使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

摘要

本文介绍了一种从黏蛋白中释放 O-聚糖 的详细方案，以及后续的脱盐、完全甲基化修饰和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析方法。

摘要

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种用于黏蛋白聚糖分析的强有力工具，具有高灵敏度和高通量的优点。本文提供了利用MALDI-TOF MS分析黏蛋白O-连接聚糖的详细实验方案，涵盖聚糖释放、脱盐、完全甲基化修饰、数据采集与分析等步骤。本研究表明，与使用多孔石墨化碳（PGC）的固相萃取相比，基于离子交换色谱的脱盐方法可显著提高较大聚糖的回收率，并获得更高质量的质谱图谱。此外，本研究提示，当前常用的甲基化反应时间可能不足，延长反应时间可能更有助于唾液酸化结构的有效修饰。我们还强调了碎片化数据以及对O-聚糖 生物合成途径的先验知识在准确鉴定聚糖组成与结构中的重要性和必要性，并讨论了MALDI-TOF在黏蛋白O-聚糖分析中所具有的内在优势与局限性。

引言

黏蛋白是构成黏液大部分结构成分的大型糖蛋白。它们由称为杯状细胞的特化上皮细胞产生，并经历广泛的翻译后修饰 O-糖基化后在黏膜表面分泌。黏蛋白的糖基化发生在高尔基体中，由一组特化的糖基转移酶家族——多肽-N-N-乙酰半乳糖胺转移酶（ppGalNAc-T）通过将一个GalNAc残基连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）上，启动该过程¹然后，一系列糖基转移酶通过添加半乳糖（Gal）来延伸聚糖结构， N乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc），GalNAc N-N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和岩藻糖（Fuc）残基，而其他碳水化合物修饰酶则可催化聚糖的硫酸化等反应¹黏蛋白骨架上的糖链主要成簇地分布在富含丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr）残基的蛋白质区域，因为这些残基侧链上的羟基可作为糖基化位点 O-糖基化位点。这种密集的糖基化使黏蛋白呈现出一种 "瓶刷" 并决定其物理特性，例如高吸水能力、凝胶形成能力以及高黏弹性^2,3由于这些特性，黏蛋白可提供润滑作用，保护上皮免于脱水和物理损伤，并在上皮与其微环境之间形成物理屏障。^4,5黏蛋白聚糖可作为共生或致病细菌的结合位点和碳源^6,7,8黏液的结构与组成在通过以下方式保护上皮方面起着关键作用 使微生物保持在附近但远离上皮表面。黏蛋白聚糖还参与细胞间的通信与黏附⁹.

黏蛋白聚糖在维持黏膜稳态中发挥关键作用，异常的黏蛋白糖基化谱与屏障功能受损、菌群组成改变、肿瘤转移增加、炎症性肠病（IBD）及其他疾病相关^10,11,12。因此，研究黏蛋白糖基化对于理解黏液和黏蛋白在人类健康中的作用具有重要意义，并可能为疾病的管理或治疗提供新策略。

基于质谱的技术是研究黏蛋白聚糖最常用的方法之一。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种软电离技术，可用于分析聚糖和糖蛋白等大分子、非挥发性生物分子¹³。该方法具有高灵敏度和宽质量范围，能够检测和鉴定丰度低且种类多样的聚糖混合物。此外，串联质谱（MS/MS）实验获得的碎片图谱可提供有关聚糖组成和序列的宝贵结构信息¹³。

通常，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析黏蛋白中的O-连接聚糖涉及一个多步骤的工作流程：首先使用还原性β-消除等化学方法将O-聚糖从蛋白质骨架上释放出来，然后进行脱盐以去除化学释放过程中产生的盐分，并进行衍生化处理以增强离子化效率和检测灵敏度。纯化并衍生化后的聚糖随后与合适的MALDI基质在MALDI靶板上共结晶，并采集质谱数据，从而获得完整聚糖离子的质量信息。随后通过MS/MS实验对聚糖进行碎裂，以获取其结构信息¹⁴。本文中，我们提供了一种详细的实验方案，用于聚糖的释放、脱盐、完全甲基化修饰及其在MALDI-TOF MS中的分析。

