从肿瘤组织中收集自然释放的外泌体

Jiang Yao; Ping Wu; Qiujing Du; Yong Qing; Junliang Wu; Wenhan Zhao; Shanshan Du; Qijie Li

doi:10.3791/67739

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从肿瘤组织中收集自然释放的外泌体

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DOI：

10.3791/67739

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2025年6月10日

Jiang Yao^*¹ , Ping Wu^*² , Qiujing Du¹ , Yong Qing³ , Junliang Wu³ , Wenhan Zhao¹ , Shanshan Du¹ , Qijie Li¹

¹Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, ²Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, ³Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案展示了一种从肿瘤组织中提取外泌体的新方法，通过使其自然释放并反复收集，为研究外泌体在肿瘤发生发展中的功能提供实验依据。

摘要

作为细胞分泌的囊泡，外泌体包裹并转移多种核酸、蛋白质和脂质，参与不同细胞间的通讯。肿瘤微环境中的外泌体在肿瘤细胞的生物学特性中发挥重要作用，并可显著影响其他细胞的状态。因此，为进一步研究外泌体在肿瘤发展中的特定功能，无疑有必要从肿瘤组织中提取和分离外泌体。直接从肿瘤组织中提取外泌体可减少对体外细胞培养，且来自肿瘤组织的外泌体可能更接近其天然状态。因此，保持肿瘤组织中外泌体的天然状态是提取过程的关键。酶消化法常与超速离心法联合用于从肿瘤组织中提取外泌体。本文提供一种从肿瘤组织提取外泌体的新方法：采用无血清培养基，在摇床上孵育小型肿瘤组织块，反复收集并提取肿瘤组织自然释放的外泌体，并对所提取外泌体的结构、浓度及特性进行鉴定，为研究外泌体在肿瘤发生发展中功能的科研人员提供一种新方法。

引言

外泌体是一类由细胞分泌的细胞外囊泡，其大小通常在30 nm至200 nm之间¹^,²。外泌体参与细胞间的通讯，可将多种信号分子（包括核酸（如脱氧核糖核酸（DNA）、信使RNA（mRNA）、微小核糖核酸（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA））、蛋白质和脂质）传递至受体细胞，从而影响其生理功能¹^,³^,⁴^,⁵，⁶^,⁷。外泌体最初在绵羊网织红细胞中被发现⁸，随后在多种体液中被鉴定出来，包括血液、唾液、尿液、脑脊液、腹水、羊水和乳汁⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶。此外，多种类型的细胞均可分泌外泌体，包括淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、脂肪细胞和肿瘤细胞¹⁷。由于其广泛分布，外泌体在多种病理过程（尤其是癌症）以及多种生理过程（包括胚胎发育、组织修复与再生、免疫调节）中发挥着关键作用¹⁸^,¹⁹^,²⁰。

近年来，外泌体被证实可促进肿瘤的发生、侵袭、转移、化疗耐药以及抗肿瘤或促肿瘤免疫²⁰^,²¹^,²²。肿瘤来源的外泌体可激活受体细胞或邻近肿瘤细胞的基因表达，从而改变其生物学表型；肿瘤细胞还可通过与肿瘤微环境中的基质细胞相互作用，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和血管生成²³^,²⁴^,²⁵。肿瘤细胞释放的外泌体可帮助其排出毒性药物，而基质细胞来源的外泌体则可促进肿瘤细胞的形成²⁰。肿瘤来源的外泌体参与肿瘤细胞转移的多个阶段，包括侵入邻近组织、通过循环系统转移以及扩散至远端器官²⁰。最后，外泌体在肿瘤中具有免疫激活和免疫抑制双重功能，具体作用取决于其所携带的配体、蛋白质和miRNA²⁰。由于肿瘤组织来源的外泌体具有重要的生物学功能，其在肿瘤的早期诊断、精准治疗及预后监测中展现出潜在的应用价值²¹^,²²。

鉴于肿瘤组织来源的外泌体具有重要意义，许多研究人员已尝试提取这些外泌体，以进一步研究其特性和功能。直接从肿瘤组织中提取外泌体不仅减少了对体外细胞培养不仅更接近外泌体的天然状态，因此在肿瘤组织中维持外泌体的天然状态是提取过程的关键。外泌体的物理特性是常用提取方法的基础，而提取过程中刺激所导致的外泌体成分变化却很少被考虑。事实上，外泌体的质量会受到不同提取方法的显著影响²⁶^,²⁷目前，肿瘤组织经酶消化后，需经过密度梯度离心、超速离心、超滤、尺寸排阻色谱（SEC）、聚合物沉淀、免疫亲和色谱以及微流控方法等处理，再进行分离²^,²¹^,²⁸^,²⁹在此，我们提供一种从肿瘤组织中提取外泌体的方法。采用无血清培养基对小型肿瘤组织块进行振荡培养，收集并提取肿瘤组织自然释放的外泌体，检测所提取外泌体的浓度及特性，为研究外泌体在肿瘤发生发展中的功能提供基础材料和实验依据。

