我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。
我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。
了解G蛋白偶联受体（GPCR）表达如何影响细胞在不同组织微环境中的定位，对于阐明免疫细胞迁移机制至关重要。本文介绍了一种竞争性归巢实验方法，可用于研究由GPCR介导的T细胞向表达相应趋化因子配体的器官的定位，适用于短期和长期研究。该方法包括改进的重组小鼠干细胞病毒（MSCV）转导T细胞的实验流程，以表达目标GPCR或对照结构，随后将细胞输入受体小鼠进行竞争性归巢实验。通过流式细胞术和/或共聚焦显微镜分析细胞在不同器官中的分布情况。在短期实验（10–12小时）中，共聚焦显微镜揭示了明显的细胞定位模式，包括肺部的肺泡、支气管黏膜下层、静脉部位和间质，以及气管、胃和子宫角上皮层。在长期研究（1–7周）中，流式细胞术揭示了细胞在组织中优先富集的动态变化，以及随时间推移可能发生的成熟或重新定位过程。这种竞争性归巢实验是研究GPCR介导的细胞定位的有力工具，可为组织特异性分布提供重要见解，并在免疫学和治疗研究中具有潜在应用价值。
G蛋白偶联受体（GPCRs）在调控多种细胞过程（包括信号转导、神经传递、激素调节和免疫细胞迁移）中起着基础性作用1。它们在淋巴细胞迁移和定位的时空调控中发挥关键作用2。在免疫应答的启动阶段，局部微环境和细胞间相互作用促使T淋巴细胞表达一组独特的黏附分子和趋化因子受体，即归巢受体。这种适应性使经历过抗原刺激的T细胞能够与器官特异性的内皮细胞（ECs）相互作用，并迁移至特定靶组织。T细胞获得组织趋向性的能力对于有效的再次免疫应答至关重要，尤其是在同一器官反复发生感染的情况下3,4。
G蛋白偶联受体（GPCRs）引导免疫细胞迁移至特定组织和器官，在这些部位执行关键功能——例如，引导CD8+ T细胞和NK细胞归巢至肿瘤部位以发挥细胞毒性作用，或协助CD4+ T细胞通过促进其他免疫细胞的活化来协调免疫应答。深入理解GPCRs如何精确引导T细胞定位，对于推动靶向免疫治疗的发展至关重要5,6然而，挑战在于对这些复杂的相互作用进行建模 体外因为同时复制空间受限的信号和方向性趋化信号具有较大难度。
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本研究中所有小鼠均饲养于退伍军人事务部帕洛阿尔托医疗保健系统（VAPAHCS）的特定病原体阴性（SPF）设施中。B6/SJL Prprc Pep3BoyJ（CD45.1）、C57B6/J（CD45.2）和 Rag1-/- 小鼠购自杰克逊实验室。尽管我们使用PepBoy小鼠获取CD45.1细胞，但我们推荐使用JAXBoy（C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J）。JAXBoy是通过CRISPR技术而非传统回交方式构建的完全同源品系，具有更高的遗传一致性。以往使用非完全同源的PepBoy小鼠（CD45.1）进行CD45同种型标记研究时，通常需设置野生型（WT/WT）对照，以开展归巢和再循环实验，从而应对潜在的变异性。随着完全同源的JAXBoy小鼠现已可获得，这些额外的对照可能不再必要。研究人员仍应注意到CD45.1与CD45.2亚型之间的差异——例如它们作为蛋白酪氨酸磷酸酶的功能差异——可能会影响细胞行为和归巢模式。文中及下文所述所有实验方案均已获得批准，或符合退伍军人事务部帕洛阿尔托医疗保健系统（VAPAHCS）认证的实验动物医学科以及实验动物护理行政小组的指导方针 。动物处死采用经批准的程序 进行。实验中纳入了年龄为8–12周的雄性和雌性小鼠 。
1. MSCV 载体的制备
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本研究中，我们提供了一种详细方案，用于探究特定受体在体内引导T细胞定位的能力。作为该方案的示例，我们使用了GPR2513通过流式细胞术检测Thy1.1染色评估，采用本方案可实现30%–40%的转导效率。我们进行了 体外 使用GPR25转导细胞及空载体对照细胞进行基于transwell的趋化迁移实验，检测其向hCXCL17、mCXCL17以及作为阳性对照的CXCL12的迁移能力。与空载体转导细胞相比，GPR25转导的T细胞对CXCL17表现出显著迁移活性，证实了转导成功及受体的功能性表达（图2).