方案

注意：工作流程的示意图参见图1。

图1：实验流程示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 糖链释放

1. 制备 β-消除缓冲液
   注意：每次使用前必须新鲜配制。
   1. 称取一粒氢氧化钠（NaOH），溶于50 mL离心管中的适量H₂O中，配制成0.1 M溶液。
   2. 在5 mL离心管中，将189 mg硼氢化钠（NaBH₄）溶于上述步骤1.1.1配制的碱性溶液5 mL中。
      警告：NaOH具有腐蚀性，NaBH₄具有腐蚀性、毒性、易燃性，并对健康有害。两种化学品均应在通风橱内使用适当的个人防护装备操作。切勿将NaBH₄直接溶于H₂O中，因其会分解并释放可自燃的氢气。
2. 设置β-消除反应
   1. 在4 mL玻璃小瓶中，将最多100 µg纯化的黏蛋白溶于250 µL H₂O中。
      注意：某些黏蛋白可能无法完全溶解，而是形成极小颗粒的悬浮液。
   2. 加入250 µL β-消除缓冲液，并用聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖子紧密封口。将反应体系在45 ^oC孵育16小时。
3. 终止反应
   1. 在100 mL玻璃瓶中，将5 mL冰醋酸加入95 mL H₂O中（终浓度为5% (v/v)）。
      注意：此溶液可在室温下保存并重复使用。警告：冰醋酸易燃且具腐蚀性，应在通风橱内使用必要的个人防护装备操作。
   2. 在冰上，逐滴向每个反应体系（步骤1.2.3）中加入1 mL 5%乙酸溶液。此时应观察是否有因过量NaBH₄释放氢气而产生的气泡。若加入1 mL 5%乙酸后仍有气泡产生，则需重复此步骤。
      注意：若加入5%乙酸后无气泡产生，则β-消除反应可能未完成或失败。
4. 样品脱盐
   1. 在100 mL玻璃瓶中，用5% (v/v)乙酸配制阳离子交换树脂（H⁺型，200–400目）的浓悬浮液。
   2. 用少量玻璃棉堵塞玻璃移液管底部。从顶部加入1.5 mL树脂悬浮液至玻璃移液管中，使其沉降并自然流干，制成脱盐柱。
   3. 用2 mL 5%乙酸洗涤树脂，弃去穿流液。
   4. 将黏蛋白样品加至脱盐柱上，用5 mL离心管收集穿流液。
   5. 用1 mL 5%乙酸冲洗样品小瓶，并将冲洗液加载至脱盐柱，穿流液收集至同一离心管中。
   6. 用1 mL 5%乙酸洗涤柱子两次，每次穿流液均收集至同一离心管中。
   7. 使用离心浓缩仪去除乙酸并浓缩样品（5 mbar，30 ^oC，2小时）。
   8. 将样品在-80 ^oC冷冻，并在冷冻干燥机中干燥过夜。
      注意：也可继续使用离心浓缩至完全干燥，但会使样品重溶更加困难。
   9. 在100 mL玻璃瓶中，将5 mL乙酸加入95 mL甲醇中（终浓度为5% (v/v)）。
      警告：甲醇易燃且有毒，应在通风橱内使用必要的个人防护装备操作。
   10. 将样品溶于0.5 mL含乙酸的甲醇溶液中，并在氮气流下干燥。重复此步骤3–5次。将干燥后的样品在4 ^oC保存。
5. 糖链的全甲基化
   1. 在8 mL玻璃小瓶中，将50% NaOH溶液（0.2 mL）与0.4 mL甲醇混合，充分涡旋。将形成白色沉淀，但会迅速重新溶解。
   2. 使用玻璃注射器加入4 mL无水二甲基亚砜（DMSO），充分涡旋。
   3. 将溶液在2,000 × g下离心2分钟。此时管底形成凝胶，中间为液相，顶部聚集盐分。
   4. 小心倾去上清液和盐分，避免扰动底部凝胶。
   5. 重复步骤1.5.2–1.5.4共5次，直至不再有盐析出。若盐分附着于管壁，可轻轻摇动使盐重新悬浮（避免扰动底部凝胶），或用玻璃巴氏移液管去除。
   6. 当不再有盐析出后，将凝胶重悬于4 mL无水DMSO中。此悬浮液即为全甲基化碱液。
      注意：此量的全甲基化碱液足以处理约25个样品。可根据需要调整用量。
   7. 向干燥的样品中加入100 µL无水DMSO和150 µL全甲基化碱液。使用玻璃移液管尽快加入80 µL碘甲烷，以避免从环境中吸收水分。
      警告：碘甲烷有毒，对健康和环境有害，应在通风橱内使用必要的个人防护装备操作。
   8. 将全甲基化反应体系在室温下剧烈震荡孵育30分钟。
   9. 加入0.5 mL H₂O终止反应。样品将变浑浊。
      注意：若样品未变浑浊，可能表明全甲基化反应未完全。
   10. 用氮气吹扫样品直至溶液澄清。
   11. 将样品加载至亲水-疏水平衡（HLB）96孔萃取板（60 mg）或HLB小柱上。施加正压，以约1 mL/min的流速推动样品通过固相。若使用HLB小柱，可用橡胶吸头或真空 manifold 施加压力。弃去穿流液。
   12. 用2 × 1 mL H₂O洗涤各孔，施加正压后弃去穿流液。
   13. 用1 mL甲醇从HLB板中洗脱糖链。施加压力至甲醇开始流出即可，之后依靠重力流即可达到所需流速。收集穿流液。
   14. 重复洗脱步骤一次。
   15. 使用离心浓缩仪干燥样品。
   16. 在4 mL玻璃小瓶中，通过混合1 mL乙腈、998 µL H₂O和2 µL三氟乙酸配制TA50缓冲液。
       警告：乙腈易燃，三氟乙酸具腐蚀性，两者均应在通风橱内使用适当的个人防护装备操作。
   17. 在微量离心管中，将10 mg超DHB [2,5-二羟基苯甲酸与2-羟基-5-甲氧基苯甲酸按9:1 (w/w) 混合] 溶于1 mL TA50中，配制基质溶液。
   18. 将干燥的样品溶于10 µL TA50中。
   19. 取1 µL样品与1 µL基质溶液混合，点样至钢制MALDI靶板上，待其自然干燥。

