我们建立了一个准确的标记组合，可以清楚地区分体外 M-DM 的不同亚群。表型标记是根据文献和我们之前进行的广泛筛选来选择的^{9，14，15，16，17}。此外，我们确定 CD64、CD206、CD163、CD14 和 MERTK 可以帮助通过流式细胞术清楚地区分非极化 M-DM （M0）、极化 IFNγ/LPS 诱导的 M1、IL-4 诱导的 M2a 和 IL-10 或地塞米松诱导的 M2c^{4，5，7，11}<...

讨论

巨噬细胞的分化、激活和极化已成为免疫学、组织稳态、疾病发病机制和炎症消退的中心焦点。此外，组织巨噬细胞可能来源于体内平衡被破坏条件下循环单核细胞的新兴情况强调了以明确的表型、转录程序和激活途径为特征的精确 M-DM 模型的必要性。

为了成功实施该协议，必须在这里讨论该协议中的一些关键步骤。首先，应该注意的是，建立原代 M-DM 培养物的血液样本在年龄、性别、遗传背景或环境变量方面可能存在异质性，这可能会在某些生物学反应中产生相当大的差异。因此，从同一供体获得基础生物学和实验对照至关重要。建议进行配对分析。尽管如此，高变异也可以被认为是一个优势，因为响应谱更好地反映了生物学意义。单细胞悬液在分选前应具有超过 70% 的活细胞群。同样，CD14单核细胞的分选后纯度应为90%。M-DM 培养的另一个关键方面是初始细胞密度。低密度不允许适当的细胞合作和巨噬细胞分化，高密度会增加细胞死亡。尽管细胞相互作用对巨噬细胞重编程的影响尚未得到广泛探索，但一些开创性研究表明，将人单核细胞与调节性 T 细胞共培养会使平衡偏向 M2 巨噬细胞的分化¹⁸。同样...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 小鼠抗人 CD206 抗体克隆 15-2	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	Cat# 321113;RRID： AB_571874
APC 小鼠抗人 CD64 抗体克隆 10.1	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	Cat# 305013;RRID： AB_1595539
APC/Cy7 大鼠抗小鼠/人 CD11b 抗体克隆 M1/70	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	Cat# 101226;RRID：AB_830642
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞	Cat# 554714	固定剂/透化试剂盒
生物素抗人 MERTK 抗体克隆 590H11G1E3	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	Cat# 367616;RRID：AB_2721500
CFX-Connect 设备	Bio-Rad，美国
EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒;EasySep Positive Selection 鸡尾酒;EasySep 磁性纳米颗粒;Easy Sep Magnet	STEMCELL Technologies， Vancouver， Canada	Cat# 18058
FACS Canto 流式细胞仪	Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖。
胎牛血清，合格，新西兰	Gibco™ Thermo Fisher Scientific 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS Cytiva	GE Healthcare - 美国生命科学	Cat# 17144003
FlowJo	FlowJo LLC。	RRID：SCR_008520
GraphPad Prism （英文版）	GraphPad 软件公司	RRID：SCR_002798
iScript cDNA 合成试剂盒，包括 5x 逆转录反应混合物、iScript 逆转录酶、无核酸酶水	Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	Cat# 1708891
Partec CyFlow 空间细胞仪	Sysmex Partec，德国
PE 链霉亲和素	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	货号# 405203
PE/Cy7 小鼠抗人 CD14 抗体克隆 HCD14	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	猫# 325618;RRID： AB_830691
PerCP/Cy5.5 小鼠抗人 CD163 抗体克隆 GHI/61	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	猫# 333607;RRID：AB_1134006
RPMI 1640 培养基	Gibco™ Thermo Fisher Scientific 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	货号# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green 超混合液，它包含抗体介导的热启动 Sso7d fusión 聚合酶、dNTP、MgCl2、SYBR Green I 染料、增强剂、稳定剂和惰性参比染料（包括 ROX 和荧光素）的混合物。	Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯	Cat# 1725271
TriZol 试剂	Thermo Fisher Scientific 生命科学解决方案 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	货号#  15596026	RNA 提取试剂
Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。	Cat# 423113