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方法文章

一种改良的QuEChERS-HPLC方法用于检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

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DOI：

10.3791/67757

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2025年6月13日

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于检测斑马鱼胚胎内16种多环芳烃的含量水平。

摘要

孕妇暴露于空气动力学直径小于或等于2.5 µm的细颗粒物（PM2.5）已被证实与人类自然流产及多种先天性疾病相关。然而，其潜在的作用机制尚不明确。斑马鱼胚胎被广泛用于研究PM2.5的发育毒性，但检测其中多环芳烃（PAHs）——PM2.5主要毒性成分——在体内的蓄积水平仍存在挑战。本研究建立了一种快速、简便、廉价、高效、耐用且安全的高效液相色谱法（QuEChERS-HPLC），用于评估美国环境保护署（EPA）优先污染物清单中所列的16种PAHs在斑马鱼胚胎内的内暴露水平。将斑马鱼胚胎在受精后2至72小时（hpf）期间暴露于PM2.5的可提取有机物（EOM）中。采用QuEChERS方法进行样品前处理，并利用HPLC-FLD/DAD（配备荧光检测器和二极管阵列检测器的高效液相色谱）对PAHs进行定性和定量分析。我们成功在暴露于PM2.5的斑马鱼胚胎中检测到六种PAHs，分别为菲、蒽、芴、苊烯、荧蒽和芘。该方法对于深入探究PM2.5诱导发育毒性的机制具有重要意义。

引言

细颗粒物（PM2.5）的空气动力学直径小于或等于 2.5 µm，是主要的环境风险因素。由于其粒径微小，PM2.5 能够进入血液循环系统并穿透母胎屏障。流行病学研究已将孕妇暴露于 PM2.5 与自然流产及多种先天性疾病联系起来1,2,3,4。然而，PM2.5 对胚胎毒性的潜在机制尚不明确。多环芳烃（PAHs）是 PM2.5 的主要毒性成分，因其具有致突变性和致癌性，对人体具有高度毒性5,6。在数百种多环芳烃中，有 16 种已被美国环境保护署（EPA）列为优先控制污染物。

斑马鱼（Danio rerio）是一种强大的脊椎动物模式生物，因其与人类具有较高的遗传相似性、发育迅速、繁殖率高且易于饲养而被广泛应用。斑马鱼胚胎具有透明特性，可在显微镜下直接观察其全身结构，便于开展精细研究。溶解态的多环芳烃（PAHs）可通过扩散作用进入斑马鱼胚胎7。已有大量研究利用斑马鱼胚胎探讨细颗粒物（PM2.5）中可提取有机物（EOM）的毒性效应及其作用机制8,9,10,11。然而，这些研究大多仅限于分析EOM中16种优先控制的多环芳烃，尚未检测斑马鱼胚胎体内多环芳烃的蓄积水平12。这一技术难题可能源于斑马鱼胚胎体积微小以及胚胎基质成分复杂。

快速、简便、廉价、高效、耐用且安全（QuEChERS）方法是一种创新的样品前处理技术，用于食品和环境样品中农药残留、兽药及其他污染物的分析13,14。当与高效液相色谱法（HPLC）联用时，该方法已被用于检测斑马鱼中的农药15。多环芳烃（PAHs）含有两个或更多苯环，具有强烈的荧光特性，因此特别适用于荧光检测器进行检测。在本研究中，我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于评估暴露于EOM的斑马鱼胚胎中16种PAHs的含量水平。

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方案

1. 样品处理

  1. PM2.5 的采集
    1. 使用 47 mm 石英膜滤膜采集 PM2.5。
      注：PM2.5 样品采自中国苏州城区。
  2. EOM 提取
    1. 将滤膜剪成小片，放入锥形玻璃烧瓶中，加入 150 mL 乙腈。
    2. 在 35 °C 下超声提取 1 小时，然后将提取液转移至四个 50 mL 离心管中。
    3. 在 7,000 × g 下离心 20 分钟，将上清液转移至旋转蒸发仪中，浓缩至约 5 mL。
    4. 在 35 °C 水浴中通氮气吹干，残留物用二甲基亚砜（DMSO）溶解。
  3. 斑马鱼胚胎处理
    1. 将斑马鱼饲养于循环水系统中，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗，水温维持在 28 °C16。
    2. 收集受精卵（每组 200 枚胚胎），转移至玻璃培养皿（钠钙玻璃，80 × 15 mm）中，每皿加入 30 mL 循环系统中的养殖水。
    3. 在受精后 2 小时（hpf），向含有 200 枚胚胎的玻璃培养皿中加入 30 µL EOM（10 mg/mL）。未处理组作为空白对照。
      注：EOM 的终浓度为 10 mg/L，依据为心脏畸形率（补充图 S1）。
    4. 将培养皿置于 28 °C 培养箱中孵育。

2. QuEChERS 样品制备

  1. 从培养箱中取出72 hpf的胚胎培养皿，用纯水清洗胚胎3次。
  2. 将胚胎转移至1.5 mL离心管中（按不同分组），并去除多余水分。
  3. 将离心管放入-80 °C超低温冰箱中冷冻30分钟以冻干胚胎17，随后用玻璃棒研磨胚胎。
  4. 向DMSO对照组中加入25 µL的16种PAH混合标准溶液（2.0 µg/mL），用于检测加标回收率。
  5. 加入1 mL n-己烷，涡旋振荡30秒，然后在35 °C下超声萃取30分钟。
  6. 在7,000 × g条件下离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。
  7. 重复步骤2.5和2.6。
  8. 在35 °C水浴中，用氮气流将收集的上清液吹干至近干。
  9. 加入1 mL乙腈，涡旋振荡30秒。
  10. 加入10 mg初级次级胺（PSA）、45 mg硫酸镁和15 mg C18填料，涡旋振荡30秒。
  11. 在7,000 × g条件下离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。
  12. 重复步骤2.9，并在7,000 × g条件下离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。
  13. 用氮气将上清液吹至0.5 mL。
  14. 通过0.22 µm微孔滤膜过滤。

