单核细胞和巨噬细胞是具有高度可塑性和可重编程性的免疫细胞，在健康与疾病中发挥关键作用。它们通过启动特定的分化程序和表型，感知并响应多种多样的刺激。我们已建立了一种标准化的 体外 研究巨噬细胞极化与重编程的模型，为科研提供了有价值的工具。
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摘要
摘要
单核-巨噬细胞谱系的细胞具有多种功能，几乎存在于所有身体组织中。它们协调先天免疫和适应性免疫的启动与消退阶段，在保护性免疫以及免疫介导的病理损伤中发挥重要作用。组织驻留型巨噬细胞在稳态条件下维持内环境稳定方面起关键作用，而在组织损伤或炎症刺激后，大量单核细胞会从外周血被募集至组织中。单核细胞来源的巨噬细胞（M-DM）可分化为多种动态亚型，其表型和功能取决于局部组织微环境。
为了比较M-DM分化和极化过程中不同的刺激因素或环境条件，我们建立了一种标准化方法 体外 人源非极化M-DM M0及若干关键细胞因子极化巨噬细胞模型，包括由IFNγ/LPS诱导的M1、IL-4诱导的M2a、以及IL-10或地塞米松诱导的M2c，用于通过流式细胞术和实时PCR分析M-DM的极化重编程。我们发现，CD64、CD206、CD163、CD14和MERTK可有效区分非极化M0与极化后的M1、M2a和M2c亚型。此外，我们定义了 IRF1 和 CXCL10 如经典IFNγ/LPS来源的M1型特定基因， IRF4-、CCL22- 和 TGM2特异性转录本，用于IL-4诱导的M2a型 MERTK 地塞米松诱导的 M2c 基因。综上所述，我们标准化的 M-DM 方案能够提供关键的 体外 利用该图谱分析不同刺激条件下人源M-DM的分化与极化。
引言
巨噬细胞最早由Metchnikoff根据其吞噬能力发现，是后生动物生命中具有古老起源的细胞。在成年哺乳动物体内广泛存在，巨噬细胞表现出显著的解剖学和功能多样性。作为单核吞噬细胞系统的一部分，与树突状细胞和单核细胞共同作用，巨噬细胞在多种生物学过程中发挥关键作用，从发育和稳态维持到针对病原体的免疫应答1,2。定居型巨噬细胞适应其特定组织微环境，作为哨兵细胞，持续监测组织健康状况，并对生理变化和外界威胁作出响应。其有限的可塑性被认为是一种进化适应机制，用以维持组织稳态。相比之下，募集而来的单核细胞更具可塑性，可在炎症过程中分化为多种表型的巨噬细胞。炎症信号与组织微环境的双重影响共同塑造了巨噬细胞的功能多样性3。因此，依据局部组织微环境的不同，单核细胞来源的巨噬细胞（M-DM）可分化为多种亚型。局部代谢物、生长因子、细胞因子以及细胞间相互作用4,5,6决定了它们的表型与功能。此外，巨噬细胞也是抑制炎症、促进血管再生和组织修复相关因子的关键生产者7,8。
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方案
所有健康志愿者献血者均签署了书面知情同意书，本研究已获得阿根廷国家医学科学院（IMEX-CONICET-ANM）机构伦理委员会批准。有关本实验方案中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
注意：PBMCs 从 40 mL 用 3.8% 枸橼酸钠抗凝的外周血中分离，采用 Ficoll-Hypaque 密度梯度（1077）离心法。本方案需在 BSL2 生物安全柜中的无菌条件下进行。
- 将收到的抗凝外周血样本转移至适当的15 mL或50 mL离心管中，用于离心。
- 在室温下以200 × g 离心15分钟（加速度：4，减速度：2，最大值为5），获得上层富含血小板的血浆（PRP）以及下层包含红细胞和白细胞的细胞组分。见图1。
- 将上层组分（PRP）转移至15 mL离心管中（若需保存血浆），然后以600 × g 离心10分钟（最大加速度和减速度），获得最终无血小板的血浆组分。将血浆储存在-20 °C。
- 用室温预热的无菌1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）将第一次离心所得的细胞组分稀释2倍（最小）至3倍（最大）。轻轻混匀后，用于Ficoll-Hypa....
