迭代漂白扩展多重性（IBEX）技术与商用核苷酸标记试剂盒（Click-iT EdU）相结合，能够在固定的冷冻小鼠组织切片中检测并分类高度动态过程中的分裂细胞类型。此外，一种新型的开源图像处理流程可实现高通量的图像采集与分析。
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摘要
摘要
皮肤损伤会启动一个复杂的再生级联反应，涉及多种细胞类型。其中，外周胶质细胞在确保修复过程成功中发挥关键作用。然而，由于现有技术的局限性，我们对这些过程的理解仍不完整。因此，本研究采用迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法，利用针对参与组织再生的关键细胞类型和结构所表达蛋白的抗体，对皮肤细胞组成的变化进行表征。值得注意的是，针对细胞增殖标志物的抗体常常低估皮肤中分裂细胞的数量。为克服这一局限，将Click-iT EdU化学法与IBEX方法相结合，从而实现对增殖细胞类型的详细鉴定。通过使用全自动转盘共聚焦显微镜，建立了针对24孔板中切片样本的高通量迭代成像工作流程。该方法不仅拓展了IBEX技术在细胞状态评估中的应用 原位 使用Click-iT EdU，还引入了一种新型开源图像处理流程，可实现图像校正、拼接和配准，且无需研究人员具备丰富的编程经验即可使用。此外，还提供了关于处理和可视化高度多重成像数据的详细文档（使用包括Fiji和QuPath在内的常规图像分析软件）。总之，本方案突出了IBEX方案的多功能性，并展示了其在现有常规成像平台上的适用性。值得注意的是，将IBEX与Click-iT EdU标记相结合，能够在空间分辨率下检测并分类完整组织中以及高度动态过程中活跃分裂的细胞类型。
引言
皮肤是人体最大的器官，也是保护机体免受外界环境侵害的原始屏障1。因此，皮肤暴露于多种外部挑战之下，这些挑战会损害其屏障功能。为此，皮肤已进化出复杂的机制，以在受损后恢复组织的完整性和功能。皮肤伤口愈合分为三个重叠的阶段：炎症期、增殖期和成熟/重塑期。这三个阶段涉及多种不同类型的细胞，如真皮成纤维细胞和免疫细胞，它们协同作用，恢复受伤皮肤组织原有的生物学特性1,2,3。
皮肤是一个神经支配密集的器官，已知神经支配对于成功的修复过程至关重要4,5,6。除了轴突信号传导4,7,8之外，通常包绕轴突的外周胶质细胞也参与了成功的组织再生过程9,10,11。然而，在皮肤组织再生等动态过程中，诸如外周胶质细胞这类低丰度细胞类型的生物学作用仍不清楚。为了更准确地确定这些细胞的功能，关键在于分析其细胞微环境以及在再生过程中可能与之相互作用的邻近细胞类型。此外，由于细胞增殖是组织再生的关键阶段，因此在整个修复过程中准确检测和分类增殖性细胞类型显得尤为重要。
多重、高内涵的光学成像方法（如IBEX12）已被开发用于表征细胞组成、可视化并量化细胞间相互作用，并在空间分辨率下解析复杂组织内的微环境模式。与其他多重检测方法需要专用仪器和 proprietary 试剂不同，IBEX 的一个显著优势在于，其可在标准研究环境中利用 commercially available 的抗体、试剂和显微镜以相对较低的成本建立。尽管在IBEX panel中常用的抗Ki-67抗体在多种组织中均能可靠地标记增殖细胞类型13,14，但在急性小鼠皮肤伤口的固定冷冻组织切片中，Ki-67阳性（Ki-67+）细胞数量相较于其他方法被发现低估。因此，我们将Click-iT EdU化学标记技术与IBEX相结合，发现EdU+细胞的数量更能准确反映其他方法所获得的增殖细胞总数。
