用于评估组织样本中皮肤细胞表型和增殖状态的高通量成像和分析工作流程

Summary

迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 和商业核苷酸标记测定 （Click-iT EdU） 的组合能够在固定冷冻小鼠组织切片中高度动态的过程中检测和分类分裂细胞类型。此外，一种新颖的开源图像处理管道提供了高通量图像采集和分析。

Abstract

皮肤损伤会引发复杂的再生级联反应，参与各种细胞类型。其中，外周神经胶质细胞在确保修复过程的成功方面发挥着至关重要的作用。然而，由于当前技术的局限性，我们对这些过程的理解仍然不完整。因此，采用迭代-漂白-扩展-多重性（IBEX）方法，使用针对参与组织再生的关键细胞类型和结构表达的蛋白质的抗体来表征皮肤细胞组成的变化。重要的是，针对细胞增殖标志物的抗体往往低估了皮肤中分裂细胞的数量。为了克服这一限制，将 Click-iT EdU 化学与 IBEX 方法相结合，可以对增殖细胞类型进行详细表征。使用全自动转盘共聚焦显微镜，开发了一种高通量工作流程，用于对切片成 24 孔板的样品进行迭代成像。除了扩展 IBEX 方法以使用 Click-iT EdU 原 位 评估细胞状态外，还引入了一种新颖的开源图像处理管道来执行图像校正、拼接和配准，可供没有丰富编程经验的研究人员使用。此外，还提供了有关处理和可视化高度多重成像数据（使用传统图像分析软件，包括 Fiji 和 QuPath）的详细文档。总之，该协议突出了 IBEX 协议的多功能性，并展示了其对已建立的传统成像平台的适应性。值得注意的是，将 IBEX 与 Click-iT EdU 标记相结合，能够以空间分辨率检测和分类完整组织中和高度动态过程中活跃分裂的细胞类型。

Introduction

皮肤是人体最大的器官，也是保护身体免受外界环境侵害的原始屏障¹.因此，它面临着大量损害其屏障功能的外部挑战。因此，皮肤已经发展出复杂的机制来恢复损伤后的组织完整性和功能。皮肤伤口愈合发生在三个重叠阶段：炎症、增殖和成熟/重塑。这三个阶段涉及几种不同的细胞类型，例如真皮成纤维细胞和免疫细胞，它们共同作用以恢复受伤皮肤组织的初始生物学特性 ^1,2,3。

皮肤是一个神经支配密集的器官，众所周知，神经支配对于成功的修复过程至关重要 ^4,5,6。除了轴突信号传导 ^4,7,8 外，通常包裹轴突的外周神经胶质细胞参与成功的组织再生 ^9,10,11。然而，在皮肤组织再生等动态过程中，代表性不足的细胞类型（例如外周神经胶质细胞）的作用仍然知之甚少。为了更好地确定这些细胞的功能，分析细胞微环境以及它们在再生过程中可能相互作用的邻近细胞类型至关重要。此外，由于细胞增殖是组织再生的关键阶段，因此在整个修复过程中准确检测和分类增殖的细胞类型非常重要。

已经开发出多重、高内涵、光学成像方法，例如 IBEX¹²，用于表征细胞组成，可视化和量化细胞间相互作用，并以空间分辨率剖析复杂组织内的微环境模式。虽然其他多重检测方法需要专门的仪器和专有试剂，但 IBEX 的一个特殊优势是可以使用标准研究环境中可用的市售抗体、试剂和显微镜以相对较低的成本建立它。虽然常用于IBEX面板的抗Ki-67抗体可靠地标记了许多组织中的增殖细胞类型^13,14，但发现与其他方法相比，Ki-67阳性（Ki-67+）细胞的数量被低估了急性小鼠皮肤伤口的固定冷冻组织切片。因此，我们将 Click-iT EdU 化学与 IBEX 相结合，发现 EdU⁺ 细胞的数量更准确地代表了通过其他方法获得的增殖细胞总数。

