Method Article

一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃

DOI:

10.3791/67757

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

In This Article

Summary

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我们开发了一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法来评估斑马鱼胚胎中 16 种 PAHs 的内部水平。

Abstract

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产妇暴露于空气动力学直径为 2.5 μm 或更小的细颗粒物 （PM2.5） 与人类自然流产和各种先天性疾病有关。然而，潜在机制仍不清楚。斑马鱼胚胎被广泛用于研究 PM2.5 的发育毒性，但测量 PM2.5 的主要有毒成分多环芳烃 （PAH） 的内部水平是一项挑战。在这项研究中，我们开发了一种快速、简单、廉价、有效、耐用且安全的高效液相色谱 （QuEChERS-HPLC） 方法，以评估美国环境保护署 （EPA） 优先污染物清单中列出的 16 种 PAH 的内部水平。斑马鱼胚胎用 PM2.5 的可提取有机物 （EOM） 处理受精后 2-72 小时 （hpf）。采用 QuEChERS 方法进行样品制备，采用 HPLC-FLD/DAD （HPLC 联合荧光检测器和二极管阵列检测器） 对 PAHs 进行定性和定量分析。我们成功在暴露于 PM2.5 的斑马鱼胚胎中检测到 6 种 PAH （菲、蒽、芴、苊、苊、荧蒽和芘）。该方法对于研究 PM2.5 诱导的发育毒性机制至关重要。

Introduction

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细颗粒物 （PM2.5），空气动力学直径为 2.5 μm 或更小。是一个主要的环境风险因素。由于体积小，PM2.5 能够进入循环系统并渗透母胎屏障。流行病学研究将母亲暴露于 PM2.5 与自然流产和各种先天性疾病联系起来 1,2,3,4。然而，PM2.5 胚胎毒性的潜在机制尚不清楚。PAH 是 PM2.5 的主要毒性成分，由于其致突变和致癌特性，对人类具有剧毒 5,6。在数百种 PAH 中，有 16 种已被美国环境保护署 （EPA） 指定为高优先级污染物。

斑马鱼 Danio rerio 是一种强大的脊椎动物模式生物，因为它与人类的基因相似、发育迅速、繁殖率高且易于维护。斑马鱼胚胎的透明度允许在显微镜下直接观察整个身体，从而进行详细的研究。溶解的 PAH 可以通过扩散进入斑马鱼胚胎7。许多研究使用斑马鱼胚胎来探索 PM2.58、9、10、11 中可提取有机物 （EOM） 的毒性作用和机制。然而，这些研究中的大多数只表征了 EOM 中的 16 种优先 PAH，而没有检测到斑马鱼胚胎中 PAH 的内部水平12。这种挑战可能是由于斑马鱼胚胎体积小和胚胎基质的复杂性。

快速、简便、廉价、有效、耐用和安全 （QuEChERS） 方法是一种创新的样品制备技术，用于分析食品和环境样品中的农药残留、兽药和其他污染物13,14。当与高效液相色谱 （HPLC） 结合使用时，该方法已用于检测斑马鱼15 中的农药。PAH 包含两个或多个苯环，具有很强的荧光特性，特别适合使用荧光检测器进行检测。在这项研究中，我们开发了一种改进的 QuEChERS-HPLC 方法来评估暴露于 EOM 的斑马鱼胚胎中 16 种 PAHs 的水平。