此外，通过使用全自动转盘共聚焦显微镜，建立了高通量工作流程，用于对置于24孔板中的组织切片进行迭代成像。随后，通过将多个开源Python工具整合为一种新颖的图像处理流程，对所得图像进行处理，该流程可校正光照不均、完成单幅图像的拼接，并最终实现图像配准。具体而言，采用BaSiCPy库15进行光照校正，使用m2stitch库进行图像拼接，并利用相位互相关法进行周期间配准。配准后的图像以OME-TIFF格式保存，随后可导入常规图像分析软件（如Fiji17和QuPath18）中进行进一步处理，完成细胞类型分类以及其他测量分析，例如信号强度和距离计算。综上所述，本实验方案使我们能够对再生皮肤中的主要细胞类型进行详细且高效的表征，尤其聚焦于周围胶质细胞群体所处的细胞微环境。
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方案
所有动物的繁育、饲养和实验均依照瑞士苏黎世州兽医办公室的指南进行。
1. 全层皮肤伤口（第0天）
- 使用70% O2中5%异氟烷对8-10周龄小鼠进行诱导麻醉，并以2.5%异氟烷维持麻醉。
- 剃除小鼠背部皮肤毛发并彻底清洁。
- 术前使用抗菌皂和70%乙醇溶液进行消毒。
- 通过皮下注射布托啡诺（30 µg∙mg∙kg−1）实施术前镇痛。
- 在每只动物的下背部皮肤上制作四个直径为5 mm的圆形全层切除性伤口，每侧两个，距离动物中线1 cm，彼此之间相距约2 cm19。
- 术后通过饮水给予布托啡诺连续3天镇痛治疗（9 µg/mL，含2%蔗糖）。
- 让伤口在无敷料覆盖的情况下自然愈合。
- 在预定时间点采集伤口组织，用于组织学检查和流式细胞术分析。
- 对于IBEX实验流程，将皮肤组织在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定过夜。使用 commercially available Biopsy Capsule（活检胶囊）以防止样本在固定过程中卷曲。将经4% PFA固定的组织在4 °C下置于含30%蔗糖的PBS溶液中过夜进行冷冻保护。随后将组织转移至30%蔗糖与O.C.T.包埋剂按1:1比例混合的溶液中，室温孵育2小时，最后在异戊烷中快速冷冻前将其包埋于O.C.T.中。
2. 样品制备（第1天）
- 在摇床上用 200 µL 铬矾明胶对 24 孔板进行包被，孵育 15 分钟。然后完全去除明胶，并将包被后的孔板在 40 °C 烤箱中干燥 60 分钟。建议包被所需数量两倍的孔作为备用。每孔加入 2 mL PBS。
注意：在放置组织前，确保包被层完全干燥。也可提前一天包被，并在室温下过夜干燥。包被完成后，切勿将包被孔板存放于冰箱或冷冻柜中；为获得最佳效果，建议在包被后 1–2 天内使用。 - 在冷冻切片机中将 O.C.T. 包埋的组织切成 15–30 µm 厚度，并迅速转移至含有 2 mL PBS 的已包被孔中。
注意：可使用金属刮铲或镊子转移组织。 - 使用 1 mL 移液器小心吸除 PBS，注意保持组织切片位于孔中央。为有效操作，应从孔的边缘缓慢吸出 PBS，并根据需要调整移液器位置，防止组织移位。
注意：组织的精确定位对本实验方案的成功至关重要。一旦组织贴附于包被表面，便无法重新调整位置。 - 将组织切片在 37 °C 烤箱中干燥 1 小时。
3. 组织包埋、EdU点击化学反应及抗体免疫标记，IBEX循环1（第1天）
- 用 1 mL PBS 重悬，孵育 5 分钟。
- 用 500 µL 含 0.5% Triton 的 PBS 在室温下透化组织 30 分钟。
- 用 PBS 短暂洗涤组织 2 次。
- 按照制造商说明书，在室温下进行 Click-iT 反应 30 分钟。
注意：样品需避光处理。 - 用 PBS 短暂洗涤组织 2 次。
- 使用封闭缓冲液在室温下封闭组织 1 小时。