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方案

所有与肿瘤组织外泌体相关的实验均按照相关指南和法规进行。本研究经四川大学华西医院伦理委员会批准，并遵循其指南开展（批准号：20220301101）。在接种SGC-7901细胞四周后，一只裸鼠（BALB/c，雄性，8周龄，26 g）通过颈椎脱位法实施安乐死。

1. 肿瘤组织的获取

用75%酒精浸泡5分钟。
转移至无菌操作台，使用无菌手术剪剪开异位肿瘤的外层组织。
剥离异位肿瘤组织，然后切割并称重，得到两份质量相等的组织。
注意：其中一份肿瘤组织按照本方案用于外泌体提取，另一份等重的肿瘤组织则用于通过酶消化法提取外泌体³⁰。

2. 肿瘤组织的预处理

注意：在冰上并以无菌环境进行这些步骤。

用移液器吸取10 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M）冲洗肿瘤组织，以去除表面血液和脂肪。
在10 cm无菌培养皿中，将肿瘤组织（约400 mm³）加入含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的20 mL PBS中，使用眼科剪将其剪成1–2 mm大小的组织块。将上述混合物转移至50 mL锥形管中。

3. 外泌体的释放

将步骤 1.2 中的离心管在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟。
弃去上清液，并用 20 mL 最小必需培养基 α（α-MEM）重悬沉淀。在恒温摇床中 37 °C、100 rpm 条件下孵育 1 小时。
在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟。
弃去上清液，并用 10 mL α-MEM 培养基重悬沉淀。在恒温摇床中 37 °C、100 rpm 条件下孵育 6 小时。
注意：所有操作步骤均需轻柔。短暂孵育并用 α-MEM 培养基洗涤一次，足以去除因切割而泄漏的细胞内成分，包括细胞内囊泡和细胞器。
在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，并将上清液收集至新离心管中。
用 10 mL α-MEM 培养基重悬肿瘤组织。
重复步骤 2.4 的孵育操作，随后进行步骤 2.5。
混合在步骤 2.5 和步骤 2.7 中收集的培养基上清液。
注意：所有操作步骤均需轻柔。两次 6 小时的孵育可诱导肿瘤组织碎片自然释放外泌体。

4. 超速离心

通过0.45 µm微孔滤膜过滤上清液。
在4 °C条件下，以12,000 × g 离心30分钟，去除大囊泡。
将上清液转移至新离心管中，在4 °C条件下以120,000 × g 离心90分钟，收集外泌体。
用PBS（0.01 M）洗涤外泌体沉淀，并在4 °C条件下以140,000 × g 再次离心60分钟。
将沉淀的外泌体重悬于PBS（0.01 M）中，用于立即实验或于-80 °C保存。
注意：所有操作步骤应轻柔进行。每一步均应使用尽可能低的离心力和最短的离心时间。

5. 外泌体鉴定结果的展示

通过透射电子显微镜（TEM）鉴定肿瘤组织来源外泌体的形态^30.
通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定肿瘤组织来源外泌体的大小和浓度³⁰。
通过蛋白质印迹法（WB）鉴定外泌体蛋白标志物 CD9 和 CD63³⁰。
注意：近期外泌体研究指南建议将 CD63、CD9 作为外泌体标志物的判定标准之一³¹。

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结果

透射电镜（TEM）显示，通过该方法从肿瘤组织中提取的外泌体具有典型的杯状结构（图1A），且该方法提取的外泌体形态与酶消化法提取的外泌体相比无显著差异（图1B）。纳米颗粒追踪分析（NTA）结果显示，外泌体的平均直径为172.8 nm，处于30–200 nm范围内，符合外泌体的尺寸特征；粒子浓度为5.9 × 10⁶/mL（图1C）；酶消化法提取的外泌体平均直径为175.5 nm，粒子浓度为1.7 × 10⁶/mL（图1D）。Western blot（WB）结果表明，从肿瘤组织中提取的外泌体表面表达标志蛋白CD9和CD63，符合外泌体的蛋白特征（图1E）。