此外，通过采用全自动转盘共聚焦显微镜，建立了高通量工作流程，用于对放置在 24 孔板中的组织切片进行迭代成像。然后通过将多个开源 Python 工具组合成一个新颖的图像处理管道来处理生成的图像，该管道可以校正图像的不均匀照明，执行各个图块的拼接，并最终进行图像配准。具体来说，BaSiCPy库¹⁵ 用于照明校正，m2stitch库用于拼接图像，相位交叉相关用于周期配准。注册的图像被保存为 OME-TIFF，然后可以加载到传统的图像分析软件中，例如 Fiji¹⁷ 和 QuPath¹⁸，然后对图像进行进一步处理，并可以执行细胞类型分类和其他测量，如强度和距离计算。总而言之，本协议使我们能够对再生皮肤的主要细胞类型进行详细、高效的表征，特别关注外周神经胶质细胞群周围的细胞微环境。

Protocol

所有动物育种、饲养和实验均按照瑞士苏黎世州兽医办公室的指导方针进行。

1. 全层皮肤伤口（第 0 天）

1. 用70%O₂ 中的5%异氟醚诱导8-10周龄小鼠，并使用2.5%异氟醚维持它。
2. 剃掉背部皮肤并彻底清洁。
3. 手术前使用抗菌肥皂和 70% EtOH 溶液进行消毒。
4. 使用皮下注射丁丙诺啡（30μg∙mg∙kg⁻¹）进行术前镇痛。
5. 在每只动物的下背部皮肤上产生四个直径为5毫米的圆形全层切除伤口，每侧两个，距动物中线1厘米，彼此相距约2厘米¹⁹.
6. 通过饮用水（9 μg/mL 和 2% 蔗糖）对丁丙诺啡进行 3 天的术后镇痛。
7. 让伤口愈合，无需包扎。
8. 在规定的时间点收集伤口进行组织学检查和流式细胞术分析。
9. 对于IBEX方案，用4%多聚甲醛（PFA）溶液在4°C下解剖并固定皮肤组织过夜。使用市售的活检胶囊来防止样品在固定过程中卷曲。在 4 °C 下冷冻保护 30% 蔗糖中的 4% PFA 固定组织在 PBS 中过夜。 将组织转移到30%蔗糖与O.C.T化合物的1：1混合物中，在室温下2小时，最后包埋在O.C.T中，然后在异戊烷中快速冷冻。

2. 样品制备（第 1 天）

1. 在摇床上用 200 μL 铬明矾明胶涂覆 24 孔板 15 分钟。然后，完全去除明胶，并在40°C的烤箱中干燥包被的孔60分钟。将所需的水井涂成双倍作为备用。每孔加入 2 mL PBS。
   注意：在放置纸巾之前，确保涂层完全干燥。孔也可以在前一天涂覆并在室温下干燥过夜。包被后，请勿将包被孔存放在冰箱或冰柜中，为获得最佳效果，请在 1-2 天内使用包被的 24 孔板。
2. 在低温恒温器上将 O.C.T 包埋的组织切割成 15-30 μm 的厚度，并将其快速转移到含有 2 mL PBS 的包被孔中。
   注意：可以使用金属刮刀或镊子转移组织。
3. 使用 1 mL 移液器小心地取出 PBS，旨在使组织切片保持在孔的中心。为了有效地做到这一点，请从孔的边缘缓慢吸出 PBS，根据需要调整移液器位置以防止组织移动。
   注意：组织的精确放置对于方案的成功至关重要。一旦组织粘附在涂层表面上，就无法重新定位。
4. 将组织切片在37°C烘箱中干燥1小时。

3. 组织阻断、EdU Click-iT 反应和抗体免疫标记，IBEX 第 1 周期（第 1 天）

1. 用 1 mL PBS 再水化 5 分钟。
2. 在室温下用 500 μL PBS 中的 0.5% Triton 透化组织 30 分钟。
3. 用PBS短暂洗涤组织2次。
4. 根据制造商的说明，在室温下进行 Click-iT 反应 30 分钟。
   注意：保持样品避光。
5. 用PBS短暂洗涤组织2次。
6. 使用封闭缓冲液在室温 （RT） 下封闭组织 1 小时。
   注意：在这里，本实验使用了PBS中的10%驴血清，但可以根据需要进行调整;任何与标准免疫标记方案兼容的封闭缓冲液都是合适的。
7. 在4°C下将一抗（在封闭缓冲液中稀释;参见 材料表）用于第一个循环。
   注意：也可以使用非加热微波进行阻断和免疫标记~1小时，如Radtke等人¹²中所述。然而，对于皮肤伤口，当一抗孵育过夜时，可以获得最佳的信噪比。免疫标记的组织切片可以在成像前在PBS中储存数天。建议在第二天进行成像以获得最佳信号质量。

