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一种高效的单人操作实验室小鼠乳汁采集技术

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DOI：

10.3791/67669

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2025年3月28日

 , 
1Department of Nutritional Sciences, Rutgers -The State University of New Jersey, 2Rutgers Center for Lipid Research, Rutgers -The State University of New Jersey

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于采集实验小鼠乳汁的装置的组装方法。该装置成本低廉、便于携带，由经过培训的人员操作可采集0.1–0.5 mL乳汁。文中还包含详细的挤奶操作流程。 

摘要

自20世纪初以来，啮齿类动物模型已广泛应用于生物学研究，以探索基础生理学和生物化学机制。在哺乳及新生儿发育研究中，常需采集乳汁以分析其成分，并确定实验干预如何影响乳汁，从而影响新生儿的发育。从小型啮齿类动物中采集足量的生物液体可能较为困难。已有若干研究报道了从小鼠获取乳汁的不同技术。然而，这些技术通常至少需要两名经过培训的人员操作，在某些情况下可能难以实现。 

本文展示了一种改进的乳汁采样技术，该方法基于2009年发表的一种技术。通过这种经济且易于组装的方法，一名经过培训的人员可在10分钟内，从处于麻醉状态的母体中常规采集0.1–0.5 mL的乳汁。利用该方法，我们在分娩后第2天（PD2）和分娩后第10天（PD10）成功采集了足量的乳汁样本。我们测定了乳汁中的宏量营养成分，并将其与现有文献数据进行比较，以验证本采集方法的可靠性。 

我们记录到，在产后第2天（PD2），乳蛋白平均为70.1 ± 5.2 g/L，乳脂为174.4 ± 7.1 g/L，乳糖为12.3 ± 0.6 g/L。在产后第10天（PD10），尽管乳糖和乳蛋白浓度与PD2时相近，但乳脂显著升高（224.4 ± 17.1 g/L）。我们还观察到，单个乳蛋白的相对丰度在PD2和PD10之间存在差异。具体而言，与PD2相比，PD10时αS1-酪蛋白和乳清酸性蛋白含量较高，而β-酪蛋白含量较低。总体而言，我们展示了一种高效的单人操作小鼠乳汁采样技术，该方法使用常见实验室设备即可轻松组装所需装置。

引言

比较医学是指人类与其他动物在解剖学和生理学上具有相似性；因此，从一个物种获得的信息可用于研究另一物种中类似的生理通路1,2. 自20世纪初以来th 一个世纪以来，啮齿类动物（尤其是小鼠和大鼠）因其在疾病模型构建中易于进行基因操作，而被广泛应用于生物医学研究1,2此外，它们体型相对较小，因此与其它非啮齿类哺乳动物模型相比，维持种群所需的资源更少2然而，它们体型较小也带来了一些挑战。某些操作在小鼠身上难以顺利实施。例如，动静脉差值法可在大鼠身上进行3,4,5，但在小鼠中可能具有挑战性，因为它们的血管较细小，容易破裂6,7从小鼠中可采集的组织量也有限。例如，在哺乳期小鼠中，内脏脂肪组织的体积显著减小8,9 在某些情况下，目标物质的含量甚至几乎降至无法检测的水平。此外，从小鼠采集的生物流体样本量也有限；采血量因技术不同而有所差异，但总体上均受到一定限制。7，限制了可进行的分析数量。

在哺乳与新生儿发育研究中，需要采集乳汁以评估其成分和泌乳量。在小鼠研究中，由于乳汁体积有限，通常需要将多只母鼠的乳汁混合，以获得足够的样本量10。已有若干研究报道了从单只小鼠采集足量分析用乳汁的技术11,12,13。然而，这些方法通常需要两名经过培训的人员11,12：一人固定动物并手动挤奶，另一人用移液器收集乳汁；或者需要使用实验室中不易获得的设备和工具。本文中，我们展示了一种对DePeters和Hovey所设计技术的改进方法14。本方法所用装置可利用实验室现有设备轻松组装，或从常规供应商处方便购买。使用该装置，单人通常可在10分钟内常规获取0.1–0.5 mL的小鼠乳汁，适用于大多数分析。我们在分娩后第2天（PD2，早期哺乳期）和分娩后第10天（PD10，泌乳高峰期）采集乳汁，并测定乳汁中的宏量营养素，以验证该方法的有效性。

