用于评估组织样本中皮肤细胞表型和增殖状态的高通量成像和分析工作流程

Summary

迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 和商业核苷酸标记测定 （Click-iT EdU） 的组合能够在固定冷冻小鼠组织切片中高度动态的过程中检测和分类分裂细胞类型。此外，一种新颖的开源图像处理管道提供了高通量图像采集和分析。

Abstract

皮肤损伤会引发复杂的再生级联反应，参与各种细胞类型。其中，外周神经胶质细胞在确保修复过程的成功方面发挥着至关重要的作用。然而，由于当前技术的局限性，我们对这些过程的理解仍然不完整。因此，采用迭代-漂白-扩展-多重性（IBEX）方法，使用针对参与组织再生的关键细胞类型和结构表达的蛋白质的抗体来表征皮肤细胞组成的变化。重要的是，针对细胞增殖标志物的抗体往往低估了皮肤中分裂细胞的数量。为了克服这一限制，将 Click-iT EdU 化学与 IBEX 方法相结合，可以对增殖细胞类型进行详细表征。使用全自动转盘共聚焦显微镜，开发了一种高通量工作流程，用于对切片成 24 孔板的样品进行迭代成像。除了扩展 IBEX 方法以使用 Click-iT EdU 原 位 评估细胞状态外，还引入了一种新颖的开源图像处理管道来执行图像校正、拼接和配准，可供没有丰富编程经验的研究人员使用。此外，还提供了有关处理和可视化高度多重成像数据（使用传统图像分析软件，包括 Fiji 和 QuPath）的详细文档。总之，该协议突出了 IBEX 协议的多功能性，并展示了其对已建立的传统成像平台的适应性。值得注意的是，将 IBEX 与 Click-iT EdU 标记相结合，能够以空间分辨率检测和分类完整组织中和高度动态过程中活跃分裂的细胞类型。

Introduction

皮肤是人体最大的器官，也是保护身体免受外界环境侵害的原始屏障¹.因此，它面临着大量损害其屏障功能的外部挑战。因此，皮肤已经发展出复杂的机制来恢复损伤后的组织完整性和功能。皮肤伤口愈合发生在三个重叠阶段：炎症、增殖和成熟/重塑。这三个阶段涉及几种不同的细胞类型，例如真皮成纤维细胞和免疫细胞，它们共同作用以恢复受伤皮肤组织的初始生物学特性 ^1,2,3。

皮肤是一个神经支配密集的器官，众所周知，神经支配对于成功的修复过程至关重要 ^4,5,6。除了轴突信号传导 ^4,7,8 外，通常包裹轴突的外周神经胶质细胞参与成功的组织再生 ^9,10,11

Protocol

所有动物育种、饲养和实验均按照瑞士苏黎世州兽医办公室的指导方针进行。

1. 全层皮肤伤口（第 0 天）

1. 用70%O₂ 中的5%异氟醚诱导8-10周龄小鼠，并使用2.5%异氟醚维持它。
2. 剃掉背部皮肤并彻底清洁。
3. 手术前使用抗菌肥皂和 70% EtOH 溶液进行消毒。
4. 使用皮下注射丁丙诺啡（30μg∙mg∙kg⁻¹）进行术前镇痛。
5. 在每只动物的下背部皮肤上产生四个直径为5毫米的圆形全层切除伤口，每侧两个，距动物中线1厘米，彼此相距约2厘米¹⁹.
6. 通过饮用水（9 μg/mL 和 2% 蔗糖）对丁丙诺啡进行 3 天的术后镇痛。
7. 让伤口愈合，无需包扎。
8. 在规定的时间点收集伤口进行组织学检查和流式细胞术分析。
9. 对于IBEX方案，用4%多聚甲醛（PFA）溶液在4°C下解剖并固定皮肤组织过夜。使用市售的活检胶囊来防止样品在固定过程中卷曲。在 4 °C 下冷冻保护 30% 蔗糖中的 4% PFA 固定组织在 PBS 中过夜。 将组织转移到30%蔗糖与O.C.T化合物的1：1混合物中，在室温下2小时，最后包埋在O.C.T中，然后在异戊烷中快速冷冻。
....

Results

该方法通过将 EdU Click-iT 化学与 IBEX 相结合，在固定的冷冻小鼠皮肤切片中充分检测增殖的细胞类型。使用不同的方法比较增殖细胞类型的检测，特别是用 Ki-67 抗体标记增殖细胞类型和使用 EdU Click-iT 化学方法检测细胞增殖（图 1）。我们观察到Ki-67抗体标记低估了固定冷冻小鼠皮肤切片中增殖细胞的数量（图1B，D），而EdU掺入充分反映了增殖细胞的数量（图1A，C）。将EdU掺入获得的结果与流式细胞术结果（图1G）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的Ki-67免疫标记（图1E-G）进行比较。这些结果表明，由于抗原修复不足，固定冷冻小鼠皮肤.......

Discussion

细胞增殖是皮肤修复的四个主要阶段之一，炎症期和增殖期之间的过渡对于成功的修复过程至关重要²⁰。良好调节的免疫反应至关重要，因为长期炎症会导致慢性伤口，这是一个重大的全球健康问题 ^1,21。增殖是一个关键的生物过程，不仅对组织修复很重要，而且对生物体发育和疾病评估（包括致癌作用）也很重要。存在多种测量细胞增殖的方法，可以通过计数细胞间接或直接通过使用 Ki-67 或 DNA 掺入试剂等标记物进行免疫标记。Ki-67免疫标记作为诊断工具被广泛使用，导致了Ki-67标记指数的发展，该指数应用于癌症患者的诊断和预后22,23,24。

在该协议中，我们使用成熟的细胞周期标记Ki.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗体和试剂	源	标识符	评论
<强>抗体<强/强力抗体>
CD31 Alexa Fluor 647（第二周期）	生物传说	猫#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488（第二周期）	生物传说	猫#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC（第一周期）	生物传说	猫#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 鸡肉（ck）	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 老鼠（现役）及nbsp;	生物传说	猫#652402	1:100
AB_11204254
神经丝H&M（NF-H/NF-M）Alexa Fluor 647（第三周期）	生物传说	猫#837710	1:300
AB_2734613
第75NTR（第一季）	细胞信号传导技术	猫#8238                      AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488（第三周期）	生物传说	猫#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 驴反兔子	杰克逊免疫研究	猫#711-605-152
Reagentsnbsp;
Cellvis 24孔玻璃底板	塞尔维斯	P24-1.5H-N
铬明矾明胶	新来者供应	猫#1033A
Click-iT 教育大学套件	赛莫飞世尔科学	C10637
霍赫斯特 33342	西格玛-奥尔德里奇	目录#14533;CAS# 23491-52-3
LiBH4，硼氢化锂，95%	赛莫飞世尔科学	猫#10438443
组织技术 O.C.T 复合体樱花	瑞士生物系统公司	猫#7109-4583
PBS	赛莫飞世尔科学	编号#10010-015
Superfrost Plus附着显微镜载玻片及nbsp;	埃普雷迪亚	猫#J1800AMNZ
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	猫#T8787
<强壮>装备
梳子	浮士德股份公司	猫#9172051和9172050
切片刀和nbsp;	瑞士生物系统公司	猫#207500011
显微镜	分子器件，ImageXpress共焦点 HT.ai
烤箱	赛莫飞世尔科学	猫#HBMCR4220
摇臂摇床	埃德蒙·布姆尔;hler 有限公司	猫#32310015