方法文章

用于体外测定的人单核细胞衍生巨噬细胞的重编程模型

DOI：

10.3791/67651

⸱

2025年4月18日

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

本文内容

摘要

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单核细胞和巨噬细胞是具有很强可塑性和可重新编程的免疫细胞，对健康和疾病至关重要。它们通过采用特定的分化程序和表型来感知和响应广泛的刺激。我们已经标准化了一个体外模型来研究巨噬细胞极化和重编程，为研究提供了有价值的工具。

摘要

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单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞是多功能的，几乎存在于所有身体组织中。它们协调先天免疫和适应性免疫的启动和解决阶段，显着影响保护性免疫和免疫介导的病理损伤。虽然组织驻留巨噬细胞是维持稳态稳态的关键作用，但在损伤或炎症损伤后，大量单核细胞从外周血募集到组织中。单核细胞衍生的巨噬细胞 （M-DM） 可以分化为许多动态亚型，其表型和功能取决于当地的组织环境。

为了比较 M-DM 分化和极化过程中的不同刺激或环境条件，我们标准化了人非极化 M-DM M0 和一些主要细胞因子极化巨噬细胞、IFNγ/LPS 衍生的 M1、IL-4 衍生的 M2a 和 IL-10 或地塞米松衍生的 M2c 的体外模型，以通过流式细胞术和实时 PCR 分析 M-DM 的偏斜重编程。我们发现 CD64 、 CD206 、 CD163 、 CD14 和 MERTK 可以通过流式细胞术清楚地区分非极化 M0 和极化 M1 、 M2a 和 M2c。此外，我们将 IRF1 和 CXCL10 定义为经典 IFNγ/LPS 衍生的 M1-、IRF4-、CCL22-和 TGM2 特异性转录物的特异性基因，以及地塞米松衍生的 M2c 的 MERTK 基因。综上所述，我们的标准化 M-DM 方案可以给出主要的体外图谱，以分析人类 M-DM 在不同刺激下的分化和极化。

引言

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巨噬细胞，首先由 Metchnikoff 因其吞噬能力而发现，是后生动物生命的基础古老细胞。它们在成年哺乳动物中普遍存在，表现出显着的解剖和功能多样性。作为单核吞噬系统的一部分，巨噬细胞与树突状细胞和单核细胞一起，在各种生物过程中起着至关重要的作用，从发育和稳态到针对病原体的免疫反应1，2。常驻巨噬细胞专门用于其组织微环境，充当哨兵，监测组织健康并响应生理变化和外部威胁。它们有限的可塑性被认为是维持组织稳态的进化适应。相比之下，募集的单核细胞更灵活，可以在炎症期间分化成不同的巨噬细胞表型。炎症和组织生态位的这种双重影响塑造了巨噬细胞的功能多样性3。因此，根据当地的组织环境，单核细胞衍生的巨噬细胞 （M-DM） 可以分化为许多亚型。局部代谢物、生长因子、细胞因子和细胞间相互作用4，5，6 概述了它们的表型和功能。此外，巨噬细胞是抑制炎症并驱动血运重建和组织修复的因子的关键生产者7，8。

鉴于至少三个主要的军备控制极....

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方案

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所有健康的志愿献血者都提供了书面知情同意书，该研究得到了阿根廷国家医学院机构伦理委员会 （IMEX-CONICET-ANM） 的批准。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅材料表。

1. 外周血单核细胞 （PBMC） 分离

注：PBMC 是从 40 mL 抗凝外周血中分离的，柠檬酸钠为 3.8%，并使用 Ficoll-Hypaque 密度梯度 （1077） 离心。该方案在 BSL2 生物安全柜的无菌条件下进行。

  1. 将收到的抗凝外周血样本转移到适当的 15 mL 或 50 mL 试管中进行离心。
  2. 在室温下以 200 × g 离心血样 15 分钟（加速：4 减速：2，最大为 5 时），以获得顶部富含血小板的血浆 （PRP） 和细胞组分，包括下面的红细胞和白细胞。参见 图 1.
  3. 将上级部分 （PRP） 转移到 15 mL 试管中（如果要储存血浆），并以 600 × g 离心 10 分钟（最大加速和减速）以获得不含血小板的最终血浆部分。将血浆储存在 -20 °C。
  4. 使用在室温下预热的无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 稀释从第一次离心中获得的细胞级分，2x（最小）至....

