检测 幽门螺杆菌 通过粪便定量聚合酶链式反应分析检测感染与抗生素耐药性

摘要

该方案采用非侵入性粪便采样结合定量聚合酶链式反应，为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染及其对克拉霉素和喹诺酮类药物的耐药性提供了一种便捷且快速的诊断方法。

摘要

Helicobacter pylori（H. pylori）在全球范围内广泛流行，全球约有50%的人口曾感染过H. pylori。在中国，感染率介于40%至70%之间。H. pylori 主要与慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等胃肠道疾病相关。目前，临床上治疗H. pylori 感染主要采用三联或四联疗法。然而，抗生素的广泛使用已导致H. pylori 产生抗生素耐药性。因此，检测H. pylori 及其抗生素耐药性对于指导临床治疗至关重要。

幽门螺杆菌（H. pylori）的诊断方法包括尿素呼气试验（UBT）、抗原检测、血清抗体检测、内镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。前三种方法为非侵入性，但无法获得活菌，因此不能用于耐药性检测；后三种方法属于侵入性操作，成本较高，需要较高的技术操作水平，且可能对患者造成一定伤害。

因此，一种能够同时无创、快速检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染及其抗生素耐药性的方法，对于有效根除H. pylori具有极为重要的临床意义。本文旨在介绍一种结合定量聚合酶链式反应（qPCR）与TaqMan荧光探针技术的特定实验方案，用于快速检测H. pylori感染及其耐药性。与传统的细菌培养及其他检测技术相比，该方法为诊断H. pylori感染和耐药性提供了便捷、快速且无创的手段。通过qPCR技术可确认感染状态，并检测23S rRNA基因和gyrA基因的突变，分别对应克拉霉素和喹诺酮类抗生素的耐药性。相较于传统的培养方法，该技术为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染的检测及其抗生素耐药性的判定提供了一种无创、经济且高效的方法。

引言

Helicobacter pylori 是一种革兰氏阴性、螺旋形细菌，可长期感染人类胃黏膜上皮¹。1994年，世界卫生组织将 H. pylori 列为胃癌的I类致癌物，约有3%的感染者最终会发展为该疾病²。最近一项发表的系统综述表明，在过去十年中，H. pylori 的抗生素耐药率总体呈上升趋势，已在全球范围内达到令人担忧的水平，尤其是克拉霉素耐药³。在中国，最新的调查数据显示，中国城市居民中 H. pylori 的总体感染率为27.08%；克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率分别为50.83%和47.17%⁴，高于美国（左氧氟沙星37.6%，克拉霉素31.5%）⁵ 和欧洲（左氧氟沙星15.8%，克拉霉素21.4%）⁶。因此，早期且准确的诊断与治疗至关重要。然而，H. pylori 日益增长的抗生素耐药性显著降低了治疗效果，凸显了持续开展其诊断与治疗研究的紧迫性。

幽门螺杆菌（H. pylori）的诊断方法分为侵入性和非侵入性技术⁷。侵入性方法包括组织病理学检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养⁸。组织病理学检查依赖于活检样本的处理和显微镜下观察，其准确性受限于组织学制备质量和病理学专家的经验⁹。RUT通过检测尿素酶活性来识别H. pylori，该酶可水解尿素生成氨，导致试剂发生碱性变化，从而指示细菌的存在⁹。该方法操作简便且成本较低。细菌培养被视为“金标准”，但由于H. pylori独特的生理特性，其成功率通常低于50%¹⁰。

非侵入性方法包括¹³C/¹⁴C尿素呼气试验（UBT）、血清学诊断和粪便抗原检测（SAT）¹¹。呼气试验的原理与RUT类似，通过检测呼出气体中同位素标记的CO₂来确认感染¹²。血清学诊断可检测抗体，但这些抗体在细菌根除后仍可能持续存在，因此难以评估治疗效果¹³。粪便抗原检测可检测粪便样本中幽门螺杆菌（H. pylori）特异性抗原，是一种可靠的非侵入性方法，假阳性率较低，对活动性感染的诊断具有良好的准确性¹⁴。

每种诊断方法都有其优势和局限性¹⁵。除细菌培养外，其他方法在检测抗生素耐药性方面存在困难，而培养法又受限于较低的成功率¹⁶。近年来，实时定量PCR（qPCR）等分子诊断方法已广泛应用于微生物检测¹⁷。qPCR可准确检测H. pylori，并分析耐药基因突变，从而提供对感染更全面的认识¹⁸。

荧光探针被设计用于在qPCR过程中特异性结合DNA中的靶序列。这些探针通常标记有荧光染料，当探针与其靶序列结合并在扩增过程中被聚合酶切割时，会发出信号。这可实现对PCR过程的实时检测。由于探针具有独特的设计，荧光探针以其高特异性著称，可确保仅检测目标DNA序列，降低非特异性结合的可能性，从而提高检测的特异性。这使得荧光探针技术在检测低丰度靶标（如粪便样本中的Helicobacter pylori DNA）时尤为有用。虽然SYBR Green是PCR中常用的一种DNA结合染料，但它可结合任何双链DNA，可能导致非特异性扩增和假阳性结果。