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结果
基于我们多年来在巨噬细胞表征方面的研究工作，我们已确定了一组精确的标志物组合，可清晰区分不同亚群 体外 M-DM。表型标志物的选择基于文献以及我们先前进行的大范围筛选结果。9,14,15,16,17此外，我们确定通过流式细胞术检测CD64、CD206、CD163、CD14和MERTK的表达，可有效区分未极化的M-DM（M0）、经IFNγ/LPS诱导极化的M1型、IL-4诱导的M2a型以及IL-10或地塞米松诱导的M2c型。4,5,7,11
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讨论
巨噬细胞的分化、活化与极化已成为免疫学、组织稳态、疾病发病机制及炎症消退研究的核心焦点。此外，近年来的研究表明，在稳态失衡条件下，组织巨噬细胞可能来源于循环单核细胞，这进一步凸显了建立精确M-DM模型的必要性，该模型应具有明确的表型、转录程序和活化通路。
为了成功实施本方案，有必要在此讨论一些关键步骤。首先，应注意到，用于建立原代M-DM培养的血液样本在年龄、性别、遗传背景或环境因素方面可能存在异质性，这可能导致某些生物学反应出现显著差异。因此，从同一供体获取基础生物学和实验对照至关重要，建议采用配对分析方法。尽管如此，这种高变异性也可被视为一种优势，因为其反应谱更能反映生物学意义。在分选前，单细胞悬液中活细胞比例应超过70%。同样，分选后CD14+单核细胞的纯度应达到90%。M-DM培养的另一个关键因素是初始细胞密度。密度过低不利于细胞间的适当相互作用及巨噬细胞的分化，而密度过高则会增加细胞死亡。尽管细胞相互作用在巨噬细胞重编程中的影响尚未被充分研究，但一些先驱性研究表明，将人单核细胞与调节性T细胞共培养可促使巨噬细胞向M2表型分化18
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作得到了国家科学技术促进局（ANPCyT-FONCYT）的资助，项目编号分别为 PICT 2018-3070、2021-I-A-00807（授予 E.A.C.S.）和 PICT 2021-I-A-00716（授予 A.E.E.），同时得到国家科学技术研究委员会（CONICET）PIP 2022-0763 项目以及布宜诺斯艾利斯大学“社会影响力战略性研究与发展项目”（PIDAE）2022 年度项目（授予 A.E.E.）的支持。E.A.C.S. 和 A.E.E. 为 CONICET 的职业研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 小鼠抗人 CD206 抗体，克隆号 15-2 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 321113；RRID:AB_571874 | |
| APC 标记鼠抗人 CD64 抗体，克隆株 10.1 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 305013；RRID:AB_1595539 | |
| APC/Cy7 标记的抗小鼠/人 CD11b 大鼠单克隆抗体，克隆号 M1/70 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 101226；RRID:AB_830642 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞 | 货号 554714 | 固定/透化试剂盒 |
| 生物素标记抗人 MERTK 抗体，克隆号 590H11G1E3 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 367616；RRID:AB_2721500 | |
| CFX-Connect 设备 | Bio-Rad，Hercules，CA，美国 | ||
| EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒；EasySep 阳性选择混合液；EasySep 磁性纳米颗粒；Easy Sep 磁铁 | STEMCELL Technologies，加拿大温哥华 | 货号 18058 | |
| FACS Canto 流式细胞仪 | 美国新泽西州富兰克林湖，贝克顿-迪金森公司 | ||
| 胎牛血清，经鉴定，新西兰来源 | Gibco™ 赛默飞世尔科技 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号 10091148 | |
| Ficoll-Paque PLUS Cytiva | GE Healthcare - Life Sciences，美国 | 货号 17144003 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | RRID:SCR_008520 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc. | RRID:SCR_002798 | |
| iScript cDNA合成试剂盒，包含5倍反转录反应混合液、iScript反转录酶、无核酸酶水 | Bio-Rad，Hercules，CA，美国 | 货号 1708891 | |
| Partec CyFlow space 流式细胞仪 | Sysmex Partec，德国 | ||
| PE 链霉亲和素 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 405203 | |
| PE/Cy7 鼠抗人 CD14 抗体，克隆株 HCD14 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 325618；RRID:AB_830691 | |
| PerCP/Cy5.5 标记的小鼠抗人 CD163 抗体，克隆号 GHI/61 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 333607；RRID:AB_1134006 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco™ 赛默飞世尔科技 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 货号 11875119 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix，含有抗体介导的热启动Sso7d融合酶ón 聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I 染料、增强剂、稳定剂以及被动参比染料（包括 ROX 和荧光素）的混合物。 | Bio-Rad，Hercules，CA，美国 | 货号 1725271 | |
| TriZol 试剂 | 赛默飞世尔科技 生命科学解决方案 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | 货号# 15596026 | RNA提取试剂 |
| Zombie Violet 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 货号 423113 |
参考文献
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
- Guilliams, M., Svedberg, F. R.
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重印与许可
