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建立并验证与肺纤维化相关的肺动脉高压大鼠模型

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DOI：

10.3791/67747

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2025年5月23日

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Center for Respiratory Medicine, Guangdong Key Laboratory of Vascular Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 3GMU-GIBH Joint School of Life Sciences, Guangzhou Medical University, 4Guangzhou laboratory, Guangzhou International Bio Island

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了通过向气道注射博来霉素建立与肺纤维化相关的肺动脉高压（PF-PH）大鼠模型的方法。同时提供了对该动物模型进行验证的逐步操作流程。

摘要

肺纤维化患者发生肺动脉高压的风险更高，而肺动脉高压是一种预后不良的并发症。目前，这一关联的机制仍不明确。该领域研究进展的主要障碍之一是缺乏可稳定复制肺纤维化相关肺动脉高压（PF-PH）的可靠动物模型。本研究旨在建立一种稳定的PF-PH大鼠模型。干预前，大鼠禁食过夜。在戊巴比妥钠麻醉（45 mg/kg）下，通过插入深度为3 cm（从声门至导管的距离）的PE50导管进行气管插管。博来霉素（BLM）以单次剂量经气管给予（5 mg/kg，溶于0.2 mL 0.9% NaCl溶液中）。注射后立即旋转大鼠，以确保BLM均匀分布。在BLM注射后第35天，大鼠表现出进行性肺功能损害、右心室收缩压升高以及右心室肥厚，呈现出肺动脉高压的病理特征。 我们提供了一种通用且可靠的建立PF-PH大鼠模型的方法。

引言

由间质性肺病（ILD）引起的肺动脉高压（PH）在临床上较为常见，在特发性肺纤维化（IPF）患者中的估计患病率为10%至80%，在其他纤维化性间质性肺病中也常被观察到1,2。大量研究表明，肺动脉高压的发生与显著的疾病负担和生存期缩短相关3,4,5。与第1类肺动脉高压（PAH）相比，肺纤维化相关肺动脉高压（PF-PH）的发病机制仍不明确6。建立大鼠PF-PH动物模型的目的是为肺纤维化合并肺动脉高压的科学研究提供一个可靠的框架，并探索潜在的临床治疗途径。

博来霉素是一种经典的肺纤维化诱导剂，广泛应用于动物模型7。Blackburn 等人8及本实验室的进一步研究9发现，博来霉素还可引发肺动脉高压的典型病理特征，例如右心室收缩压（RVSP）升高和右心室肥厚。其机制在于，博来霉素可诱导肺实质纤维化、低氧性血管收缩以及肺血管床密度降低，从而导致肺动脉高压的发生6。此外，我们观察到自博来霉素处理第7天起，肺血管内皮细胞出现显著丢失，且随着实验进程逐渐加重9。这一现象提示，博来霉素诱导的肺血管内皮功能障碍可能在肺动脉高压的起始与进展过程中发挥潜在作用。

由于肺间质纤维化，特发性肺纤维化（IPF）患者长期处于缺氧状态，心肺血管发生代偿性改变，从而导致肺动脉高压6。利用动物模型有助于我们进一步理解与肺动脉高压相关的特发性肺纤维化疾病的潜在机制。尽管该模型无法完全模拟人类疾病的病理特征，但仍可提供有价值的见解。目前已有多种模拟肺纤维化的实验模型，例如单次气道灌注博来霉素、通过病毒载体递送转化生长因子以及暴露于二氧化硅等8,10。其中，博来霉素（BLM）模型是目前应用最广泛且特征最明确的模型，因其可在短时间内简便地诱导，并具有高度可重复性。此外，在博来霉素小鼠模型中已对肺纤维化的时间动态变化进行了评估，结果显示纤维化标志物及相关疾病病理基因（如 Col1A1 和 Col1A2）的表达在第15至21天显著升高8。心血管方面的改变，例如右心室肥厚以及右心室收缩压（RVSP）的显著升高，则在第33天或之后被检测到11。同时，本实验室此前已对博来霉素诱导的大鼠模型中肺动脉高压（PH）和肺纤维化（PF）参数的变化进行了评估9。我们发现，在单次气道给予博来霉素后7至35天内，除了出现进行性肺功能损害和胶原沉积等肺纤维化（PF）特征外，肺动脉高压（PH）的典型特征也逐渐显现。右心室收缩压（RVSP）和富尔顿指数（Fulton index）均呈时间依赖性升高。目前，文献中已报道了多种用于肺纤维化研究的动物模型。有专家指出，大鼠模型相较于小鼠模型表现出更为显著的纤维化反应12。因此，为了更好地研究肺纤维化合并肺动脉高压的疾病进展过程，博来霉素诱导的大鼠模型至关重要。