从临床样本中培养Helicobacter pylori无法直接提供抗生素耐药性数据。相比之下，基于荧光探针的qPCR技术更快捷、更方便，并可适用于同时检测H. pylori及抗生素耐药标志物。该方法不仅比传统培养方法获得结果更迅速，还可同时检测抗生素耐药基因，显著提高检测效率与便利性。与传统的细菌培养及其他技术不同，该方法为诊断H. pylori感染及其耐药性提供了便捷、快速且无创的途径。

对于H. pylori的抗生素耐药性，需要考虑两个关键问题：i) 基因型与表型的一致性，ii) 多重耐药性。中国一项大规模多中心研究发现，克拉霉素与左氧氟沙星的双重耐药模式比例为26.1%。克拉霉素和左氧氟沙星耐药的H pylori表型与基因型之间表现出良好的一致性（Kappa系数分别为0.810和0.782）¹⁹。因此，采用qPCR方法检测H. pylori感染及药物耐药性是可行的。由于采样便捷，粪便抗原检测（SAT）和qPCR方法正被越来越多地使用。各种方法在H. pylori检测中的敏感性、特异性和准确性顺序如下：qPCR > UBT > SAT > RUT> CagA IgG > 培养²⁰。所有非侵入性方法均适用于初筛。由于qPCR还可额外检测耐药基因，因此qPCR和培养更适用于指导治疗。

其他创新方法，例如结合内窥镜图像的人工智能（AI）算法²¹、数字微流控技术²²以及RPA-CRISPR/Cas12a²³，理论上显示出良好的诊断效率和广阔的应用前景。然而，目前qPCR是最为成熟的分子生物学技术，有望为幽门螺杆菌（H. pylori）感染的诊断与治疗提供更优的解决方案。

方案

本研究遵循中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会制定的伦理指南（批准号：KY2024-445-01）。有关本研究中所用材料（试剂、化学品、仪器设备和软件）的详细信息，见于 材料表.

1. 受试者选择

1. 选择年龄在18至60岁之间的受试者。
2. 选择可能需要进行幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染筛查的受试者，例如出现胃炎、消化性溃疡或消化不良等症状的患者，以及无症状个体。
3. 排除在过去一个月内使用过抗生素、含铋制剂（如枸橼酸铋钾胶囊、胶体果胶铋胶囊或铝铋镁片）或具有抗菌作用的中药的患者，以及在近两周内使用过质子泵抑制剂或H2受体拮抗剂（如奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、西咪替丁或尼扎替丁）的患者。同时排除处于月经期的女性。

2. 粪便样本的采集

注意：将第2部分作为指导说明提供给参与者。

1. 确认采样 kit 的外包装完好无损且在有效期内。从 kit 中取出材料。
2. 将一张白色粪便采集纸置于马桶内，排便（避免粪便被尿液污染）。
3. 使用刮匙采集约蚕豆大小（约 5 g）的粪便样本，并转移至样本容器中。
4. 将采样刮匙连同粪便样本一起放入采集管中，确保液面上升至管壁标注的采样线附近。
5. 牢固拧紧管盖。反复倒置管体数次，确保样本与保存液充分混匀。
6. 将样本冷藏保存，直至送至临床实验室，用于后续通过 qPCR 检测 H. pylori 及评估抗生素耐药谱型。

3. 核酸提取

注意：为避免污染，所有操作均须在生物安全柜内完成。

1. 倒置样本保存管并充分混匀。取1.0 mL粪便样本溶液转移至微量离心管中。
2. 混匀离心管后，将其置于80 °C金属浴中加热10分钟，在第5分钟时短暂混匀30秒。待管内溶液冷却至室温后，于10,000 × g 离心5分钟，收集上清液用于后续处理。
3. 反复倒置96孔板以重悬磁珠。小心移除铝箔封膜，注意避免振荡，防止液体溢出。
4. 向含有裂解缓冲液的96孔板各孔中加入200 µL已制备的样本（来自步骤3.2），确保每孔对应一个独立样本。将96孔板放入核酸提取仪指定的样本舱位，进行自动化核酸提取。
5. 将剩余的原始样本及提取的核酸样本于-20 °C保存，用于长期储存和后续使用。