注意：本实验采用含 10% 驴血清的 PBS 进行封闭，但可根据需要调整；任何适用于标准免疫标记实验方案的封闭缓冲液均可使用。 - 将一抗（用封闭缓冲液稀释；参见材料表）于 4 °C 过夜孵育，进行第一轮标记。
注意：封闭和免疫标记也可采用非加热微波辅助方法进行，约需 1 小时，具体操作见 Radtke 等人12的描述。然而，对于皮肤伤口样本，一抗过夜孵育可获得最佳的信噪比。免疫标记后的组织切片可在成像前于 PBS 中保存数天，建议次日进行成像以获得最优信号质量。
4. 二抗免疫标记与细胞核复染（第2天）
- 用 1 mL PBS 洗涤各孔 3 次。
- 在避光条件下，于室温下将组织切片与封闭液中的抗兔二抗（1:300）以及核复染染料 Hoechst（1:1,000）共同孵育 1 小时。
- 在室温下用 1 mL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
- 每孔保留约 500 µL PBS，并将培养板置于显微镜下观察。
注意：此处可作为暂停点：样品在 4 °C 下可稳定保存数天，但在免疫标记后 24 小时内成像时信噪比最佳。
5. 第一次IBEX循环（第2天）的显微镜设置与成像
- 登录显微镜并启动软件，然后登录用户配置文件。
- 进入采集设置（通过打开） 筛选 | 采集设置用于实验方案设置和图像采集。
- 使用 弹出 按钮，将培养板载入显微镜。
- 用70%乙醇在将24孔板放入显微镜前擦拭其底部。点击 加载 将培养板放入显微镜的载物台并固定。
- 选择所需的放大倍数和采集模式 目标与相机。随着 获取 模式，选择 共聚焦 51 µm 狭缝 模式。
注意：本实验采用20倍水浸物镜（数值孔径为0.95），并使用针孔直径为50 µm、间距为250 µm的转盘。 - 在……之下 培养皿 选项卡中，选择已使用的板模型。
- 前往 孔/位点 访问标签页。在下方 站点选项 点击 固定数量的位点 选择列数和行数，使整个孔的大致区域均被覆盖。点击 重叠区域 10%。
注意：必须激活此按钮以确保各个图块的拼接。 - 仅选择第一个装有液体的孔进行采集 右键单击 井图上对应的孔位。已选中的孔为绿色，未选中的孔为灰色。
- 将载物台移动至组织应处的位置 左键单击 在板图的第一个已填充孔以及站点图中靠近中心的位置查找。寻找颜色较深的孔和位点，以指示当前位置。
- 前往 采集 选项卡。选择选项 启用基于激光的聚焦 和 获取Z系列图像。
- 前往 采集/自动对焦 标签。对于 孔间自动聚焦 选择 聚焦于培养板及孔底 选项，以及用于 自动对焦位点， 选择 所有位点 选项
- 前往 波长 标签，并选择在当前循环中要成像的染料数量。查看下方相应数量的新标签页是否已打开 波长 表。
- 转到第一个波长选项卡。在下方 照明， 选择最适合目标荧光染料的滤光片设置（例如，选择 DAPI 如果使用了Hoechst。
- 选择 带 z 轴偏移的激光器 用于 z 轴定位和 点击 的 计算偏移量 点击按钮以设置正确的成像高度。系统将在不同的 z 轴位置采集一系列图像，请选择样本最清晰对焦的一幅。
注意：确保载物台位置位于有组织的区域。如果在此位置看不到组织， 选择 更换一个位点并重试（参见步骤 4.9）。 - 按压 聚焦 按钮，并等待组织的清晰图像显示。
- 对于 光照功率， 选择50%。输入 2000 用于 目标最大强度 并按压 自动曝光 自动调整曝光时间。
注意：为了加快图像采集速度，可以增加激光功率，从而缩短曝光时间。然而，这可能导致更严重的光漂白，进而在相邻图像拼接区域产生图像伪影。 - 对于 Z系列， 选择 Z系列与二维投影图像， 以及用于 阴影校正， 选择 仅 FL 阴影。
- 重复步骤 5.13–5.17，针对其他波长进行操作，但不再使用 带z轴偏移的激光器， 选择 W1 的 Z 轴偏移量 并选择 0.