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方案

本研究中描述的动物实验已获得广州医科大学第一附属医院动物护理与使用委员会的批准（伦理批准编号：2018-456）。

1. 实验大鼠的获取

  1. 将大鼠分为两组：正常对照组和模型组，每组7只。选用10周龄、体重为200 ± 20 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠进行实验

2. PF-PH 大鼠模型的诱导

  1. 为防止操作过程中发生反流误吸，建模前需对大鼠进行过夜禁食。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（45 mg/kg）对大鼠实施麻醉，以确保操作的准确性和安全性，并最大程度减少动物疼痛与应激反应。通过夹捏足趾无反应来确认手术麻醉深度。同时，向大鼠眼部涂抹眼膏以防止角膜干燥。
  3. 使用PE50导管插入大鼠气管进行插管，插入深度为3 cm（从声门至导管末端的距离）。
  4. 用1 mL注射器（26G）抽取0.2 mL博来霉素（5 mg/kg，溶于0.2 mL 0.9% NaCl中）。通过套管将含博来霉素的注射器内容物单次注入气道。对照组大鼠则进行气管内注射等量无菌生理盐水（0.2 mL）。此过程中大鼠无需额外镇痛处理。
  5. 为确保博来霉素在肺内均匀分布，将大鼠置于仰卧位，轻柔固定并缓慢旋转。推荐旋转角度为30°–45°，左右交替进行。每次旋转维持10–15秒，重复3–4次。
  6. 将大鼠置于加热垫上以维持体温，并密切监测其状态。观察大鼠自主活动恢复情况，待其苏醒后转移至独立笼具中继续恢复。
  7. 博来霉素注射5周后，采用超声心动图监测、血流动力学测量及组织学分析等方法对大鼠进行评估，以判断PF-PH模型是否成功建立。

3. 超声心动图监测

  1. 使用 4% 异氟烷麻醉大鼠。用脱毛膏去除大鼠体表毛发，并在其胸部涂抹超声耦合剂。
  2. 采用 250 MHz 超声探头评估大鼠右心的功能和结构参数。为获得最佳心室长轴切面，将探头置于动物胸部中线左侧。
  3. 根据个体解剖结构，将探头相对于左侧胸骨旁线逆时针旋转 15°，探头缺口朝向其右肩，并在 B 模式下调节 x 和 y 轴，使整个心脏位于视野中心。
  4. 选择 Color（彩色模式）以显示血流颜色，从而区分肺动脉（在此位置肺动脉血流信号呈蓝色）。
  5. 选择 PW （脉冲多普勒）模式，将取样线置于肺动脉瓣下方，旋转 PW 角度调节旋钮，使取样线方向与肺动脉血流方向平行（约 25°）。再次按下 PW 键，获取肺动脉血流加速时间/射血时间（PAT/PET）。测量至少五个心动周期并取平均值。使用 Cine 功能保存图像。
  6. 将动物调整为头低脚高位，将超声探头置于动物心脏心尖部，并沿心尖方向驱动超声，以获得四腔心切面。在 B 模式下调节 x 和 y 轴，确保四个心腔均可见。
  7. 按住 M 模式以显示 2x 测量线，并将其放置在三尖瓣环与右心室游离壁交界处。在至少三个心动周期内测量三尖瓣位移距离（TAPSE），并以 Cine 模式保存图像。
  8. 将探头置于动物胸部右侧锁骨中线位置，调节探头与动物胸骨切迹之间的角度至约 45°。在 B 模式下调整图像，使右心室和室间隔清晰可见。
  9. 选择 M-Mode（M 模式）以显示 2x 测量线，并将测量线置于室间隔中部，取样线垂直于右心室游离壁。保存图像以获取右心室游离壁厚度。