4. 二抗免疫标记和核复染（第 2 天）

1. 用 3 x 1 mL PBS 洗涤孔。
2. 将组织切片与抗兔二抗染色（1：300）在封闭溶液中，与核复染剂Hoechst 1：1,000一起在室温下在黑暗中孵育1小时。
3. 在室温下用 1 mL PBS 洗涤 3 x 5 分钟。
4. 在每个孔中留下~500μL的PBS，并将板带到显微镜下。
   注意：这可能是一个暂停点：样品在4°C下稳定数天，但在免疫标记后24小时内成像时，信噪比最佳。

5. 第一个 IBEX 周期的显微镜设置和成像（第 2 天）

1. 登录显微镜并加载软件，然后登录用户配置文件。
2. 进入采集设置（通过 筛选 |采集设置）用于协议配置和图像采集。
3. 使用 “弹出 ”按钮将板加载到显微镜中。
4. 在将板放入显微镜之前，用70%乙醇清洁24孔板的底部。单击 “加载 板”按钮将板加载到显微镜中。
5. 在 物镜和相机下选择所需的放大倍率和采集模式。作为 采集 模式，选择 共聚焦 51 μm 狭缝 模式。
   注意：在这里，实验使用数值孔径为0.95的20倍水浸物镜和具有50μm针孔的旋转盘，间隔为250μm。
6. 在 “板” 选项卡下，选择使用的板模型。
7. 转到 “板块/访问站点 ”选项卡。在 “站点选项 ”下，单击 “固定站点数”。 选择列数和行数，以便大致覆盖整个井。点击 网站重叠 10%。
   注意： 需要激活此按钮以确保各个瓷砖的拼接。
8. 通过 右键单击 井图上的相应井，仅选择第一个填充井进行采集。选定的井是绿色的，取消选择的井是灰色的。
9. 通过 左键单击 板图中的第一个填充孔和站点图中中心附近的位点，将载物台移动到组织应位于的位置。寻找指示当前位置的井和站点的较深颜色。
10. 转到 获取 选项卡。选择 启用基于激光的聚焦 和采集Z系列选项 。
11. 转到 采集/自动对焦 选项卡。对于 “井到井自动对焦”， 选择“ 聚焦在板和井底” 选项，对于“ 站点自动对焦”， 选择“ 所有站点 ”选项。
12. 转到 “波长” 选项卡，然后选择当前周期中要成像的染料数量。查找在 “波长” 选项卡下方打开的相应数量的新选项卡。
13. 转到第一个波长选项卡。在 “照明”下， 选择最适合目标荧光团的滤光片设置（例如，如果使用 Hoechst，则选择 DAPI ）。
14. 选择 “具有 z 偏移的激光” 作为 z 定位， 然后单击 “ 计算偏移 ”按钮以设置正确的成像高度。将在不同的 z 位置采集一系列图像。选择样品最聚焦的那个。
    注意： 确保载物台位置设置为有纸巾的位置。如果在此位置看不到组织，请 选择 其他部位并重试（参见步骤 4.9）。
15. 按下 对焦 按钮并等待显示组织的对焦图像。
16. 对于“照明功率”，选择 50%。为目标最大强度输入 2000，然后按自动曝光自动调整曝光时间。
    注意：为了加快采集速度，可以增加激光功率，这应该会减少曝光时间。但是，这可能会导致更多的照片漂白，从而导致各个图块重叠的图像伪影。
17. 对于 Z 系列，选择 Z 系列和 2D 投影图像，对于阴影校正，选择仅 FL 阴影。
18. 对其他波长重复步骤 5.13-5.17，但不要选择 具有 z 偏移的激光， 而是 从 W1 选择 Z 偏移 并选择 0。
19. 转到 Z 系列 选项卡。输入所需的步长（对于 20 倍物镜，使用 0.5 μm 的步长）。
    注意：可以通过使用推荐值的 2-3 倍的步长来提高采集速度。
20. 单击 焦点 按钮并等待标有 当前位置 的箭头出现。
21. 单击“ 开始直播 ”并等待出现包含实时图像的新窗口。拖动 当前位置 箭头，直到到达组织底部，然后单击“ 设置 B ”按钮。拖动 当前位置 箭头，直到到达组织顶部，然后单击“ 设置 T ”按钮。单击 F2：停止。
    注意：可以在有源波长下选择用于实时成像的波长。
22. 选择要收购的站点;首先，通过左键单击舞台并确保舞台位于第一个井上，然后再次按 Start Live。通过左键单击站点地图中的不同站点，转到井内的不同位置。找到组织的边界，并通过右键单击标记所有包含组织的部位进行采集。选定的站点将为绿色，取消选择的站点将为灰色。
    注意：目前，仅对第一个孔执行此作，并确保仅选择第一个孔进行采集。
23. 转到 “运行” 选项卡。对于 “板名”，将其命名为“Cycle{i}_Well{w}_{description}”;将 {i}、{w} 和 {description} 替换为相应的值/描述。
24. 单击 保存协议 并保存它，再次在名称中包含“Cycle{i}_Well{w}”。
25. 为所有其他井设置采集区域。为此，请重复步骤 5.22-5.24。
    注意：对于要采集的每个孔，需要保存一个单独的协议文件。在绘制新的 ROI 之前，请确保激活正确的井。结果应该是每孔一个保存的方案进行采集。这是必要的，因为组织的形状因孔而异。如果孔之间的ROI和z-stack相同，则可以跳过重复步骤5.22-5.24，也可以跳过步骤5.26-5.29。在这种情况下，只需选择所有要成像的孔（参见步骤 5.22），转到 运行 选项卡并按 获取板。
26. 单击 控制 |期刊 |开始录制 ，然后立即 控制 |期刊 |停止录制。 保存创建的日志，并通过 Control |期刊 |编辑日志。
27. 在左侧面板中，找到并双击 Plate Acquisition - Load Protocol From File 和 On Plate Acquisition 将这些步骤添加到日志中;在右侧面板中查找它们。双击添加的 板采集 - 从文件加载方案， 然后选择为第一个孔保存的方案（参见步骤 5.24）。
28. 对要采集的每个孔重复步骤 5.27，始终加载相应的方案。
29. 单击 “保存” ，最后单击“ 运行日志 ”以开始采集（需要大约 3 小时才能采集 180 个具有 15 μm z 堆栈的图块）。