2. 样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析

1. 设置以获取母离子数据
   1. 以50%的强度从激光器发射1,000次脉冲。
      注意：这些参数可能因全球仪器设置的不同而有所变化，可根据需要进行调整。
   2. 在……之下 激光载波器 标签，设置 随机游走 设定为 完整样本.
   3. 在……之下 检测 标签，设置 质量 范围至 500 - 3,000；若在 2,500–3,000 m/z 处观察到强峰，则扩大此范围。设置 探测器增益 到 20x.
      注意：增益可根据仪器的全局设置而变化，并可根据需要进行调整。
   4. 在……之下 光谱仪 标签，设置 极性 到 阳性 以及 基质抑制 到 偏转，300 道尔顿.
   5. 点击 开始 一旦数据采集完成， 保存为 将数据保存到合适的目录中。
2. 打开母离子谱图以获取碎片谱图
   1. 右键单击谱图后，选择 查找质量列表.
   2. 从生成的列表中选择 用于碎裂的相关离子 并点击 添加至 MS/MS 列表 在选中的峰上单击右键后。
   3. 再次右键单击 质谱列表 并选择 MS/MS 列表
   4. 点击 发送至 flexControl.
   5. 开启 flexControl，加载 LIFT法 并导航至 LIFT 表。
   6. 依次选择每个加载的峰，并通过在母离子和碎片离子之间切换来获取两者 父代 和 片段模式调整 激光强度 和 拍摄次数 根据需要。点击 保存 在每次母离子碎裂后保存数据。
   7. 以“.ascII”格式导出光谱。
      注意：此数据后续可导入 Glycoworkbench 进行进一步分析。
3. 使用 GlycoWorkbench 进行数据分析
   1. 在 Glycoworkbench 中，加载质谱导出的 .ascII 文件并进行分析 基线校正 和 噪声滤波 在窗口底部的相关按钮上点击，然后 计算峰质心在弹出窗口中，选择适当的 质量范围，最小信号/噪声比，以及 最小 MS 峰强度.
   2. 一旦计算出峰的质心，即可使用 Glyco-Peakfinder 用于查找与峰列表匹配的结构组成的工具。选择 perMe 作为 衍生化, 红色末端 作为 还原末端，以及 分钟 和 预期最大残基数.
      1. 对于 黏蛋白，选择己糖、N-乙酰己糖胺、脱氧己糖和 N乙酰神经氨酸。用于 硫酸化聚糖，使用 其他残留物 选项与一个 质量 的 87.9。对于 MALDI-TOF 数据，设置 最大钠离子数 和 最大电荷数 设定为 1 以及 准确性 到 0.5 Da.
         注意：准确度可能需要进一步提高，具体取决于质谱仪的校准情况。
   3. 按住以选择所有正确的注释 对照 键并点击每个注释；然后右键点击注释，再点击 添加至标注的峰列表.
   4. 要生成一份比较多个注释光谱的报告，在 工具 标签，位于下方 报告，选择 生成一份比较不同特征谱的报告将报告打印为 PDF 格式以保存。
   5. 在鉴定出糖链峰后，将每种独立结构的相对丰度计算为所有糖链峰总面积的百分比。
   6. 对于裂解谱图的分析，将谱图载入 Glycoworkbench，并按照步骤 2.3.1 生成峰列表。
   7. 绘制与标注的聚糖组成相对应的假定聚糖结构。通过选择相关选项，为每种绘制的结构生成碎片 计算片段 选项位于下方 片段 工具。然后，选中所有片段，右键点击，并选择 将片段复制到画布.
   8. 为进一步支持对碎片化的分析，可在谱图查看器中单击感兴趣的峰进行选择。接着，通过右键单击并 选择查找所有与峰匹配的结构，将所选峰的质荷比（m/z）与在线数据库中的假定糖链结构进行比对。
   9. 选择感兴趣的假定结构，右键单击后选择相应选项，将其复制到软件的画布窗口中。
   10. 要计算每种糖链结构可能产生的片段，首先在画布中选择目标结构，然后在下方 工具 标签，选择 片段 和 计算当前结构的片段.
   11. 如果已计算出多个糖链结构的片段，则查看 比较表 在 摘要 标签，位于下方 片段 表格 视图
   12. 选择与每种潜在聚糖结构的峰列表相匹配的片段，并进行筛选 将片段复制到画布 从右键下拉菜单中。
   13. 在 工具 标签，位于下方 分析仪，选择 使用所有结构对峰进行标注 然后点击 工具 | 报告 | 创建注释报告将报告打印为 PDF 格式以保存。