长期归巢
图1 展示了分析不同器官中T细胞的设门策略。在组织收获前5分钟注射抗CD45抗体，以排除血管内细胞的干扰。仅纳入TCRβ+ CD4+ Thy1.1+细胞，该表型提示转导成功。计算每个器官中表达GPCR的细胞与携带空载体的细.......
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本研究中所述的内对照归巢实验是一种全面的方法，用于检测G蛋白偶联受体介导的T细胞在不同器官和组织微环境中的迁移与定位。该方法整合了多项关键优化，以提高实验的可重复性、准确性和效率。
本方案的一个关键环节是利用MSCV逆转录病毒载体高效转导T细胞，这一过程通过使用Plat-E细胞进行病毒生产而得以实现。关键优化措施包括：保持Plat-E细胞在适当的汇合度，使用聚-D-赖氨酸包被的培养板以增强病毒转染效率，以及采用双重转导策略以最大化GPCR的表达。由于MSCV载体需要细胞处于活跃分裂状态才能有效整合至基因组，因此通过T细胞活化诱导其进入细胞周期可显著提高逆转录病毒的转导效率。高浓度的抗CD3和CD28抗体对于确保T细胞的活化和母细胞化至关重要，我们的研究发现，这种方法比文献中报道的较低浓度更为有效14。我们还发现，在培养基中添加细胞因子IL-2和IL-7对于维持T细胞存活并促进其扩增至关重要，从而确保获得足够数量且状态良好的转导T细胞，以支持准确的迁移与归巢研究。
除了优化逆转录病.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 AI178113 和 R01 AI047822，Leona M. & Harry B. Helmsley 慈善信托基金资助项目编号 1903-03787，以及加州烟草相关疾病研究计划（TRDRP）资助项目 T31IP1880 和 T33IR6609（授予 E.C.B.）；Y.B. 获克罗恩病与结肠炎基金会研究学者奖（835171）资助；B.O. 获拉蒙·阿雷塞斯基金会（西班牙马德里）博士后奖学金及克罗恩病与结肠炎基金会研究学者奖（574148）资助；A.A. 获加州再生医学研究所（CIRM）EDUC2-12677 项目资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AF647 抗小鼠 CD90.1-Thy1.1 (OX-7) | Biolegend | 202507 | |
| 抗 CD31 (DyLight 633，克隆 390) | InvivoMab | BE0377 | |
| 抗小鼠 CD28 37.51 | eBiosciences | ||
| 抗小鼠 CD3 145-2c11 | eBiosciences | ||
| APCCy7 抗小鼠 CD3 (145-2c11) | Biolegend | 100329 | |
| BV421 抗小鼠 CD8b (Ly-3) | Biolegend | 126629 | |
| BV711 抗小鼠 CD4 (RM4-5) | Biolegend | 100549 | |
| CD90.1 磁珠 | Miltenyi | 130-121-273 | |
| CFSE | Thermoscientific | C34554 | |
| 异硫氰酸荧光素 (FITC) 抗小鼠 CD45.2 (104) | BD | AB_395041 | |
| 小鼠 IL2 | Peprotech | 200-02-50UG | |
| 小鼠 IL7 | Peprotech | 217-17-10UG | |
| 小鼠 T 细胞 CD4 分离试剂盒 | STEMCELL technologies | 18000 | |
| MSCV-IRES-Thy1.1 GPR25 | Vectorbuilder | ||
| MSCV-IRES-Thy1.1 空载体 | Vectorbuilder | ||
| PE-CD45 (30-F11) 抗体 | Biolegend | 103105 | |
| PECy7 抗小鼠 TCRβ (H57-597) | Tonbo | ||
| PercpCy5.5 抗小鼠 CD45.1 (A20) | eBiosciences | ||
| Platinum-E (Plat-E) | cell Biolabs. Inc | RV-101 | |
| 黄色荧光染料 | Thermoscientific |
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