6. 荧光团漂白（第 2 天）

1. 在日志结束前大约 30 分钟，准备漂白试剂。将 10 mg 硼氢化锂溶解在 10 mL ddH₂O 中，并通过 0.22 μm 过滤器。静置 10 分钟，等待气泡形成。为确保高效漂白，请在制备后 4 小时内使用漂白试剂。
   注意： 处理硼氢化锂时，请在化学罩下工作，因为它会与空气发生反应并可能产生易燃的氢气。
2. 用 1 mL 1 mg/mL 硼氢化锂漂白荧光团 15 分钟，同时暴露在标准环境照明下。在漂白过程中寻找组织上的小气泡。
   注意： 在化学罩下工作时，请确保在漂白过程中照明不会自动关闭。
3. 用另外 1 mL 1 mg/mL 硼氢化锂（由同一溶液制备）重复漂白 15 分钟。
4. 用 1 mL PBS 洗涤孔 3 x 5 分钟。
   注意：不要缩短洗涤时间，因为漂白试剂的不完全去除可能会损坏下一组抗体。

7. IBEX 周期（第 2 天）

1. 将一抗应用于下一个免疫标记周期（步骤3.7）并在4°C下孵育过夜。重复步骤 4.4-5.4。
   注意：步骤4.2-4.3不重复，因为未偶联的兔抗体仅在第一个IBEX循环中使用。然而，在鸡或豚鼠等不太常见的物种中培养的非偶联抗体也可以在以后的周期中使用，因为它们的二抗不会与偶联的一抗发生交叉反应。每个周期中使用的抗体的确切详细信息可以在 材料表中找到。
2. 在显微镜上，通过单击加载 协议， 加载相应孔的上一个 IBEX 循环的协议设置，该协议保存在本地 PC 上作为 Cycle{i}_Well{w}（步骤 5.24）。协议设置将包含 ROI（要采集的选定图块）、放大倍率、自动对焦设置以及从上一个 IBEX 周期保存的任何其他采集设置（步骤 5.5-5.25）。
3. 选择 波长选项卡 并调整新抗体组的曝光和照明功率（步骤 5.12-5.18）。请务必在所有周期中对一个标记（通常是 DAPI 或 Hoechst）进行成像，以便之后对齐周期。
   注意：正如Radtke等人¹⁸中报道的那样，常用的荧光蛋白，如GFP和tdTomato，对硼氢化锂漂白不敏感。当处理含有内源性荧光蛋白（如tdTomato）的组织时，如果图像配准不需要相应的波长，则可以在第1周期后的采集中省略相应的波长，这将加快成像速度。可以通过减少采集通道的数量在“ 总波长” 选项卡中删除波长。此外，在成像周期中未观察到组织自发荧光的持续增加;然而，这可能会因组织类型而异¹⁸.
4. 检查 z-Stack 设置是否仍然合理并进行相应调整（步骤 5.19-5.21）。
   注意：确保所有循环的 z 堆栈的步长相同。
5. 更新“运行”选项卡中的“板名称”，然后重新保存“协议”。
6. 对要采集的所有孔重复步骤 7.2-7.5。
   注意： 建议记下第一个孔中使用的所有波长的 曝光 设置，并在所有后续孔中使用相同的设置。
7. 编辑日志，选择新的协议文件，并保存此周期的日志。
8. 运行 日记帐。
9. 重复步骤 6.1-6.4 以漂白荧光团。
10. 重复步骤 7.1-7.9，直到达到所需的免疫标记量。

8. 图像处理（第 2 天）

1. 完成 IBEX 循环的图像采集后，导出图像数据：
   1. 选择 筛选 |板数据实用程序 |导出图像。
   2. 单击 选择板 ，为每个循环和孔选择所有获取的板。
   3. 选择 “所有 Z 平面”， 选择一个输出目录，然后按 “确定” 导出数据。
      注意：数据将导出为每个图块和平面的单独 tiff 文件。为了组合所有图块和循环，执行了以下处理步骤。