方案

所有动物护理和实验程序均遵循联邦指南，并获得罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。雌性小鼠（C57BL/6 背景）在 8 周龄时进行交配。它们被饲喂标准繁殖饲料。 随意摄取 并在标准的12小时光照:12小时黑暗循环条件下饲养。分娩当天记为产后第1天（PD1）。在PD2（初乳期）和PD10（泌乳高峰期）按照下述方法采集乳汁样本。

1. 挤奶装置的组装

  1. 将内径为 5/32'' 的聚氯乙烯（PVC）管一端连接至真空泵，并用胶带固定连接处（如图 1A中标记为a处）。
    注意：真空泵可用实验室中任何合适的泵或中央真空系统（有时称为“房屋真空”）替代。
  2. 通过带倒刺的直通接头，将内径为 5/32'' 的 PVC 管另一端与内径为 1/8'' 的 PVC 管连接。
  3. 通过接头，将内径为 1/8'' 的 PVC 管另一端连接至一支 18G 注射针头（如图 1A中标记为b处）。
  4. 将 P200 移液器吸头末端剪去约 0.2 cm，以形成更大的开口。将 P200 移液器吸头从隔膜塞的开口处插入，使吸头朝上（如图 1B所示）。
    注意：在不同动物之间应更换移液器吸头。
  5. 将隔膜塞安装到无菌收集管上。用 18G 注射针头在隔膜塞上刺穿一个孔。
  6. 开启真空泵，并用戴有实验室手套的手指抵住移液器吸头的开口，以检查吸力大小。
    注意：若组装正确，应能感受到轻柔的吸力。收集管、18G 注射针头和 P200 移液器吸头均应保持无菌。

乳汁提取过程；真空泵示意图；小鼠实验；试管中的样品收集。
图1：挤奶装置。（A）挤奶装置，其中真空泵通过PVC管连接至一支18 G的皮下注射针头。针头穿过与微型离心收集管相连的隔膜塞。一个倒置的P-200移液器吸头插入隔膜塞的开口中，用于从乳头吸取乳汁。（B）挤奶装置的横截面示意图。（C）使用所述方法对一只母鼠进行挤奶。（D）从泌乳高峰期母鼠收集到的一份代表性乳汁样品（0.3 mL）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 将母鼠与幼崽分离

  1. 在挤奶当天，将母鼠与其幼崽分离，以使乳汁在乳腺中积聚。
  2. 将幼崽置于巢穴中保持温暖。
  3. 若在泌乳早期（如本研究中的产后第2天）采集乳汁，需分离2小时。
  4. 若在泌乳高峰期（如本研究中的产后第10天）采集乳汁，需分离30–45分钟。

3. 母体麻醉

  1. 当母鼠准备进行泌乳时，向腹腔一侧注射氯胺酮/赛拉嗪溶液（腹腔注射，i.p.）th 和 5th 一对乳头
    注意：麻醉剂溶液的给药剂量需根据母鼠体重计算（按照罗格斯大学IACUC方案，每公斤体重给予80–100 mg氯胺酮和5–12 mg赛拉嗪）。该剂量可使小鼠镇静45–60分钟，足以完成乳汁采集。
  2. 通过用力挤压动物足部（以不造成损伤为限）来确认麻醉效果，以检测动物对感觉和疼痛的反应。充分的麻醉表现为完全无任何类型的运动反应。
  3. 为母鼠眼部涂抹兽医眼科用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥。