- 前往 Z系列 输入所需的步长（对于20倍物镜，使用0.5 µm的步长）。
注意：通过使用推荐值2-3倍的步长，可提高采集速度。 - 点击 聚焦 按钮，并等待一个标有箭头的标签 当前职位 即将出版
- 点击 开始直播 并等待显示实时图像的新窗口出现。拖动 当前职位 箭头直至到达组织底部，然后单击 B组 按钮。拖动 当前位置 箭头直至到达组织顶部，然后单击 设置 T 按钮。单击 F2：停止。
注意：可在“激活波长”下选择用于活体成像的波长。 - 选择要采集的位点；首先，确保载物台位于第一个孔处 左键单击 在上面并按压 开始直播 再次。在孔内移动到不同的位置 左键单击 在站点图的不同位置。找到组织的边界并 标记 所有包含待采集组织的位点 右键单击。 选中的位点将显示为绿色，未选中的位点显示为灰色。
注意：目前仅对第一个孔进行此操作，并确保仅选择第一个孔用于数据采集。 - 前往 运行 表。对于 板名称，命名它 "循环{i}_孔{w}_{描述}"；将 {i}、{w} 和 {description} 替换为相应的值/描述。
- 点击 保存方案 并保存，同样包含 "第{i}周期_第{w}孔" 在名称中
- 设置 所有其他孔的采集区域。为此，重复步骤 5.22–5.24。
注意：每个待采集的孔都需要保存单独的协议文件。在绘制新的 ROI 之前，确保已激活正确的孔。最终结果应为每个待采集的孔对应一个保存的协议。由于不同孔中的组织形状各不相同，此步骤必不可少。如果各孔之间的 ROI 和 z 层扫描参数完全相同，则可跳过步骤 5.22–5.24 以及步骤 5.26–5.29。在此情况下，只需选择所有待成像的孔（见步骤 5.22），然后进入 运行 制表符并按下 获取培养板。 - 点击 对照 | 期刊 | 开始记录 然后立即 对照 | 期刊 | 停止录制 保存创建的期刊，并通过以下方式重新打开 对照 | 期刊 | 编辑期刊
- 在左侧面板中，找到并双击 载入文件中的方案 - 板材获取 以及在 平板获取 将这些步骤添加到期刊中；在右侧面板中查找它们。双击已添加的 载入文件中的方案 - 板材获取 并选择为第一个孔保存的程序（参见步骤 5.24）。
- 对每个待检测的孔重复步骤 5.27，始终加载相应的程序。
- 点击 保存 最后在 运行期刊 开始采集（采集180个视野，z轴堆栈厚度为15 µm，约需3小时）。
6. 荧光团淬灭（第2天）
- 在实验结束前约30分钟，准备漂白试剂。将10 mg硼氢化锂溶解于10 mL去离子水（ddH2O）中，并通过0.22 µm滤膜过滤。静置10分钟，等待气泡形成。为确保漂白效果，漂白试剂应在配制后4小时内使用。
注意：操作硼氢化锂时应在化学通风橱内进行，因其可能与空气反应并产生易燃的氢气。 - 在常规环境光照条件下，使用1 mL浓度为1 mg/mL的硼氢化锂对荧光染料进行15分钟漂白处理。漂白过程中观察组织表面是否出现微小气泡。
注意：若在化学通风橱内操作，需确保漂白过程中照明不会自动关闭。 - 使用另1 mL相同溶液配制的1 mg/mL硼氢化锂重复漂白一次，持续15分钟。
- 用1 mL PBS溶液洗涤3次，每次5分钟。
注意：请勿缩短洗涤时间，以免漂白试剂去除不彻底，从而损害后续抗体panel。
7. IBEX 循环（第 2 天）
- 进行下一免疫标记循环（步骤 3.7）的一抗孵育，并于 4 °C 过夜孵育。重复步骤 4.4–5.4。
注意：步骤 4.2–4.3 无需重复，因为未偶联的兔源抗体仅在第一个 IBEX 循环中使用。然而，在后续循环中也可使用来源于较不常见物种（如鸡或豚鼠）的未偶联抗体，因为其二抗不会与已偶联的一抗发生交叉反应。每个循环中所用抗体的具体信息详见材料表。 - 在显微镜上，通过点击加载方案，从本地计算机加载前一个 IBEX 循环对应孔的方案设置，文件名为 Cycle{i}_Well{w}（步骤 5.24）。该方案设置包含前一个 IBEX 循环中保存的 ROI（选定的成像区域）、放大倍数、自动对焦参数以及所有其他成像设置（步骤 5.5–5.25）。
- 选择波长标签页，并针对新一组抗体调整曝光时间和照明强度（步骤 5.12–5.18）。务必在整个循环过程中对一个标记物（通常为 DAPI 或 Hoechst）进行成像，以便后续对各循环图像进行对齐。