2. 根据以下方案将导出的数据排列在文件夹中：确保每个循环都是一个文件夹，每个循环包含每个孔的文件夹。命名如下：“\cycle{i}\{well}\*_Plate_*”，其中 {i} 和 {well} 是相应的循环和井，* 是任意字符。例如：“\cycle1\A01\some_name_Plate_8654”
   注意：后续处理步骤需要正确的命名和文件夹结构。
3. 安装必要的 python 包：使用 Miniforge 管理 Python 环境。有关安装说明，请参阅 https://github.com/conda-forge/miniforge。
   注意：处理步骤的代码以 Jupyter Notebooks 的形式提供。它们可以在 https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove 或作为补充文件（补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3、补充文件 4 和 补充文件 5）找到。
4. 从 Github 下载代码时，单击代码 |下载 ZIP 并按照 README.md 文件中的安装说明进行作。
5. 启动 Jupyter-Lab（补充文件 2）：
   1. 通过在终端中输入 conda activate zmb-ibex-jove 来激活已安装的 conda 环境。
   2. 在终端中，通过输入 cd C：\path\to\zmb-ibex-jove 等方式更改到下载的目录。
   3. 通过在终端中输入 jupyter-lab 来启动 Jupyter-Lab。将打开一个浏览器窗口，其中包含 jupyter-lab。
6. 计算照度校正：
   1. 在左侧选项卡上，导航到“ examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb”笔记本，然后 双击 将其打开。本笔记本将使用 BaSiCPy 库（补充文件 3）计算照明校正图像。
   2. 将“base_dir”和“save_dir”更改为正确的路径，数据所在的位置以及应保存照明校正图像的位置。
   3. 若要在笔记本中运行代码， 请选择 每个单元格并按 Shift+Enter 执行它。从上到下运行笔记本。
7. 为每个单独的周期进行缝合（补充文件 4）：
   1. 在左侧选项卡上， 导航 到下一个笔记本并将其 打开 ：“02_stitching_MD.ipynb”。在此笔记本中，对于每个周期，加载各个图块、校正照明并拼接在一起，从而产生每个孔和周期一个图像文件。使用 m2stitch 库 （https://github.com/yfukai/m2stitch） 进行拼接。
   2. 将第一个单元格中的输入更改为正确的文件路径。从上到下再次 执行 笔记本。
8. 在周期之间执行图像配准（补充文件 5）：
   1. 在左侧选项卡上，导航 到下一个笔记本并将其 打开 ：“03_registration_pcc.ipynb”。在此笔记本中，各个循环仅使用平移变换相互对齐，这些转换是使用开放获取 scikit-image 库 （https://scikit-image.org/） 中的相位互相关算法计算的。
   2. 将第一个单元格中的输入更改为正确的文件路径。选择要使用的参考周期和参考通道（通常是 DAPI）。从上到下再次 执行 笔记本。
      注意：只需执行“选项 1：一起加载并保存所有通道”和“选项 2：将通道加载并保存为单独的文件”中的一章。第一章将创建一个大文件，包含所有周期的所有通道。第二章将为每个通道创建一个单独的文件。第二个选项将需要更少的内存来处理。