4. 乳汁采集

  1. 将麻醉后的母鼠仰卧置于坚固的工作台面上。用无菌酒精消毒巾轻轻擦拭其乳腺区域，以在挤奶前清洁该区域。
  2. 在第4次给药期间，腹腔注射1–2单位的催产素th 和 5th 腹腔未注射一侧的乳头对
    注意：催产素是一种小分子，可被快速吸收且半衰期较短 14,15注射后应在一分钟内开始采乳。
  3. 用非惯用手轻轻抓住母鼠颈部的皮肤以固定。
  4. 通过从乳头基部向尖端挤压乳腺组织，手动挤出乳汁，直至可见乳滴。
  5. 打开电源按钮以启动真空装置。
  6. 通过将倒置的P200移液器吸头轻轻接触乳头开始挤奶。使用轻柔的牵拉动作帮助乳汁排出。图1C).
  7. 重复步骤 4.4–4.6，直至采集到足够体积的乳汁。
    注意：挤奶过程中，乳汁可能意外吸入18 G皮下注射针头或真空管路的PVC管中。可在挤下一只动物前更换针头或PVC管以轻松解决此问题。

5. 乳汁采集后母鼠的恢复

  1. 将麻醉后的母鼠放回与其幼崽同笼，并保持温暖。持续监测动物，直至其恢复意识。
    注意：若让母鼠在单独的笼子中自行苏醒后再放回幼崽身边，母鼠可能拒绝再次哺乳。这种情况在哺乳早期（PD2）进行乳汁采集时更为常见。
  2. 当母鼠开始苏醒时，允许其暂时离开幼崽以完成恢复过程；此为正常行为。
    注意：我们观察到母鼠会周期性地返回幼崽身边，并在数小时后完全恢复哺乳行为。

6. 牛奶分析

  1. 使用商用乳糖检测试剂盒（参见材料表）测定乳汁中的乳糖含量。用无菌水将乳汁稀释75倍，然后按照试剂盒说明书进行检测。
  2. 采用其他文献中所述的奶油离心法（creamatocrit method）测定乳汁脂肪含量16,17。
  3. 使用牛血清白蛋白作为标准品，通过Bradford蛋白测定法18估算乳汁蛋白含量19。检测前，在4 °C条件下以4,000 × g离心15分钟。用移液器吸取下层液体（infranatant），用无菌水稀释10倍后进行检测。
  4. 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；按照制造商说明，将10 µg蛋白质在预制的4%–12% Bis-Tris凝胶中分离。将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并用考马斯亮蓝R-250（Coomassie Blue R-250）染色。

结果

利用该技术，我们成功地在21天哺乳期内的不同时间点采集了足够的乳汁样本。我们将分娩当天记为产后第1天（PD1），在本研究中分别于PD2（早期哺乳期）和PD10（泌乳高峰期）采集乳汁样本，每组n = 4。每只母鼠均可轻松采集到0.1–0.5 mL乳汁（图1D）。为验证该方法的可行性，我们测定了这些乳汁样本的总宏量营养素组成，并采用Student's t-检验比较早期哺乳期与泌乳高峰期所采集乳汁成分的差异。

我们发现 乳糖 浓度在PD2时平均为12.3 ± 0.6 g/L，在PD10时为12.0 ± 0.9 g/L（表1). 乳脂 百分比在PD2和PD10时分别为26.0 ± 1.0%和33.4 ± 2.5%。脂肪浓度在PD2时为174.4 ± 7.1 g/L，在PD10时显著升高，达到224.4 ± 17.1 g/L（表1）。平均 蛋白 PD2 时含量为 70.1 ± 5.2 g/L，PD10 时为 75.1 ± 2.6 g/L（表1）。尽管PD2和PD10的总乳蛋白含量无显著差异，但各乳蛋白的相对丰度存在差异。具体而言，αS1-酪蛋白和乳清酸性蛋白在PD10乳汁中的相对丰度高于PD2乳汁（p < 0.05），而β-酪蛋白（β-casein）p < 0.05）在PD2中的丰度高于PD10（图2).

