高通量成像与分析工作流程用于评估组织样本中皮肤细胞表型及增殖状态

摘要

迭代漂白扩展多重性（IBEX）技术与商用核苷酸标记试剂盒（Click-iT EdU）相结合，能够在固定的冷冻小鼠组织切片中检测并分类高度动态过程中的分裂细胞类型。此外，一种新型的开源图像处理流程可实现高通量的图像采集与分析。

摘要

皮肤损伤会启动一个复杂的再生级联反应，涉及多种细胞类型。其中，外周胶质细胞在确保修复过程成功中发挥关键作用。然而，由于现有技术的局限性，我们对这些过程的理解仍不完整。因此，本研究采用迭代漂白扩展多重性（IBEX）方法，利用针对参与组织再生的关键细胞类型和结构所表达蛋白的抗体，对皮肤细胞组成的变化进行表征。值得注意的是，针对细胞增殖标志物的抗体常常低估皮肤中分裂细胞的数量。为克服这一局限，将Click-iT EdU化学法与IBEX方法相结合，从而实现对增殖细胞类型的详细鉴定。通过使用全自动转盘共聚焦显微镜，建立了针对24孔板中切片样本的高通量迭代成像工作流程。该方法不仅拓展了IBEX技术在细胞状态评估中的应用 原位 使用Click-iT EdU，还引入了一种新型开源图像处理流程，可实现图像校正、拼接和配准，且无需研究人员具备丰富的编程经验即可使用。此外，还提供了关于处理和可视化高度多重成像数据的详细文档（使用包括Fiji和QuPath在内的常规图像分析软件）。总之，本方案突出了IBEX方案的多功能性，并展示了其在现有常规成像平台上的适用性。值得注意的是，将IBEX与Click-iT EdU标记相结合，能够在空间分辨率下检测并分类完整组织中以及高度动态过程中活跃分裂的细胞类型。

引言

皮肤是人体最大的器官，也是保护机体免受外界环境侵害的原始屏障¹。因此，皮肤暴露于多种外部挑战之下，这些挑战会损害其屏障功能。为此，皮肤已进化出复杂的机制，以在受损后恢复组织的完整性和功能。皮肤伤口愈合分为三个重叠的阶段：炎症期、增殖期和成熟/重塑期。这三个阶段涉及多种不同类型的细胞，如真皮成纤维细胞和免疫细胞，它们协同作用，恢复受伤皮肤组织原有的生物学特性^1,2,3。

皮肤是一个神经支配密集的器官，已知神经支配对于成功的修复过程至关重要^4,5,6。除了轴突信号传导^4,7,8之外，通常包绕轴突的外周胶质细胞也参与了成功的组织再生过程^9,10,

方案

​所有动物的繁育、饲养和实验均依照瑞士苏黎世州兽医办公室的指南进行。

1. 全层皮肤伤口（第0天）

1. 使用70% O₂中5%异氟烷对8-10周龄小鼠进行诱导麻醉，并以2.5%异氟烷维持麻醉。
2. 剃除小鼠背部皮肤毛发并彻底清洁。
3. 术前使用抗菌皂和70%乙醇溶液进行消毒。
4. 通过皮下注射布托啡诺（30 µg∙mg∙kg⁻¹）实施术前镇痛。
5. 在每只动物的下背部皮肤上制作四个直径为5 mm的圆形全层切除性伤口，每侧两个，距离动物中线1 cm，彼此之间相距约2 cm¹⁹。
6. 术后通过饮水给予布托啡诺连续3天镇痛治疗（9 µg/mL，含2%蔗糖）。
7. 让伤口在无敷料覆盖的情况下自然愈合。
8. 在预定时间点采集伤口组织，用于组织学检查和流式细胞术分析。
9. 对于IBEX实验流程，将皮肤组织在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定过夜。使用 commercially available Biopsy Capsule（活检胶囊）以防止样本在固定过程中卷曲。将经4% PFA固定的组织在4 °C下置于含30%蔗糖的PBS溶液中过夜进行冷冻保护。随后将组织转移至30%蔗糖与O.C.T.包埋剂按1:1比例混合的溶液中，室温孵育2....

结果

该方法通过将EdU Click-iT化学法与IBEX技术结合，可在固定的冷冻小鼠皮肤切片中充分检测增殖性细胞类型。我们比较了不同方法对增殖性细胞类型的检测效果，特别是使用Ki-67抗体标记增殖性细胞类型，以及采用EdU Click-iT化学法检测细胞增殖（图1）。我们观察到，在固定的冷冻小鼠皮肤切片中，Ki-67抗体标记低估了增殖细胞的数量（图1B、D），而EdU掺入法能准确反映增殖细胞的数量（图1A、C）。EdU掺入法所得结果与流式细胞术结果（图1G）以及经甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的Ki-67免疫标记结果（图1E–G）进行了比较。这些结果表明，在固定的冷冻小鼠皮.......

讨论

细胞增殖是皮肤修复的四个主要阶段之一，而炎症期向增殖期的过渡对于成功的修复过程至关重要²⁰。良好的免疫应答调控十分关键，因为持续的炎症可能导致慢性伤口，这是一个重要的全球健康问题^1,21。增殖是一个关键的生物学过程，不仅在组织修复中具有重要作用，也在生物体发育和疾病评估（包括癌变过程）中具有重要意义。目前存在多种测量细胞增殖的方法，既可通过细胞计数进行间接测定，也可通过免疫标记（如Ki-67标记）或DNA掺入试剂进行直接检测。Ki-67免疫标记作为一种广泛应用的诊断工具，已促成了Ki-67标记指数的建立，该指数被用于癌症患者的诊断与预后评估^22,23,24。

在本实验方案中，我们通过广泛使用的细胞周期标志物Ki-67以及DNA掺入试剂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体和试剂	来源	标识符	备注
抗体
CD31 Alexa Fluor 647（循环2）	BioLegend	Cat#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488（循环2）	BioLegend	Cat#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC（循环1）	BioLegend	Cat#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 鸡源抗体（ck）	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 大鼠源抗体（rt）	BioLegend	Cat#652402	1:100
AB_11204254
神经丝蛋白H&M（NF-H/NF-M）Alexa Fluor 647（循环3）	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR（循环1）	Cell Signaling Technology	Cat#8238                       AB_10839265	1:1500
波形蛋白Alexa Fluor 488（循环3）	BioLegend	Cat#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 驴抗兔二抗	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
试剂
Cellvis 24孔玻璃底培养板	Cellvis	P24-1.5H-N
铬明矾明胶	Newcomer Supply	Cat#1033A
Click-iT EdU试剂盒	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4，硼氢化锂，95%	Thermo Fisher Scientific	Cat#10438443
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂（Sakura）	Biosystems Switzerland	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Superfrost Plus黏附载玻片	Epredia	Cat#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
设备
毛刷	Faust AG	Cat#9172051 和 9172050
切片机刀片	Biosystems Switzerland	Cat#207500011
显微镜	Molecular Devices, ImageXpress Confocal HT.ai
烘箱	Thermo Fisher Scientific	Cat#HBMCR4220
摇床振荡器	Edmund Bühler GmbH	Cat#32310015