9. 图像分析（第 2 天）

1. 下载 并打开 斐济 （https://imagej.net/software/fiji/downloads）。
   注意：生成的图像将是多平面和多通道图像，可以作为 3D 图像进行分析。这里仅显示了 2D 数据的示例分析工作流程，首先计算最大强度投影。
2. 通过将文件拖到斐济窗口中打开斐济的文件。
3. 通过选择 “图像 |堆栈 |Z 项目...，选择 最大强度，然后按 确定。通过文件重新保存图像 |另存为 |OME-TIFF“。
4. 要分析细胞，请使用开源软件 QuPath;从 https://qupath.github.io/ 下载并安装它。
5. 打开 QuPath 并通过将一个空文件夹拖到窗口上来创建一个新项目。
6. 将所有文件拖到 QuPath 窗口中，然后按标准设置的 Import 将所有文件导入到项目中。
7. 双击左侧面板上的图像将其打开。出现提示时将其指定为荧光。
8. 按 Shift+C 打开“亮度/对比度”窗口。
   注意： 在这里，可以选择显示哪些通道，并调整亮度和对比度。还可以通过双击名称来更改频道名称和颜色。
9. 选择工具 |Polygon 工具并注释组织区域。在“注释”选项卡下查找新注释。通过选择注释，选择一个类（例如，其他），然后按“设置类”，将其设置为特定类。
10. 检测细胞：转到 分析 |细胞检测 |细胞检测。
    1. 选择核通道。
    2. 保留大多数设置，但通过将鼠标悬停在核心上并注意右下角显示的强度来调整 阈值 。将鼠标悬停在背景区域上并再次注意强度。选择背景和前景之间的一个值作为阈值。
    3. 单击 运行。
11. 检查细胞和测量值：
12. 通过 双击 单元 格 或在“ 层次结构 ”选项卡中选择它，在左下角面板中检查其测量值。应为细胞、细胞核和细胞质添加不同的形状和强度测量。
13. 对细胞进行分类：
    1. 要根据通道中的强度对检测到的细胞进行分类，请转到 分类 |对象分类 |创建单个测量分类器。
    2. 在 通道过滤器 下选择所需的通道，在 测量 下选择适当的测量值（例如， 单元格：通道平均值）。
    3. 通过再次将鼠标悬停在正单元格和负单元格上并选择两者之间的值来调整阈值。
    4. 例如，选择“ 正” 表示 高于阈值 ，选择“ 负数 ”表示 低于阈值。通过检查实时 预览来检查结果。
    5. 按 “应用” 对单元格进行分类。
14. 测量到带注释的物体（例如神经束）的距离：
    1. 选择 工具 |画笔 工具。
    2. 绘制感兴趣的区域（例如，神经束）。
    3. 转到 注释选项卡 。选择所有新注释，选择相应的类，然后按 设置类。
       注意：可以通过在类窗口中 右键单击 并选择添加 /删除 |添加类。
    4. 转至 分析空间分析 |到注释 2D 的符号距离 ，并在出现提示时按 是 。
    5. 向每个单元格添加一个新的测量值，指示到给定类的最近注释的距离。
15. 导出测量：
    1. 转到 测量 |显示检测测量值 ，并等待出现所有检测的所有测量值的列表。
    2. 通过 “保存” 按钮将表导出为.txt。
    3. 将数据导入所选的数据处理软件以进行进一步分析。