结果

在以下结果中，使用猪胃黏蛋白（PGM）来优化脱盐和全甲基化步骤。为了比较两种常用的脱盐方法，在糖链释放后，样品通过阳离子交换（如上文方案所述）并用甲醇共蒸发除去硼酸盐，或采用多孔石墨化碳（PGC）固相萃取小柱进行脱盐。后者需要先用80%乙腈和100% H₂O对小柱进行预处理，再用0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）洗涤，随后依次用2 mL含0.1% TFA的25%乙腈、2 mL含0.1% TFA的50%乙腈以及2 mL含0.1% TFA的80%乙腈洗脱糖链。

经完全甲基化处理后，对质荷比（m/z）500 至 m/z 2,500 范围内的谱图进行了分析。通过离子交换结合硼酸去除法脱盐的样品中鉴定出总共 33 种糖链结构，而通过 PGC 提取法脱盐的样品中鉴定出 32 种结构（图 2A）。其中一种糖链结构在 PGC 脱盐样品中未被检出（在 图 2A 中以星号标记）。该比较分析表明，与离子交换法相比，PGC 提取法对较大糖链的回收效率较低。这一点也体现在较大糖链的相对丰度上：PGC 提取后较大糖链占总糖链的 21%，而离子交换法则达到 31%。此外，与采用 PGC 固相萃取脱盐所得谱图相比，离子交换结合硼酸去除法脱盐所得谱图具有更高的信噪比（图 2B）。

为了优化完全甲基化反应时间，取同一完全甲基化反应的等分试样，在不同时间点（即5分钟、30分钟或90分钟）加入H₂O终止反应。结果表明，在反应30分钟或90分钟的样品中，可在m/z 500至m/z 2,500范围内鉴定出33个糖链峰，且所得质谱图相似。相比之下，当反应时间为5分钟时，仅能鉴定出31个糖链峰（图3）。有趣的是，在较短反应时间内未能鉴定出的两个结构（在图3中以星号标记）正是两个唾液酸化结构，这表明在所测试的条件下，唾液酸的修饰在5分钟内效率较低。