3. 使用高效液相色谱法测定多环芳烃

  1. 使用乙腈配制一系列16种多环芳烃（PAH）混合标准品的工作溶液（浓度范围为1至500 ng/mL），并以乙腈/水作为流动相，将溶液注入液相色谱仪。
    1. 进样量为20 µL，采用以下洗脱程序：0–18.5 min，乙腈从40%梯度升至100%；18.5–28 min，保持100%乙腈；28–29.5 min，乙腈从100%降至40%；停止时间：32 min；柱温：25 °C；流速：1.8 mL/min。以标准工作溶液的质量浓度为横坐标（x轴），相应峰面积为纵坐标（y轴），绘制标准曲线，浓度范围覆盖5 ng/mL至500 ng/mL。
      注：多环芳烃的激发/发射波长见补充表S1。
  2. 将纯化后的样品（来自步骤2.14）注入配备荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD）的液相色谱仪中。
  3. 通过比较保留时间鉴定多环芳烃的存在，并测量相应的峰面积。
    注：多环芳烃的质量浓度通过步骤3.1.1中建立的标准曲线确定。
  4. 根据样品测得的质量浓度，计算16种多环芳烃的内标浓度。

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结果

整个EOM暴露、样品制备及多环芳烃检测流程如图1所示。对于HPLC-FLU/DAD分析，信噪比为3:1，检测范围在0.3至5.0 ng/mL之间时被视为可接受。方法检出限为3.0 × 10-4 至 5.0 × 10-3 ng/生物个体。所有校准曲线均表现出良好的线性关系（r2 > 0.999）。通过基质样品提取物测定的精密度值均低于5%。加标回收率范围为82.0%至96.3%（表1）。

如图所示 表2 和 补充图 S2在暴露于EOM的斑马鱼胚胎中，成功检测到六种多环芳烃（PAHs），分别为菲（Phe）、蒽（Ant）、芴（Flu）、苊烯（Acp）、荧蒽（Fla）和芘（Pyr）。相比之下，在DMSO对照样品中仅检测到两种PAHs，即Phe和Flu，其含量显著低于EOM样品中的水平。

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讨论

斑马鱼胚胎是研究发育毒性的有力脊椎动物模型，但其体积较小，给多环芳烃（PAHs）等半挥发性有机化合物（SVOCs）的检测带来困难。在样品制备过程中，防止斑马鱼胚胎污染至关重要。对样品进行适当清洗是避免暴露介质中的化合物带入样品提取物中的关键步骤。清洗不充分可能导致结果高估，而过度清洗则可能导致胚胎内源性物质流失，造成结果低估。在多环芳烃提取过程中，必须去除来自斑马鱼胚胎的水分和杂质。

对于脱水，通常使用硅藻土或无水硫酸钠。然而，我们在硅藻土和无水硫酸钠中均检测到痕量的多环芳烃（PAHs），且不同品牌之间存在轻微差异。因此，这些材料在使用前需在450 °C下烘烤至少2小时。我们采用了一种简便的低温冷冻干燥方法对样品进行干燥，并添加PSA和C18以避免污染并去除杂质。

本研究优化了多种前处理参数，包括提取溶剂、温度、时间以及纯化试剂的用量。所得线性范围为5.0至500 ng/mL，相关系数超过0.999。16种多环芳烃的日间精密度低于6%，回收率范围为82.0%至96.3%。与以往研究相比，本方法表现出更高的...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作受到国家自然科学基金（资助号：81972999）和苏州市科技发展计划（医学应用基础研究，SKY2023036 和 SKY2023115）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16 种多环芳烃混合标准溶液 o2si Smart Solutions (South Carolina, USA)110124-0616 种多环芳烃混合标准溶液  包括萘（Nap）、苊烯（Acy）、苊（Ace）、芴（Flo）、菲（Phe）、蒽（Ant）、荧蒽（Flu）、芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、屈（Chr）、苯并[b]荧蒽（BbF）、苯并[k]荧蒽（BkF）、苯并[a]芘（BaP）、茚并[1,2,3-cd]芘（IcdP）、二苯并[a,h]蒽（DahA）、苯并[g,h,i]苝（BghiP）。
1260 Infinity II LC 系统Agilent Technologies (Santa Clara, USA)FLD(G1321A)；DAD SL (G1315C)
乙腈Scharlab (Barcelona, Spain)AC03661000溶剂
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL 实验室技术（上海）有限公司 (Shanghai, CHINA)SBEQ-CA0801C18 填料是一种在亲水性和疏水性之间具有良好平衡的反相填料，能够有效吸附并分离极性和非极性有机化合物。
硅藻土Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)12214013用于分离、纯化及去除有机杂质‌
分散固相萃取 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056样品纯化
滤膜ANPEL 实验室技术（上海）有限公司 (Shanghai, CHINA)SCAA-104有机相针头滤器（尼龙），0.22µm
正己烷Scharlab (Barcelona, Spain)HE02481000溶剂
MilliporeMerck (New Jersey, USA)制备超纯水
Organomation - N-EVAP 氮吹仪Organomation (Massachusetts, USA)溶剂蒸发
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, USA)离心
 Vortex-Genie 2 (G560E)Scientific Industries (New York, USA)涡旋振荡
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918该色谱柱常用于高效液相色谱系统，以实现对多环芳烃的精确且可靠的分析。

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