SDS-PAGE 和条形图分析蛋白质表达模式；PD2 与 PD10 样品；相对丰度。
图 2：乳汁蛋白质分析。 （A）对分娩后第 2 天（PD2）和第 10 天（PD10）收集的乳汁进行考马斯亮蓝染色的 PAGE 分析。蛋白质鉴定方法如前所述14。 （B）使用 ImageJ 分析各蛋白质条带信号，并以总蛋白染色量为基准进行归一化。结果以平均值±标准误差表示，单个数据点以圆点标出。采用双尾 Student’s t-检验比较 PD2 与 PD10 各蛋白质的平均丰度。*p < 0.05，n = 4。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳；PDn = 分娩后第 n 天。 请点击此处查看该图的放大版本。

平均值标准误p值
乳糖
(g/L)		PD212.30.60.75
PD1012.00.9
脂肪
(g/L)		PD2174.47.10.04
PD10224.417.1
蛋白质
(g/L)		PD270.15.20.42
PD1075.12.6

表1：产后第2天（PD2）和产后第10天（PD10）采集乳汁的主要营养成分组成。 结果以平均值±平均值的标准误（SEM）表示，采用双尾Student t检验分析哺乳天数对乳汁成分的影响，n = 4。

讨论

我们展示了一种改良的挤奶技术，可由一人使用一种易于组装且便携的装置完成。传统上，啮齿类动物乳汁的采集使用毛细管10,17、玻璃巴斯德移液管12或微量移液器11。这些方法需要一人固定母鼠并手动挤奶，另一人负责收集乳汁。这在某些情况下可能具有挑战性，尤其是在周末或节假日期间进行乳汁采样时。通过这些方法采集的乳汁必须转移至无菌储存管中。由于啮齿类动物乳汁的脂肪含量相对较高（如本研究及其他研究20,21所示），因而较为黏稠，转移乳汁的过程可能导致乳汁体积损失，从而限制后续分析所需的样本量。本文所述装置可在5分钟内利用实验室常见工具完成组装，单人操作可在10分钟内采集到足够的乳汁量。该方法采用持续轻柔的负压抽吸，使乳汁直接持续进入收集管，避免了因转移操作导致的样本损失。在产后第2天（PD2）即开始采集乳汁时，尽量减少样本损失尤为重要，因为此阶段的乳汁产量已知相对较低10。此外，相同的装置和方案已成功用于另一小鼠品系（FVB/N背景）的乳汁采集，表明该方法在不同小鼠品系中可能均具有良好的适用性。

本研究中，我们还观察到分离时间可能因泌乳阶段的不同而有所差异。既往研究表明，为获得足够的乳汁量，应在采集乳汁前将母鼠与其幼崽分离至少 2 小时，最长可达 16 小时11,13。采用该方法时，我们发现，在泌乳早期（PD2）将母鼠与其幼崽分离 2 小时，而在泌乳高峰期（PD10）仅分离 30–45 分钟，即可获得足够的乳汁量。由于母鼠从麻醉中恢复还需额外时间，因此缩短分离时间不仅可减少采样所需总时长，还能降低对母鼠及其幼崽可能造成的不利影响。

此外，我们发现，在产后第2天（PD2）即采集乳汁可能会因母鼠长时间的分离与恢复，导致幼鼠后续生长受到不利影响，出现喂养不足的阶段。而在泌乳高峰期（PD10）采样时未观察到此现象。因此，若研究者希望在21天的泌乳期内于不同时间点采集乳汁，建议从另一组母鼠中采集早期泌乳乳汁。然而，在泌乳高峰期和后期，可在同一只母鼠身上多次进行乳汁采集，以开展纵向研究。