注意：如 Radtke 等人18报道，常用的荧光蛋白（如 GFP 和 tdTomato）对硼氢化锂漂白不敏感。当处理含有内源性荧光蛋白（如 tdTomato）的组织时，若该波长无需用于图像配准，则可在第一个循环之后省略该波长的采集，从而加快成像速度。可通过在总波长标签页中减少采集通道数量来移除相应波长。此外，在多个成像循环中并未观察到组织自发荧光出现一致性的升高；但此现象可能因组织类型不同而有所差异18。 - 检查 z 轴层扫设置是否仍然合理，并作相应调整（步骤 5.19–5.21）。
注意：确保所有循环中 z 轴层扫的步长保持一致。 - 在运行标签页中更新板名称，并重新保存该方案。
- 对所有待成像孔重复步骤 7.2–7.5。
注意：建议记录第一个孔中所有使用波长的曝光设置，并在后续所有孔中使用相同的设置。 - 编辑实验日志，选择新的方案文件，并保存本循环的实验日志。
- 运行该实验日志。
- 重复步骤 6.1–6.4 以漂白荧光染料。
- 重复步骤 7.1–7.9，直至完成所需的免疫标记次数。
8. 图像处理（第2天）
- 完成 IBEX 循环的图像采集后，导出图像数据：
- 选择 Screening | Plate data utilities | Export Images。
- 点击 Select Plate(s)，并选择每个循环和每个孔中已采集的所有板。
- 选择 All Z Planes，指定输出目录，然后点击 OK 以导出数据。
注意：数据将被导出为每个图块和每个平面的独立 TIFF 文件。为合并所有图块和循环，需执行以下处理步骤。
- 按照以下方案将导出的数据整理到文件夹中：确保每个循环对应一个文件夹，每个循环文件夹内再包含对应每个孔的一个子文件夹。命名格式如下："\cycle{i}\{well}\*_Plate_*"，其中 {i} 和 {well} 分别代表相应的循环编号和孔编号，* 代表任意字符。例如："\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
注意：后续处理步骤要求正确的命名方式和文件夹结构。 - 安装必要的 Python 软件包：使用 Miniforge 管理 Python 环境。安装说明见 https://github.com/conda-forge/miniforge 。
注意：处理步骤的代码以 Jupyter Notebook 形式提供，可在 https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove 获取，或作为补充文件（补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4 和 补充文件 5）提供。 - 从 Github 下载代码时，请点击 Code | Download ZIP 下载所有文件，并按照 README.md 文件中的安装说明进行操作。
- 启动 Jupyter-Lab（补充文件 2）：
- 在终端中输入 conda activate zmb-ibex-jove，以激活已安装的 conda 环境。
- 在终端中使用命令（例如 cd C:\path\to\zmb-ibex-jove）切换至下载的目录。
- 在终端中输入 jupyter-lab 启动 Jupyter-Lab，浏览器窗口将自动打开并显示 Jupyter-Lab 界面。
- 计算照明校正图像：
- 在左侧标签页中，导航至 "examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" 笔记本，通过双击打开。该笔记本将使用 BaSiCPy 库（补充文件 3）计算照明校正图像。
- 将 "base_dir" 和 "save_dir" 修改为数据所在路径以及照明校正图像的保存路径。
- 在笔记本中运行代码时，选中每个单元格并按 Shift+Enter 执行。请按从上到下的顺序运行整个笔记本。
- 对每个独立循环执行图像拼接（补充文件 4）：
- 在左侧标签页中，导航至下一个笔记本并打开："02_stitching_MD.ipynb"。该笔记本将为每个循环加载各个图块，进行照明校正，并将其拼接成单个图像文件，每个孔和每个循环生成一个图像文件。拼接过程使用 m2stitch 库（https://github.com/yfukai/m2stitch）。
- 修改第一个单元格中的输入路径为正确的文件路径。再次从上到下执行整个笔记本。
- 执行循环间的图像配准（补充文件 5）：
- 在左侧标签页中， 导航至下一个笔记本并打开："03_registration_pcc.ipynb"。该笔记本使用仅包含平移变换的方式对各个循环进行对齐，变换参数通过开源 scikit-image 库（https://scikit-image.org/）中的相位互相关算法计算得出。