4. 肺功能评估

  1. 打开PFT软件，检查设备是否已被识别。根据仪器说明书进行校准，以确保流量传感器和压力传感器的准确性。在PFT软件中设置测试参数，如呼吸频率、潮气量、测试持续时间等。
  2. 动物检测模式适用于大鼠研究。打开主控仪器的开关，并确保每个信号放大器的开关处于关闭位置。
  3. 根据动物体重设定气流。打开吸气气流调节螺母，将吸气值设为5。打开呼气气流调节螺母，将缓慢呼气值设为-4。将压力值设为60 cm H₂O。2O，然后按照FRC流量、流量、高流量和肺压的顺序校准仪器，误差小于0.5%。
  4. 用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，步骤同2.2。沿颈部中线切开皮肤并分离 逐层分离肌肉。
  5. 在暴露的颈段气管上部，在气管软骨环之间作一横向切口。迅速将金属套管插入气管切口，确保套管位置正确且固定稳妥。使用4-0丝线缝合固定套管与气管，防止其滑脱或移位。将大鼠置于肺功能检测仪的动物舱内，并将气管套管连接至仪器外部的气流通道接口。
  6. 点击 开始 按钮，并检测用力肺活量（FVC）和动态肺顺应性。为确保数据一致性，每个指标至少记录3次。
  7. 测试完成后，保存数据并导出至分析软件。使用统计软件分析数据，比较不同组别的肺功能参数。

5. 血流动力学和组织学测量

  1. 右心室收缩压（RVSP）检测
    1. 用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，操作同步骤2.2。通过夹捏足趾确认大鼠已充分麻醉，无反应。将大鼠腹部朝上固定于实验台，并在其眼部涂抹眼膏以防止角膜干燥。
    2. 在颈部右侧用手术剪做一个约4 cm的切口，用显微镊分离出颈外静脉。用显微镊轻轻分离出约1 cm长的静脉段，在远端和近端分别插入两根手术线。
    3. 插管前，将PE50导管浸泡在含有1%肝素钠或EDTA的生理盐水中至少30分钟。调节生理记录仪，使压力归零，并将压力范围调整至0-150 mmHg。
    4. 结扎颈外静脉远端，用4-0丝线结扎，轻轻提起近端血管，将其置于远端静脉壁上。用小剪刀做一小切口（约0.3 mm）。插入PE50导管后 将导管插入颈外静脉后，使用4-0丝线将导管与颈外静脉一并结扎，以防止血液渗漏。
    5. 在记录仪上观察静脉压波形。缓慢推送导管进入右心房，此时可见右心房压力波形，幅度约为0-5 mmHg。当导管继续从右心房向前推进至右心室时，可观察到右心室压力波形。待压力稳定后，记录5分钟右心室压（RVP），数据由分析软件保存并进行分析。
  2. Fulton 指数检测
    1. 异氟烷麻醉（5%，2 L/min O₂）后检测RVSP，2通过放血法处死大鼠。
    2. 开胸后，用镊子取出大鼠完整的心脏。用剪刀剪除心耳及心脏周围的结缔组织。
    3. 沿肺动脉剪开右心室的游离壁。该组织即为右心室（RV）。剩余组织为左心室加室间隔（LV+S）。分离后，用滤纸吸干右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S）表面，分别使用分析天平称重。记录右心室（RV）和左心室加室间隔（LV+S）的重量后，计算右心室与左心室加室间隔的重量比（RV/(LV+S)）。
  3. 组织学染色
    1. 打开胸腔后，用10 mL注射器吸取3 mL生理盐水。将注射器插入肺动脉，缓慢注入生理盐水以灌洗肺脏，清除血液及其他残留物。
    2. 使用剪刀分离肺的右副叶和右前叶。将这两个肺叶放入4%甲醛溶液中固定，以保存组织形态和结构。迅速将剩余的三个肺叶（如左肺、右中叶和右后叶）放入液氮中冷冻保存，以备后续实验使用。
    3. 去除肺组织表面多余的脂肪和结缔组织，以确保组织块干净整齐。将肺叶修剪成大小为5 mm × 5 mm × 3 mm的小块。将修整好的组织块放入脱水机中，用梯度浓度的酒精（60%、70%、80%、90%、100%）逐步进行脱水。
    4. 将肺组织浸入二甲苯中2小时以达到透明。取出后，置于56–58 °C的熔融石蜡中浸泡2小时，确保完全浸透。随后将组织放入模具中，切面朝下放置，以便后续切片。
    5. 用切片机将石蜡包埋块切成4-8 µm厚度的切片13，并在室温下保存以用于病理染色。
    6. 进行伊红与马松三色染色14.