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讨论

本方法从裸鼠异位胃癌组织中提取来源于肿瘤组织的外泌体，关键步骤包括外泌体的释放、渗出、分离与纯化。根据外泌体的物理特性和组成成分，已设计并验证了多种外泌体分离方法²^,²¹^,²⁸^,²⁹，每种方法各有优缺点，但目的均为尽量减少不同外泌体提取流程对外泌体特性的影响²⁶^,²⁷。Thery 等人首次提出了经典的超速离心法用于外泌体分离³²，自此，差速超速离心法也成为最常用的外泌体分离方法，使用率超过80%³³。尽管近年来出现了许多新方法，差速超速离心法仍被广泛用于外泌体分离，被称为"金标准"³⁴。本方法中外泌体的分离与纯...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到四川省科技支撑计划（2024NSFSC0592，2023YFS0064）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
α-MEM	HyClone	SH30265.01B
抗CD63抗体	Bioss	bsm-43117M
抗CD9抗体	Bioss	bs-2489R
离心管	Thermo	339650
恒温摇床	Thermo	MAXQ4450
一次性无菌移液管-10 mL	JET	GSP01001
EDTA	Biosharp	BS107
电动移液器	Thermo	9501
水平恒温离心机	Thermo	Sorvall ST1R plus
纳米颗粒追踪分析仪	Malvin	NanoSight Pro
眼科剪刀	Jinzhong	Y3D010
PBS	HyClone	SH30256.01B
磷钨酸	Sigma	455970-10G
手术剪刀	Jinzhong	J21010
二抗	Bioss	Bs-0295G	山羊抗兔IgG H&L/FITC
透射电子显微镜	Nikon	Plan Apo WF
超速离心管	Beckman	355618

参考文献

Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduct Target Ther. 5, 144(2020).
Rani, S., O'Brien, K., Kelleher, F., Corcoran, C., Germano, S., Radomski, M., et al. Isolation of exosomes for subsequent mRNA, MicroRNA, and protein profiling. Methods Mol Biol. 784, 181-195 (2011).
Zhou, L., et al. The biology, function and clinical implications of exosomes in lung cancer. Cancer Lett. 407, 84-92 (2017).
D'Agostino, E., et al. Exosomal microRNAs: Comprehensive methods from exosome isolation to miRNA extraction and purity Analysis. MicroRNA Profiling. 2595, 75-92 (2022).
Whiteside, T. Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Adv Clin Chem. 74, 103-141 (2016).
Ludwig, N., Whiteside, T., Reichert, T. Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. Int J Mol Sci. 20 (19), 4684(2019).
Johnstone, R., Adam, M., Hammond, J., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262, 9412-9420 (1987).
Li, B., Cao, Y., Sun, M., Feng, H. Expression, regulation, and of exosome-derived miRNAs in cancer progression and therapy. FASEB J. 35 (10), e21916(2021).
Caby, M., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17, 879-887 (2015).
Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
Street, J., et al. Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med. 10, 5(2012).
Palanisamy, V., et al. Nanostructural and transcriptomic analyses of human saliva derived exosomes. PLoS ONE. 5, e8577(2010).
Runz, S., et al. Malignant ascites-derived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 107, 563-571 (2007).
Keller, S., et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 72, 1095-1102 (2007).
Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
Simpson, R., Lim, J., Moritz, R., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
Sung, B. H., Parent, C. A. Extracellular vesicles: Critical players during cell migration. Dev Cell. 56, 1861-1874 (2021).
Xie, Q., et al. Exosome-mediated immunosuppression in tumor microenvironments. Cells. 11 (12), 1946(1946).
Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
Jiang, Z., Wang, H., Mou, Y., Li, L., Jin, W. Functions and clinical applications of exosomes in pancreatic cancer. Mol Biol Rep. 49 (11), 11037-11048 (2022).
Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annu Rev Biochem. 88 (1), 487-514 (2019).
Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFR VIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10, 619-624 (2008).
Nazarenko, I., et al. Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation. Cancer Res. 70, 1668-1678 (2010).
Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).
Macias, M., et al. Liquid biopsy: from basic research to clinical practice. Adv Clin Chem. 83, 73-119 (2018).
Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10, 1039(2020).
Hu, J., et al. Application exosomes as nanocarriersâ€‚inâ€‚cancer therapy. J Mater Chem B. 11 (44), 10595-10612 (2023).
Wang, C., et al. A light-activated magnetic bead strategy utilized in spatio-temporal controllable exosomes isolation. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1006374(2022).
Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 5, 32945(2016).
Li, W., et al. Comparison of the yield and purity of plasma exosomes extracted by ultracentrifugation, precipitation, and membrane-based approaches. Open Chem. 20, 182-191 (2022).

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