- 修改第一个单元格中的输入路径。选择一个参考循环和参考通道（通常为 DAPI）。再次从上到下执行整个笔记本。
注意：只需执行 "选项1：一起加载并保存所有通道" 和 "选项2：将各通道作为独立文件加载并保存" 中的其中一个章节。第一个章节将生成一个包含所有循环所有通道的大文件，第二个章节将为每个通道生成独立文件。第二个选项在处理时所需内存更少。
9. 图像分析（第2天）
- 下载 并打开 Fiji （https://imagej.net/software/fiji/downloads）
注意：所得图像为多层面、多通道图像，可作为三维图像进行分析。此处仅以二维数据为例展示分析流程，首先需计算最大强度投影。 - 开放 通过将文件拖动到 Fiji 窗口中来在 Fiji 中打开该文件。
- 通过选择计算最大强度投影 图像 | 图像序列 | Z轴投影..., 选择 最大强度，然后按压 好的. 通过以下方式重新保存图像 文件 | 另存为 | OME-TIFF".
- 为分析细胞，使用开源软件 QuPath；可从以下地址下载并安装该软件 https://qupath.github.io/
- 打开 QuPath，通过将一个空文件夹拖入窗口来创建一个新项目。
- 将所有文件拖到 QuPath 窗口中并按下以导入项目 导入 采用标准设置。
- 双击 单击左侧面板中的图像以打开。将其指定为 荧光 当系统提示时。
- 打开 亮度/对比度 通过按下窗口 Shift+C
注意：此处可选择显示的通道，并调整亮度和对比度。通过双击通道名称，还可更改通道名称和颜色。 - 选择 工具 | 多边形 工具并标注组织区域。在下方查找新的标注。 注释 标签。通过选择标注并选择一个类别（例如， 其他），并按压 设置类。
- 检测细胞：前往 分析 | 细胞检测 | 细胞检测
- 选择一个核染色通道。
- 保留大多数设置不变，但调整 阈值 通过将鼠标悬停在细胞核上并记录右下角显示的强度值来确定前景强度。再将鼠标悬停在背景区域并记录其强度值。选择介于背景与前景强度之间的中间值作为阈值。
- 点击 运行。
- 检查细胞和测量结果：
- 由 双击 在 细胞 或通过在其中选择它 层级结构 在标签页中，于左下方面板检查其测量结果。应针对细胞、细胞核和细胞质添加不同的形态和强度测量参数。
- 对细胞进行分类：
- 根据通道中的强度对检测到的细胞进行分类，请前往 分类 | 对象分类 | 创建单个测量分类器
- 选择所需的通道 通道滤光片 以及在适当条件下的测量 测量 例如， 细胞：通道均值).
- 通过再次将光标悬停在阳性细胞和阴性细胞上，并在两者之间选择一个值来调整阈值。
- 例如，选择 阳性 用于 高于阈值 和 阴性 用于 低于阈值. 通过检查结果来验证 实时预览.
- 按压 应用 对细胞进行分类。
- 测量至标注对象（如神经束）的距离：
- 选择 工具 | 画笔 工具
- 勾画感兴趣区域（例如，神经束）。
- 前往 注释 标签。选择所有新注释，选择相应的类别，然后按 设置类。
注意：可以通过创建一个新类 右键单击 在类窗口中并选择 添加/移除 | 添加类别. - 前往 空间分析 | 二维标注的有符号距离分析 并按压 是 当系统提示时。
- 为每个细胞添加一项新的测量指标，表示其到给定类别最近标注的距离。
- 导出测量结果：
- 前往 测量 | 显示检测结果 等待所有检测结果的全部测量值列表出现。
- 通过 .txt 格式导出表格 保存 按钮
- 将数据导入所选的数据处理软件中进行进一步分析。
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结果
该方法通过将EdU Click-iT化学法与IBEX技术结合，可在固定的冷冻小鼠皮肤切片中充分检测增殖性细胞类型。我们比较了不同方法对增殖性细胞类型的检测效果，特别是使用Ki-67抗体标记增殖性细胞类型，以及采用EdU Click-iT化学法检测细胞增殖（图1）。我们观察到，在固定的冷冻小鼠皮肤切片中，Ki-67抗体标记低估了增殖细胞的数量（图1B、D），而EdU掺入法能准确反映增殖细胞的数量（图1A、C）。EdU掺入法所得结果与流式细胞术结果（图1G）以及经甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的Ki-67免疫标记结果（图1E–G）进行了比较。这些结果表明，在固定的冷冻小鼠皮...
