一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

Summary

我们开发了一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法来评估斑马鱼胚胎中 16 种 PAHs 的内部水平。

Abstract

产妇暴露于空气动力学直径为 2.5 μm 或更小的细颗粒物 （PM_2.5） 与人类自然流产和各种先天性疾病有关。然而，潜在机制仍不清楚。斑马鱼胚胎被广泛用于研究 PM_2.5 的发育毒性，但测量 PM_2.5 的主要有毒成分多环芳烃 （PAH） 的内部水平是一项挑战。在这项研究中，我们开发了一种快速、简单、廉价、有效、耐用且安全的高效液相色谱 （QuEChERS-HPLC） 方法，以评估美国环境保护署 （EPA） 优先污染物清单中列出的 16 种 PAH 的内部水平。斑马鱼胚胎用 PM_2.5 的可提取有机物 （EOM） 处理受精后 2-72 小时 （hpf）。采用 QuEChERS 方法进行样品制备，采用 HPLC-FLD/DAD （HPLC 联合荧光检测器和二极管阵列检测器） 对 PAHs 进行定性和定量分析。我们成功在暴露于 PM_2.5 的斑马鱼胚胎中检测到 6 种 PAH （菲、蒽、芴、苊、苊、荧蒽和芘）。该方法对于研究 PM_2.5 诱导的发育毒性机制至关重要。

Introduction

细颗粒物 （PM_2.5），空气动力学直径为 2.5 μm 或更小。是一个主要的环境风险因素。由于体积小，PM_2.5 能够进入循环系统并渗透母胎屏障。流行病学研究将母亲暴露于 PM_2.5 与自然流产和各种先天性疾病联系起来 1,2,3,4。然而，PM_2.5 胚胎毒性的潜在机制尚不清楚。PAH 是 PM_2.5 的主要毒性成分，由于其致突变和致癌特性，对人类具有剧毒 ^5,6。在数百种 PAH 中，有 16 种已被美国环境保护署 （EPA） 指定为高优先级污染物。

斑马鱼 Danio rerio 是一种强大的脊椎动物模式生物，因为它与人类的基因相似、发育迅速、繁殖率高且易于维护。斑马鱼胚胎的透明度允许在显微镜下直接观察整个身体，从而进行详细的研究。溶解的 PAH 可以通过扩散进入斑马鱼胚胎

Protocol

1. 样品处理

1. PM_2.5 系列
   1. 在 47 mm 石英膜过滤器上收集 PM_2.5 。
      注：PM_2.5 采集于中国苏州市区。
2. EOM 提取
   1. 将过滤器切成小块，放入装有 150 mL 乙腈的锥形玻璃瓶中。
   2. 将烧瓶在 35 °C 下超声处理 1 小时，然后将提取物转移到四个 50 mL 试管中。
   3. 以 7,000 × g 离心 20 分钟，然后将上清液转移到旋转蒸发仪中，并将其浓缩至约 5 mL。
   4. 在 35 °C 水浴中氮气流下蒸发至干，并将残留物溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中。
3. 斑马鱼胚胎治疗
   1. 将斑马鱼保持在循环水系统中，在 28 °C 下以 14 小时的光照和 10 小时的黑暗循环进行¹⁶。
   2. 收集受精卵（每组 200 个胚胎）并将它们转移到玻璃培养皿（钠钙玻璃，80 x 15 毫米）中，用 30 mL 来自循环水系统的水。
   3. 在受精后 2 小时 （hpf） 将 30 μL EOM （10 mg/mL） 添加到含有....

Results

EOM 暴露、样品制备和 PAH 检测的整个过程如图 1 所示。对于 HPLC-FLU/DAD，信噪比为 3：1，检测范围为 0.3 至 5.0 ng/mL，被认为是可接受的。方法检测限范围为 3.0 × ^10-4 至 5.0 × ^10-3 ng/生物体。所有校准曲线均表现出高线性度 （r² > 0.999）。使用从基质样品中获得的提取物确定的精密度值低于 5%。加标回收率从 82.0% 到 96.3% 不等（表 1）。

如 表 2 和 补充图 S2 所示，在 EOM 暴露的斑马鱼胚胎中成功检测到六种多环芳烃，即菲 （Phe）、蒽 （Ant）、芴 （Flu）、苊 （Acp）、氟蒽 （Fla） 和芘 （Pyr）。相比之下，在 DSMO 对照样品中仅鉴定出两种 PAHS，即 Phe 和 Flu，其水平显著低于 EOM 样品中的水平。

Discussion

斑马鱼胚胎是用于发育毒性研究的强大脊椎动物模型，但它们的小尺寸使 PAH 等半挥发性有机化合物 （SVOC） 的检测变得复杂。在样品制备过程中，防止斑马鱼胚胎受到污染至关重要。正确清洁样品是避免化合物从暴露介质中残留到样品提取物中的关键步骤。不完全清洗会导致高估，而过度清洗会导致胚胎内部物质的损失，从而导致低估。在提取 PAH 过程中，有必要去除来自斑马鱼胚胎的水和杂质。

脱水时，通常使用硅藻土或无水硫酸钠。然而，我们在硅藻土和无水硫酸钠中均检测到痕量的 PAHs，品牌之间略有不同。因此，这些材料在使用前需要在 450 °C 下烘烤至少 2 小时。我们采用一种方便的低温冷冻干燥方法对样品进行干燥，并添加了 PSA 和 C₁₈ 以避免污染并去除杂质。

本研究优化了各种预处理参数，包括提取溶剂、温度、时间和纯化试剂剂量。所得线性范围为 5.0 至 500 ng/mL，相关系数超过 0.999。16 种 PAHs 的日内精密度低于 6%，回收率.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16种PAHs混合标准溶液	o2si Smart Solutions （South Carolina， USA）	110124-06	16 PAHs混合标准溶液 包括萘（Nap）、苊（Acy）、乙萘（Ace）、芴（Flo）、菲（Phe）、蒽（Ant）、芽（Flu）、芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、烯（Chr）、苯并[b]芴（BbF）、苯并[k]芴（BkF）、苯并[a]芘（BaP）、芘[1,2,3-cd]芘（IcdP）、二苯并[a，h]蒽 （DahA），苯并 [g，h，i] 苜 （BghiP）。
1260 Infinity II LC 系统	Agilent Technologies（美国圣克拉拉）		FLD（G1321A）;DAD SL （G1315C）
乙腈	Scharlab（西班牙巴塞罗那）	AC03661000	溶剂
CNWBOND HC-C18 SPE	安宝实验室技术（上海）有限公司（中国上海）	SBEQ-CA0801	C18填料是一种亲水疏水平衡良好的反相填料，能很好地吸附和分离极性和非极性有机化合物。
硅藻土	Agilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）	12214013	用于分离、纯化和去除有机杂质‌
分散SPE 15 mL，EN	Agilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）	5982-5056	样品纯化
过滤器	ANPEL Laboratory Technologies （Shanghai） Inc.（中国上海）	SCAA-104	有机相针式过滤器（尼龙），0.22µm
Hexane	Scharlab（西班牙巴塞罗那）	HE02481000	剂
Millipore	Merck（美国新泽西州）		制备超纯水
有机化 - N-EVAP 氮气蒸发器	化（美国		蒸发溶剂
Sorvall ST4 Plus	Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）		离心
Vortex- Genie 2 （G560E）	Scientific Industries（美国纽约）		Vortex
ZORBAX Eclipse PAH	Agilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）	959990-918	色谱柱通常用于HPLC系统，以实现PAHs的精确可靠分析。