6. 羟脯氨酸（HYP）的检测

  1. 称取30-100 mg肺组织置于玻璃试管中，加入2 mL盐酸溶液（6 mol/L），于110 °C烘箱中消化2-6 h，直至无明显大块组织残留。
  2. 冷却后，用1 mL氢氧化钠溶液（10 mol/L）调节pH值至6-8，再将蒸馏水浓缩至4 mL溶液。最后于25 °C以28,620 × g离心20 min，取上清液待用。
  3. 将酶标仪预热30 min，调节波长至560 nm，并用蒸馏水校零。
  4. 用蒸馏水稀释标准品溶液，配制成浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469和0.234 µg/mL的标准溶液。
  5. 取60 µL样品上清液与60 µL试剂A混合，室温静置20 min。
  6. 加入60 µL试剂B和120 µL蒸馏水，将混合溶液置于60 °C水浴中反应20 min。对各浓度标准溶液（如30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 µg/mL）按相同步骤操作并相应处理。
  7. 室温静置15 min后，取96孔板中溶液200 µL，测定560 nm处的吸光值。以标准溶液浓度为横坐标，测定值为纵坐标绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将样品测定值代入方程，计算样品浓度。

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结果

博来霉素诱导的大鼠肺纤维化
已有报道表明，博来霉素（Bleomycin）是动物模型中诱导肺纤维化的经典诱导剂7。本研究在博来霉素（BLM）刺激后评估了肺纤维化的各项指标。首先，在BLM处理35天后，我们进行了肺功能检测，发现模型组的用力肺活量（FVC）（图1E）和动态肺顺应性（图1F）均显著降低。这些结果明确表明肺功能受到明显损害。其次，为评估肺组织中胶原蛋白的沉积情况，研究采用了马松三色染色（Masson's trichrome staining）和羟脯氨酸（HYP）检测。马松三色染色显示，模型组肺动脉周围蓝色染色区域显著增加，提示胶原蛋白大量积聚（图1D）。同时，HYP检测结果显示，模型组的HYP水平显著高于对照组（图2E），进一步证实了胶原沉积的增加。此外，我们采用称重法检测了肝脏（

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讨论

特发性肺纤维化是一种进行性、致命性疾病，自诊断起的中位生存期为2至3年，预后极差9。肺动脉高压是特发性肺纤维化的常见合并症，会迅速加重肺纤维化的病情，导致预后进一步恶化15。此外，目前针对特发性肺纤维化相关肺动脉高压（IPF-PH）的治疗选择极为有限7。因此，深入理解肺纤维化相关肺动脉高压（PF-PH）的潜在分子机制至关重要，这可能为该疾病的治疗提供新的潜在策略。

本方案介绍了一种已建立且稳定的制备PF-PH大鼠模型的方法。该模型对于研究疾病的病理生理机制至关重要，并在验证新型治疗策略中发挥关键作用。肺纤维化（PF）动物模型可通过多种方法建立，包括药物给药、辐射、二氧化硅暴露、病毒载体、转基因技术以及人成纤维细胞移植16。每种建模方法均有其优缺点。例如，辐射法成本高且耗时长（需超过30周）；二氧化硅处理更易导致尘肺病而非肺纤维化；病毒载体和转基因动物模型操作相对复杂，需要较高技术水平；而人成纤...

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披露

作者没有相关的财务披露。

致谢

本工作部分得到了国家自然科学基金（82370063、82170069、82120108001、82241012）的资助，R&D 广州国家实验室项目（GZNl2023A02013），国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2022YFE0131500），广东省科学技术厅（2024A1515011208，2022A1515012052，2024A1515013104，202102020019，202201020538，202201010069，2023A03J0334），呼吸疾病国家重点实验室自主项目（SKlRD-Z-202513），广东省医学科研基金（A2023379），广州医科大学及广州医科大学科研能力提升计划，广州医科大学第六附属医院（清远市人民医院）开放研究基金（202201-101）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
博来霉素MedChemExpressHY-17565A
偶联剂HYNAUTBX-CSRH
甲醛固定液BiosharpBL401B
脱毛膏LUSENLS-B-TMG-50
苏木精-伊红（HE）染色试剂盒BeyotimeC0189S
异氟烷RWD Life Science(中国)R510-22-10
Masson 三色染色试剂盒BeyotimeC0189S
生理盐水KERONGSLYS-001
注射器BeyotimeFS701-50pcs

参考文献

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