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讨论
细胞增殖是皮肤修复的四个主要阶段之一，而炎症期向增殖期的过渡对于成功的修复过程至关重要20。良好的免疫应答调控十分关键，因为持续的炎症可能导致慢性伤口，这是一个重要的全球健康问题1,21。增殖是一个关键的生物学过程，不仅在组织修复中具有重要作用，也在生物体发育和疾病评估（包括癌变过程）中具有重要意义。目前存在多种测量细胞增殖的方法，既可通过细胞计数进行间接测定，也可通过免疫标记（如Ki-67标记）或DNA掺入试剂进行直接检测。Ki-67免疫标记作为一种广泛应用的诊断工具，已促成了Ki-67标记指数的建立，该指数被用于癌症患者的诊断与预后评估22,23,24。
在本实验方案中，我们通过广泛使用的细胞周期标志物Ki-67以及DNA掺入试剂...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢显微镜与图像分析中心在MD ImageXpress显微镜使用方面提供的支持，以及实验动物服务中心在小鼠饲养方面的协助。L.S.的研究得到了瑞士国家科学基金会两项资助（310030_192075和310030_207801）、瑞士癌症研究基金会资助（KLS-5391-08-2021）以及SKINTEGRITY.CH合作研究联盟的支持。S.S.的研究得到了苏黎世大学博士后资助（FK-22-056）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体和试剂 | 来源 | 标识符 | 备注 |
| 抗体 | |||
| CD31 Alexa Fluor 647（循环2） | BioLegend | Cat#102516 | 1:100 |
| AB_2161029 | |||
| CD45 Alexa Fluor 488（循环2） | BioLegend | Cat#103122 | 1:100 |
| AB_493531 | |||
| Ki-67 FITC（循环1） | BioLegend | Cat#151212 | 1:50 |
| AB_2814055 | |||
| Ki-67 鸡源抗体（ck） | LSBio | Cat#LS-C772946 | 1:800 |
| Ki-67 大鼠源抗体（rt） | BioLegend | Cat#652402 | 1:100 |
| AB_11204254 | |||
| 神经丝蛋白H&M（NF-H/NF-M）Alexa Fluor 647（循环3） | BioLegend | Cat#837710 | 1:300 |
| AB_2734613 | |||
| p75NTR（循环1） | Cell Signaling Technology | Cat#8238 AB_10839265 | 1:1500 |
| 波形蛋白Alexa Fluor 488（循环3） | BioLegend | Cat#699305 | 1:100 |
| AB_2888889 | |||
| Alexa Fluor 647 驴抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | Cat#711-605-152 | |
| 试剂 | |||
| Cellvis 24孔玻璃底培养板 | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 铬明矾明胶 | Newcomer Supply | Cat#1033A | |
| Click-iT EdU试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10637 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | Cat#14533; CAS# 23491-52-3 | |
| LiBH4，硼氢化锂，95% | Thermo Fisher Scientific | Cat#10438443 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂（Sakura） | Biosystems Switzerland | Cat#7109-4583 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | Cat#10010-015 | |
| Superfrost Plus黏附载玻片 | Epredia | Cat#J1800AMNZ | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat#T8787 | |
| 设备 | |||
| 毛刷 | Faust AG | Cat#9172051 和 9172050 | |
| 切片机刀片 | Biosystems Switzerland | Cat#207500011 | |
| 显微镜 | Molecular Devices, ImageXpress Confocal HT.ai | ||
| 烘箱 | Thermo Fisher Scientific | Cat#HBMCR4220 | |
| 摇床振荡器 | Edmund Bühler GmbH | Cat#32310015 |
参考文献
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