Results

该方法通过将 EdU Click-iT 化学与 IBEX 相结合，在固定的冷冻小鼠皮肤切片中充分检测增殖的细胞类型。使用不同的方法比较增殖细胞类型的检测，特别是用 Ki-67 抗体标记增殖细胞类型和使用 EdU Click-iT 化学方法检测细胞增殖（图 1）。我们观察到Ki-67抗体标记低估了固定冷冻小鼠皮肤切片中增殖细胞的数量（图1B，D），而EdU掺入充分反映了增殖细胞的数量（图1A，C）。将EdU掺入获得的结果与流式细胞术结果（图1G）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的Ki-67免疫标记（图1E-G）进行比较。这些结果表明，由于抗原修复不足，固定冷冻小鼠皮肤...

Discussion

细胞增殖是皮肤修复的四个主要阶段之一，炎症期和增殖期之间的过渡对于成功的修复过程至关重要²⁰。良好调节的免疫反应至关重要，因为长期炎症会导致慢性伤口，这是一个重大的全球健康问题 ^1,21。增殖是一个关键的生物过程，不仅对组织修复很重要，而且对生物体发育和疾病评估（包括致癌作用）也很重要。存在多种测量细胞增殖的方法，可以通过计数细胞间接或直接通过使用 Ki-67 或 DNA 掺入试剂等标记物进行免疫标记。Ki-67免疫标记作为诊断工具被广泛使用，导致了Ki-67标记指数的发展，该指数应用于癌症患者的诊断和预后22,23,24。

在该协议中，我们使用成熟的细胞周期标记Ki...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗体和试剂	源	标识符	评论
<强>抗体<强/强力抗体>
CD31 Alexa Fluor 647（第二周期）	生物传说	猫#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488（第二周期）	生物传说	猫#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC（第一周期）	生物传说	猫#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67 鸡肉（ck）	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 老鼠（现役）及nbsp;	生物传说	猫#652402	1:100
AB_11204254
神经丝H&M（NF-H/NF-M）Alexa Fluor 647（第三周期）	生物传说	猫#837710	1:300
AB_2734613
第75NTR（第一季）	细胞信号传导技术	猫#8238                      AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488（第三周期）	生物传说	猫#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 驴反兔子	杰克逊免疫研究	猫#711-605-152
Reagentsnbsp;
Cellvis 24孔玻璃底板	塞尔维斯	P24-1.5H-N
铬明矾明胶	新来者供应	猫#1033A
Click-iT 教育大学套件	赛莫飞世尔科学	C10637
霍赫斯特 33342	西格玛-奥尔德里奇	目录#14533;CAS# 23491-52-3
LiBH4，硼氢化锂，95%	赛莫飞世尔科学	猫#10438443
组织技术 O.C.T 复合体樱花	瑞士生物系统公司	猫#7109-4583
PBS	赛莫飞世尔科学	编号#10010-015
Superfrost Plus附着显微镜载玻片及nbsp;	埃普雷迪亚	猫#J1800AMNZ
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	猫#T8787
<强壮>装备
梳子	浮士德股份公司	猫#9172051和9172050
切片刀和nbsp;	瑞士生物系统公司	猫#207500011
显微镜	分子器件，ImageXpress共焦点 HT.ai
烤箱	赛莫飞世尔科学	猫#HBMCR4220
摇臂摇床	埃德蒙·布姆尔;hler 有限公司	猫#32310015