该方案采用非侵入性粪便采样结合定量聚合酶链式反应，为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染及其对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药性提供了一种便捷且快速的诊断方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
检测 幽门螺杆菌 通过粪便定量聚合酶链式反应分析检测感染与抗生素耐药性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Helicobacter pylori（H. pylori）在全球范围内广泛流行，全球约有50%的人口曾感染过H. pylori。在中国，感染率介于40%至70%之间。H. pylori 主要与慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等胃肠道疾病相关。目前，临床上治疗H. pylori 感染主要采用三联或四联疗法。然而，抗生素的广泛使用已导致H. pylori 产生抗生素耐药性。因此，检测H. pylori 及其抗生素耐药性对于指导临床治疗至关重要。
幽门螺杆菌（H. pylori）的诊断方法包括尿素呼气试验（UBT）、抗原检测、血清抗体检测、内镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。前三种方法为非侵入性，但无法获得活菌，因此不能用于耐药性检测；后三种方法属于侵入性操作，成本较高，需要较高的技术操作水平，且可能对患者造成一定伤害。
因此，一种能够同时无创、快速检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染及其抗生素耐药性的方法，对于有效根除H. pylori具有极为重要的临床意义。本文旨在介绍一种结合定量聚合酶链式反应（qPCR）与TaqMan荧光探针技术的特定实验方案，用于快速检测H. pylori感染及其耐药性。与传统的细菌培养及其他检测技术相比，该方法为诊断H. pylori感染和耐药性提供了便捷、快速且无创的手段。通过qPCR技术可确认感染状态，并检测23S rRNA基因和gyrA基因的突变，分别对应克拉霉素和喹诺酮类抗生素的耐药性。相较于传统的培养方法，该技术为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染的检测及其抗生素耐药性的判定提供了一种无创、经济且高效的方法。
引言
Helicobacter pylori 是一种革兰氏阴性、螺旋形细菌，可长期感染人类胃黏膜上皮1。1994年，世界卫生组织将 H. pylori 列为胃癌的I类致癌物，约有3%的感染者最终会发展为该疾病2。最近一项发表的系统综述表明，在过去十年中，H. pylori 的抗生素耐药率总体呈上升趋势，已在全球范围内达到令人担忧的水平，尤其是克拉霉素耐药3。在中国，最新的调查数据显示，中国城市居民中 H. pylori 的总体感染率为27.08%；克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率分别为50.83%和47.17%4，高于美国（左氧氟沙星37.6%，克拉霉素31.5%）5 和欧洲（左氧氟沙星15.8%，克拉霉素21.4%）6。因此，早期且准确的诊断与治疗至关重要。然而，H. pylori 日益增长的抗生素耐药性显著降低了治疗效果，凸显了持续开展其诊断与治疗研究的紧迫性。
幽门螺杆菌（H. pylori）的诊断方法分为侵入性和非侵入性技术7。侵入性方法包括....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理指南（批准号：KY2024-445-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、仪器设备和软件）的详细信息，见于 材料表.
1. 受试者选择
- 选择年龄在18至60岁之间的受试者。
- 选择可能需要进行幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染筛查的受试者，例如出现胃炎、消化性溃疡或消化不良等症状的患者，以及无症状个体。
- 排除在过去一个月内使用过抗生素、含铋制剂（如枸橼酸铋钾胶囊、胶体果胶铋胶囊或铝铋镁片）或具有抗菌作用的中药的患者，以及在近两周内使用过质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂（如奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、西咪替丁或尼扎替丁）的患者。同时排除处于月经期的女性。
2. 粪便样本的采集
注意：将第2部分作为指导说明提供给参与者。
- 确认采样 kit 的外包装完好无损且在有效期内。从 kit 中取出材料。
- 将一张白色粪便采集纸置于马桶内，排便（避免粪便被尿液污染）。
- 使用刮匙采集约蚕豆大小（约 5 g）的粪便样本，并转移至样本容器中。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
应用qPCR进行检测 幽门螺杆菌 粪便样本中的感染与抗生素耐药性
我们根据保守基因中的点突变设计了引物和探针 幽门螺杆菌，以及23S rRNA基因和 gyrA 基因。这些引物和探针用不同的荧光染料标记后用于qPCR检测。qPCR实验的质量控制结果均在推荐范围内，表明检测结果可靠（图1）。在本研究中，我们选取了五个代表性样品（S1-S5），以表征实验方案的可靠性（图2 和 表1）。S1 是一个不含 H. pylori 感染，而S2-S5是具有不同耐药谱的样本。
对于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
近年来，分子检测方法已广泛应用于微生物学领域，显著改变了多种感染性疾病的临床管理方式。这些方法在基因水平上进行操作，不仅能够确认细菌的存在，还可进行基因分型和抗生素耐药性检测。实时荧光定量PCR（qPCR）因其处理时间短、灵敏度高、准确性好以及交叉污染风险低而日益受到青睐，目前已在临床实验室中广泛用于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染的诊断。
将粪便样本采集保存液与基因检测方法相结合，可实现对幽门螺杆菌（H. pylori）的快速高效筛查，并通过分析克拉霉素23S rRNA基因和喹诺酮类gyrA基因的突变，进一步开展抗生素耐药性检测。该方法可用于评估幽门螺杆菌（H. pylori）对药物的敏感性和耐药性。既往的粪便抗原检测方法存在明显局限性，例如由于样本中抗原浓度较低以及抗原降解，导致检测准确性和稳定性下降。此外，传统抗原检测方法在复杂样本中可能缺乏足够的灵敏度和特异性，从而影响结果的可靠性。
为解决这些问题，我们提出一种将粪便样本与.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由以下机构资助： 广东省人民医院高层次人才科研基金［编号 KY012023293]。本研究由江苏莫勒生物科技有限公司资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未参与。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | 生物安全柜 |
| 一次性粪便采集与保存管 | Mole | 采集粪便样本 | |
| E-Centrifuge | WEALTEC | 离心去除管壁残留液体 | |
| 幽门螺杆菌核酸、克拉霉素及喹诺酮类耐药突变检测试剂盒 | Mole | 检测幽门螺杆菌感染及抗生素耐药性；冻干型H. pylori试剂（含引物、探针、Taq DNA聚合酶、UNG酶、dNTPs等）、幽门螺杆菌阳性对照（含幽门螺杆菌及人β-actin靶基因），以及幽门螺杆菌阴性对照（含人β-actin靶基因） | |
| Mole 96M全自动核酸提取仪 | Mole | 用于DNA提取 | |
| 核酸提取试剂盒 | Mole | 用于提取核酸；包含裂解缓冲液（胍盐、三羟甲基氨基甲烷、Tween-20、氯化钠）、洗涤缓冲液1（氯化钠）、洗涤缓冲液2（三羟甲基氨基甲烷、Tween-20）、洗涤缓冲液3（磁珠、Tween-20）、洗涤缓冲液4（无核酸酶水）和洗脱缓冲液（三羟甲基氨基甲烷），以及磁力架 | |
| SLAN全自动医用PCR分析系统 | HONGSHI | 数据分析 | |
| SLAN-96S实时荧光定量PCR仪 | HONGSHI | 荧光定量PCR扩增 | |
| 超低温冰箱（DW-YL450） | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C用于试剂储存 |
| Vortex-5 | Kylin-bell | 用于试剂混匀 |
参考文献
- Yuan, C., et al. The global prevalence of and factors associated with Helicobacter pylori infection in children: a systematic review and meta-analysis. Lancet Child Adolesc Health. 6 (3), 185-194 (2022).
- Watari, J., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