采用碎片化分析对每个PGM糖链峰进行检测，以确认糖链组成并确定其结构。本文展示了两个示例（图4）。在图4A中，展示了质荷比（m/z）为983峰的碎片化谱图。该糖链的组成为HexNAc₂Hex₂。此组成存在两种可能的结构：Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc（糖链1）或Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc（糖链2）。对该化合物进行碎片化分析后得到的质谱图中出现了多个峰，可分别归属于糖链的不同片段。其中，m/z 529处的峰为结构1的特征峰，m/z 708处的峰为结构2的特征峰，因此可以得出结论：糖链1和糖链2均存在于PGM糖链混合物中。

在图4B中，展示了质荷比（m/z）为2,026峰的碎片谱图。Glycoworkbench为该峰计算出两种可能的糖链组成：Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ 和 Hex₃HexNAc₄dHex₂。唾液酸化组成的质量偏差较大（分别为~160 ppm和178 ppm），提示第一种组成应为正确选项。然而，碎片谱图显示存在岩藻糖（Fuc），而非唾液酸（Neu5Ac）；因此，第二种组成为正确结果。此处展示了四种假定的糖链结构，并根据每种假定糖链结构计算出的碎片对谱图进行了标注。在标注后的谱图中可见，仅存在糖链4和糖链6特有的特征峰，而未检测到糖链3和糖链5的特征峰。根据这些数据，可以得出结论：糖链4和糖链6存在。

图 2：根据脱盐和固相萃取方法对糖链峰的比较。 （A）通过阳离子交换色谱结合硼酸去除或PGC固相萃取脱盐后PGM糖链谱图的比较。（B）两种脱盐方法在各鉴定糖链峰的信噪比方面的比较。星号标记的糖链仅在经阳离子交换和硼酸去除脱盐的样品中被鉴定到。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：PGM糖链在甲基化反应5、30或90分钟后的糖链谱型比较。 星号标记的为仅在甲基化反应30或90分钟后才被鉴定出的唾液酸化糖链。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：PGM 糖链的裂解谱图示例。 （A）质荷比为 m/z 983 的糖链峰的裂解谱图。（B）质荷比为 m/z 2026 的糖链峰的裂解谱图。方框表示可能的糖链结构。碎片上方的数字表示其可能来源的糖链结构。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

为了研究聚糖，研究人员采用多种方法，从利用凝集素识别特定表位，到更复杂的液相色谱-串联质谱法（LC-MS）和核磁共振（NMR），以获得聚糖结构的详细表征。与其它方法相比，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的主要优势在于其高灵敏度和高通量特性¹³。然而，由于该方法无法分离同量异位化合物，具有相同质荷比（m/z）的不同聚糖结构在MS/MS中会产生混合的碎片谱图，难以解析¹³。如果需要确定黏蛋白聚糖的精确结构，应选择液相色谱-质谱法（LC-MS）作为首选方法。

本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析黏蛋白聚糖的实验方案，涵盖了从聚糖释放、脱盐、完全甲基化到数据采集与分析等过程中的所有关键步骤。需要指出的是，每个步骤均可采用不同的方法进行，且各种方法均具有其相应的优势与局限性。

在本方案中，我们采用还原性β-消除法释放糖链。该反应在碱性条件下进行。如果黏蛋白样品已处于悬浮状态且此前未经纯化，则必须使用pH试纸检测其pH值；若呈酸性，需将其pH值调节至约8–9。该方法的一个局限性在于，释放糖链所需的碱性条件也会导致唾液酸上常见的O-乙酰基发生水解，从而造成其丢失，这一反应称为皂化反应。

尽管文献中已描述了多种释放聚糖的方法^15,16,17,18，其中一些方法可保留不稳定的O-乙酰基团，但还原性β-消除法仍是该领域的金标准。该方法需要高浓度的盐，而盐类及其他抑制离子化的杂质必须在进行MALDI-TOF分析前去除¹⁹，因为它们会影响聚糖的电离效率和定量结果。在此，阳离子交换色谱结合甲醇蒸发去除硼酸盐被证明是去除黏蛋白释放聚糖中盐分的最有效方法。在此过程中，聚糖不与树脂结合而直接流过，钠离子则被树脂吸附。然而，离子交换柱的制备过程繁琐，使得该方法在处理大量样本的大规模实验中效率较低。在此类情况下，可优先选择PGC脱盐，因为该树脂也有96孔板形式可供使用。但如上所述，通过PGC提取进行脱盐可能导致洗脱效率低下，尤其是对较大的聚糖分子，因此在结果解读时应考虑这一因素。