此外，研究人员可选择其他麻醉剂以缩短母体的恢复时间。例如，吸入异氟烷可能有助于缩短恢复时间，因为动物在停止吸入异氟烷后通常能迅速恢复22。尽管许多研究采用这种麻醉方式13,23，但有报道称吸入异氟烷可能对采集的乳汁量产生不利影响13。此外，异氟烷吸入需要配备适当的设备，以确保剂量的精确控制。目前关于氯胺酮/赛拉嗪和异氟烷等麻醉剂对泌乳、乳汁成分及其向乳汁中转移的潜在影响的研究仍较为有限24,25,26。因此，在比较使用不同麻醉方式的研究时，应谨慎进行数据分析和解释。另一种选择是不使用麻醉剂进行乳汁采样，如其他研究人员所述14,27,28,29。然而，该方法可能给母体带来过度应激，并需要额外人员协助固定动物。

本研究还表明，可使用乳汁样本进行宏量营养素检测，且仍有剩余样本可用于其他实验，如组学分析。测定了乳汁中乳糖、蛋白质和脂肪的水平，并与已发表的数据进行比较，以验证所述方法。乳汁中乳糖浓度约占乳汁成分的~1.2%，与此前其他研究中对照饮食小鼠的数据相似30,31,32。小鼠乳汁中脂肪含量较高，为26%至33%，与先前报道一致20,30。本研究报道的总蛋白浓度与Chen等30的报道相近，但低于其他研究的结果31,32。在从早期到泌乳高峰期的变化方面，我们发现乳糖和蛋白质水平相对稳定，但乳脂百分比从早期到泌乳高峰期有所上升。该结果与Ragueneau32的报道不一致，但差异可能源于样本量的不同。尽管早期和泌乳高峰期的总蛋白浓度相似，但我们发现个别蛋白质丰度（αS1-酪蛋白、β-酪蛋白和乳清酸性蛋白）存在变化，可能反映了新生仔鼠在不同发育阶段需求的改变。

尽管该技术无法直接定量乳汁产量，但可利用Falconer于1947年提出的性能指数（IOP）进行计算33。乳汁产量在很大程度上依赖于仔鼠数量和采样时间。该指数可用于衡量不同仔鼠数量条件下的乳汁产量。例如，可在产后第10天（PD10）称量整窝仔鼠的重量（此时将母鼠分离以采集乳汁）。母鼠的IOP通过将其仔鼠重量除以同窝仔数在PD10的平均仔鼠重量来计算。综上所述，我们展示了一种高效的单人操作技术，用于从实验小鼠采集乳汁，所用装置可由相对廉价且易于获取的设备简便组装而成。该技术能够稳定地收集到足量乳汁，适用于大多数分析检测。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 NJAES Hatch 项目 14190 和 NIH R21HD 108496 资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 冻存管Corning430658推荐用于早期乳汁采集
1 mL 注射器Exel26048
2 mL 微量离心采集管Fisher Scientific02-681-344推荐用于高峰期和晚期乳汁采集
18 G 注射针头BD PrecisionGlide305195
27 G 注射针头BD PrecisionGlide305109
酒精消毒片Honeywell154818
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad5000006
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
Immobilon-P PVDF 膜ImmobilonIPVH00010
氯胺酮Dechra1000001250通过兽医办公室购买 
实验室标签胶带VWR International89097
乳糖检测试剂盒Sigma-AldrichMAK487
微型带倒钩聚丙烯接头Cole-Parmer Instrument Company6365-90
小鼠饲料Lab Diet5015
NuPAGE Bis-Tris Mini 蛋白凝胶，4–12%InvitrogenNP0335BOX
Optixcare 眼部润滑膏AventixN/A通过兽医办公室购买 
催产素Bimeda1OXY015通过兽医办公室购买 
P200 移液器吸头GilsonF1733001
PVC 管：1/8'' 内径VWR InternationalMFLX07407-75 
PVC 管：5/32'' 内径VWR InternationalMFLX07407-77
隔垫塞Chemglass Life SciencesCG-3022-91
真空泵Drummond Scientific Co.P-103635
赛拉嗪Akorn Animal HealthNDC 59399-110-20通过兽医办公室购买 

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