4. qPCR检测 幽门螺杆菌 核酸以及对克拉霉素和喹诺酮类的耐药突变

1. 从试剂储存区取出试剂，并在室温下解冻。
   注意：本试剂盒用于幽门螺杆菌（H. pylori）核酸的定性检测，包括23S rRNA基因（A2143G、A2143C、A2144G）和gyrA基因（261A、261G、260T、271A、271T、272G）的突变检测。试剂盒中包含引物、探针、Taq酶、UNG酶和dNTPs。阳性对照包含H. pylori靶基因和人β-actin基因。选择人β-actin基因作为内参对照。
2. 根据待检测样本数量，使用N + 2份冻干试剂，其中N表示待测样本数，2表示阴性和阳性质控样本。
3. 短暂离心，确保冻干粉末沉降至管底。打开冻干试剂管盖（注意避免粉末洒出），向每孔中加入25 µL待测样本提取的核酸，以及阳性和阴性对照。盖紧管盖。
4. 涡旋振荡PCR试剂8–10秒，然后短暂离心3–5秒，以避免气泡产生。
5. 将96孔qPCR板放入qPCR仪中。设置扩增程序如下：首先，在42 °C和95 °C（两个步骤均在一个循环内）分别孵育反应体系2分钟；然后进行10个循环，95 °C变性10秒，65 °C退火延伸45秒；最后进行35个循环，95 °C变性10秒，58 °C退火延伸45秒，完成变性、退火与延伸过程。
6. 设置荧光信号检测参数如下：采用ROX荧光标记H. pylori保守基因；FAM荧光标记H. pylori克拉霉素耐药基因；HEX荧光标记H. pylori喹诺酮类耐药基因；CY5荧光标记人β-actin基因作为试剂盒内参对照。在58 °C时采集数据。反应结束后，确保数据已保存以供后续分析。
7. 使用qPCR专用软件分析数据，仪器将自动设定基线阈值。所有诊断判读标准设定为CT值≤30，包括Helicobacter pylori感染或耐药性的判定，并确认其扩增曲线呈典型的S型曲线。

结果

应用qPCR进行检测 幽门螺杆菌 粪便样本中的感染与抗生素耐药性
我们根据保守基因中的点突变设计了引物和探针 幽门螺杆菌，以及23S rRNA基因和 gyrA 基因。这些引物和探针用不同的荧光染料标记后用于qPCR检测。qPCR实验的质量控制结果均在推荐范围内，表明检测结果可靠（图1）。在本研究中，我们选取了五个代表性样品（S1-S5），以表征实验方案的可靠性（图2 和 表1）。S1 是一个不含 H. pylori 感染，而S2-S5是具有不同耐药谱的样本。

对于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori<...

讨论

近年来，分子检测方法已广泛应用于微生物学领域，显著改变了多种感染性疾病的临床管理方式。这些方法在基因水平上进行操作，不仅能够确认细菌的存在，还可进行基因分型和抗生素耐药性检测。实时荧光定量PCR（qPCR）因其处理时间短、灵敏度高、准确性好以及交叉污染风险低而日益受到青睐，目前已在临床实验室中广泛用于幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染的诊断。

将粪便样本采集保存液与基因检测方法相结合，可实现对幽门螺杆菌（H. pylori）的快速高效筛查，并通过分析克拉霉素23S rRNA基因和喹诺酮类gyrA基因的突变，进一步开展抗生素耐药性检测。该方法可用于评估幽门螺杆菌（H. pylori）对药物的敏感性和耐药性。既往的粪便抗原检测方法存在明显局限性，例如由于样本中抗原浓度较低以及抗原降解，导致检测准确性和稳定性下降。此外，传统抗原检测方法在复杂样本中可能缺乏足够的灵敏度和特异性，从而影响结果的可靠性。

为解决这些问题，我们提出一种将粪便样本与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	生物安全柜
一次性粪便采集与保存管	Mole		采集粪便样本
E-Centrifuge	WEALTEC		离心去除管壁残留液体
幽门螺杆菌核酸、克拉霉素及喹诺酮类耐药突变检测试剂盒	Mole		检测幽门螺杆菌感染及抗生素耐药性；冻干型H. pylori试剂（含引物、探针、Taq DNA聚合酶、UNG酶、dNTPs等）、幽门螺杆菌阳性对照（含幽门螺杆菌及人β-actin靶基因），以及幽门螺杆菌阴性对照（含人β-actin靶基因）
Mole 96M全自动核酸提取仪	Mole		用于DNA提取
核酸提取试剂盒	Mole		用于提取核酸；包含裂解缓冲液（胍盐、三羟甲基氨基甲烷、Tween-20、氯化钠）、洗涤缓冲液1（氯化钠）、洗涤缓冲液2（三羟甲基氨基甲烷、Tween-20）、洗涤缓冲液3（磁珠、Tween-20）、洗涤缓冲液4（无核酸酶水）和洗脱缓冲液（三羟甲基氨基甲烷），以及磁力架
SLAN全自动医用PCR分析系统	HONGSHI		数据分析
SLAN-96S实时荧光定量PCR仪	HONGSHI		荧光定量PCR扩增
超低温冰箱（DW-YL450）	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C用于试剂储存
Vortex-5	Kylin-bell		用于试剂混匀