尽管天然糖链也可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分析，但通常采用全甲基化处理，因为该反应可显著提高检测灵敏度，天然糖链的电离效率较低²⁰。此外，全甲基化可使带负电荷的糖链（如硫酸化或唾液酸化糖链）在正离子模式下更易于检测，并能保护不稳定的糖链表位（如唾液酸或岩藻糖）²⁰。通常情况下，全甲基化反应时间维持在5–10分钟^14,21，也有文献报道反应时间可延长至40分钟²²。本文结果表明，在所测试的条件下，唾液酸化糖链在5分钟全甲基化反应后未能被有效检测，需要更长的孵育时间。

除了反应时间外，另一个可能影响完全甲基化效率的因素是反应体系中的水分含量。水的存在可能导致聚糖发生甲基化不完全或部分甲基化，即并非所有羟基都被转化为甲基²³。这一情况容易通过质谱图中是否出现质量差为14 Da（羟基与甲基之间的质量差）的峰簇来判断。若发现甲基化不完全，可通过重复完全甲基化反应并重新分析数据来解决该问题。

糖链分析的一个限制因素是质谱图的解析。尽管近年来已有进展，但这一过程在很大程度上仍依赖人工，且需要对糖链生物合成途径具备扎实的知识和深入理解，才能准确注释质谱图。Glycoworkbench 等工具²⁴ 可协助提供可能的注释、聚糖结构及组成，但由于聚糖混合物本身具有固有的异质性，研究人员仍需自行判断哪一种选择是正确的。以上述使用PGM的示例为例，GlycoWorkbench为质荷比（m/z）2,025.7620处的峰提供了两种可能的聚糖组成，根据其裂解谱图，我们得出结论：该峰对应的是岩藻糖基化结构，而非唾液酸化结构。然而，若缺乏裂解谱图信息（对于丰度较低的聚糖而言这种情况很常见），研究人员可依据已有知识进行注释，例如已知具有Hex3HexNAc1Neu5Ac3组成的聚糖存在于神经节苷脂中，而非黏蛋白中，因此在PGM的研究背景下不应考虑该选项。因此，所鉴定的聚糖结构或组成应与以往发表的文献进行交叉验证，并需符合相关生物学和生化原则 O-糖链生物合成。总体而言，该方案是一项宝贵的资源，尤其适用于从事相关研究的科研人员 刚进入糖生物学领域，且对黏膜界面相互作用研究感兴趣。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
150 毫米玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	15202699	耗材 文中参考名称（如适用）：glass pipette
5 毫升离心管	Eppendorf	30122305	耗材
96 孔 HLB 萃取板	Fisher Scientific	16553290	耗材
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283	试剂
乙腈	Fisher Scientific	15624520	试剂
无水 DMSO	Sigma-Aldrich	5.89569	试剂
无水甲醇	Sigma-Aldrich	5.89596	试剂
Autoflex 质谱仪	Bruker		设备
DOWEX 50w x8 树脂，H+ 型，200-400 目	Sigma-Aldrich	44519	试剂 文中参考名称（如适用）：cation exchange resin
干式恒温加热器	Grant	QBD2	设备
用于加热块的蒸发/浓缩装置	Cole-Palmer	WZ-36610-99	设备
flexAnalysis	Bruker		软件，专有
flexControl	Bruker		软件，专有
Genevac EZ-2	Biopharma	EZ-2	设备 文中参考名称（如适用）：centrifugal evaporator
带匹配 PTFE 盖的玻璃小瓶（4 毫升）	Wheaton	DKW224582-144EA	耗材
带匹配 PTFE 盖的玻璃小瓶（8 毫升）	Fisher Scientific	11587413	耗材
玻璃棉	Supelco	1.04086	耗材
Glycoworkbench	NA		软件；可从 https://glycoworkbench.software.informer.com/ 下载
HLB 固相萃取小柱	Supelco	57493-U	耗材，可作为 96 孔 HLB 萃取板的替代品
碘甲烷	Sigma-Aldrich	289566	试剂
MALDI 样品靶板	Bruker		设备
ModulyoD 冷冻干燥机	Thermo Fisher	ModulyoD-230	设备 文中参考名称（如适用）：freeze dryer
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	试剂
NaOH 颗粒	Sigma-Aldrich	567530	试剂
50% NaOH 溶液	Sigma-Aldrich	415413	试剂
正压-96 处理仪	Waters	186006961	设备
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	试剂
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	T6508	试剂