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结果

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基于我们多年来在巨噬细胞表征方面的工作，我们建立了一个准确的标记组合，可以清楚地区分体外 M-DM 的不同亚群。表型标记是根据文献和我们之前进行的广泛筛选来选择的9，14，15，16，17。此外，我们确定 CD64、CD206、CD163、CD14 和 MERTK 可以帮助通过流式细胞术清楚地区分非极化 M-DM （M0）、极化 IFNγ/LPS 诱导的 M1、IL-4 诱导的 M2a 和 IL-10 或地塞米松诱导的 M2c4，5，7，11<.......

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讨论

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巨噬细胞的分化、激活和极化已成为免疫学、组织稳态、疾病发病机制和炎症消退的中心焦点。此外，组织巨噬细胞可能来源于体内平衡被破坏条件下循环单核细胞的新兴情况强调了以明确的表型、转录程序和激活途径为特征的精确 M-DM 模型的必要性。

为了成功实施该协议，必须在这里讨论该协议中的一些关键步骤。首先，应该注意的是，建立原代 M-DM 培养物的血液样本在年龄、性别、遗传背景或环境变量方面可能存在异质性，这可能会在某些生物学反应中产生相当大的差异。因此，从同一供体获得基础生物学和实验对照至关重要。建议进行配对分析。尽管如此，高变异也可以被认为是一个优势，因为响应谱更好地反映了生物学意义。单细胞悬液在分选前应具有超过 70% 的活细胞群。同样，CD14单核细胞的分选后纯度应为90%。M-DM 培养的另一个关键方面是初始细胞密度。低密度不允许适当的细胞合作和巨噬细胞分化，高密度会增加细胞死亡。尽管细胞相互作用对巨噬细胞重编程的影响尚未得到广泛探索，但一些开创性研究表明，将人单核细胞与调节性 T 细胞共培养会使平衡偏向 M2 巨噬细胞的分化18。同样.......

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披露

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作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

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这项工作得到了国家科学技术促进局 （ANPCyT-FONCYT） 的支持，通过赠款 PICT 2018-3070 和 2021-I-A-00807 给 E.A.C.S. 和 PICT 2021-I-A-00716 给 AEE，以及国家科学技术研究委员会 （CONICET） 通过赠款 PIP 2022-0763 和布宜诺斯艾利斯大学通过 Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social （PIDAE） 2022 到A.E.E. 和 A.E.E. 是 CONICET 的职业调查员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 小鼠抗人 CD206 抗体克隆 15-2BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。Cat# 321113;RRID： AB_571874
APC 小鼠抗人 CD64 抗体克隆 10.1BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。Cat# 305013;RRID： AB_1595539
APC/Cy7 大鼠抗小鼠/人 CD11b 抗体克隆 M1/70BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。Cat# 101226;RRID：AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞Cat# 554714固定剂/透化试剂盒
生物素抗人 MERTK 抗体克隆 590H11G1E3BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。Cat# 367616;RRID：AB_2721500 
CFX-Connect 设备 Bio-Rad，美国
EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒;EasySep Positive Selection 鸡尾酒;EasySep 磁性纳米颗粒;Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies， Vancouver， CanadaCat# 18058
FACS Canto 流式细胞仪 Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林湖。
胎牛血清，合格，新西兰 Gibco™ Thermo Fisher Scientific
美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - 美国生命科学Cat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC。RRID：SCR_008520
GraphPad Prism （英文版） GraphPad 软件公司RRID：SCR_002798
iScript cDNA 合成试剂盒，包括 5x 逆转录反应混合物、iScript 逆转录酶、无核酸酶水Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Cat# 1708891
Partec CyFlow 空间细胞仪 Sysmex Partec，德国
PE 链霉亲和素BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。货号# 405203
PE/Cy7 小鼠抗人 CD14 抗体克隆 HCD14BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。猫# 325618;RRID： AB_830691
PerCP/Cy5.5 小鼠抗人 CD163 抗体克隆 GHI/61BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。猫# 333607;RRID：AB_1134006
RPMI 1640 培养基Gibco™ Thermo Fisher Scientific
美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 		货号# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green 超混合液，它包含抗体介导的热启动 Sso7d fusión 聚合酶、dNTP、MgCl2、SYBR Green I 染料、增强剂、稳定剂和惰性参比染料（包括 ROX 和荧光素）的混合物。Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Cat# 1725271
TriZol 试剂Thermo Fisher Scientific
生命科学解决方案
美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 		货号#  15596026RNA 提取试剂
Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥。Cat# 423113
加利福尼亚州赫拉克勒斯

参考文献

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  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  3. Guilliams, M., Svedberg, F. R.

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