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Protocol

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1. 样品处理

  1. PM2.5 系列
    1. 在 47 mm 石英膜过滤器上收集 PM2.5 。
      注：PM2.5 采集于中国苏州市区。
  2. EOM 提取
    1. 将过滤器切成小块，放入装有 150 mL 乙腈的锥形玻璃瓶中。
    2. 将烧瓶在 35 °C 下超声处理 1 小时，然后将提取物转移到四个 50 mL 试管中。
    3. 以 7,000 × g 离心 20 分钟，然后将上清液转移到旋转蒸发仪中，并将其浓缩至约 5 mL。
    4. 在 35 °C 水浴中氮气流下蒸发至干，并将残留物溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中。
  3. 斑马鱼胚胎治疗
    1. 将斑马鱼保持在循环水系统中，在 28 °C 下以 14 小时的光照和 10 小时的黑暗循环进行16。
    2. 收集受精卵（每组 200 个胚胎）并将它们转移到玻璃培养皿（钠钙玻璃，80 x 15 毫米）中，用 30 mL 来自循环水系统的水。
    3. 在受精后 2 小时 （hpf） 将 30 μL EOM （10 mg/mL） 添加到含有 200 个胚胎的玻璃培养皿中。未处理的组用作空白对照。
      注：EOM 的最终浓度为 10 mg/L，基于心脏畸形率（补充图 S1）。
    4. 将培养皿放入 28 °C 培养箱中。

2. QuEChERS 样品制备

  1. 从培养箱中取出带有 72 hpf 胚胎的培养皿。用纯水清洗胚胎 3 次。
  2. 将胚胎转移到 1.5 mL 试管中（根据不同组）并去除多余的水。
  3. 将试管放入 -80 °C 冰箱中 30 分钟，以冻干 embyros17 并冻干它们。然后，使用玻璃棒研磨胚胎。
  4. 向 DMSO 对照组中加入 25 μL 16 PAH 混合标准溶液 （2.0 μg/mL），以检测加标回收率。
  5. 加入 1 mL 正己烷并涡旋 30 秒，然后在 35 °C 下超声处理 30 分钟。
  6. 以 7,000 × g 离心 5 分钟，然后将上清液转移到新试管中。
  7. 重复步骤 2.5 和 2.6。
  8. 在 35 °C 水浴中，在氮气流下将收集的上清液蒸发至干燥。
  9. 加入 1 mL 乙腈并涡旋 30 秒。
  10. 加入 10 mg 伯仲胺 （PSA）、45 mg 硫酸镁和 15 mg C18 填料，然后涡旋 30 s。
  11. 以 7,000 × g 离心 5 分钟，然后将上清液转移到新试管中。
  12. 重复步骤 2.9 并以 7,000 × g 离心 5 分钟。将上清液转移到新试管中。
  13. 在氮气下将上清液蒸发至 0.5 mL。
  14. 通过 0.22 μm 微孔膜过滤。

3. 使用 HPLC 测定 PAH

  1. 为含乙腈的 16 PAH 混合标准品制备一系列工作溶液（范围为 1 至 500 ng/mL），并以乙腈/水为流动相，将其注入液相色谱仪中。
    1. 进样 20 μL 并使用以下洗脱程序：0-18.5 分钟，40% 乙腈至 100% 乙腈;18.5-28 min，100% 乙腈;28-29.5 min，100% 至 40% 乙腈;停止时间： 32 min;柱温：25 °C;流速：1.8 mL/min。绘制标准曲线，x 轴上显示标准工作溶液的质量浓度，y 轴上显示相应的峰面积，范围为 5 ng/mL 至 500 ng/mL。
      注：PAH 的激发/发射波长可在 补充表 S1 中找到。
  2. 将纯化的样品（来自步骤 2.14）注入带有荧光检测器 （FLD） 和二极管阵列检测器 （DAD） 的液相色谱仪中。
  3. 通过比较保留时间来识别 PAH 的存在，并测量相关的峰面积。
    注意：使用步骤 3.1.1 中先前生成的标准曲线测定 PAH 的质量浓度。
  4. 根据样品的测量质量浓度计算 16 种 PAH 的内部浓度。

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Results

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EOM 暴露、样品制备和 PAH 检测的整个过程如图 1 所示。对于 HPLC-FLU/DAD，信噪比为 3：1，检测范围为 0.3 至 5.0 ng/mL，被认为是可接受的。方法检测限范围为 3.0 × 10-4 至 5.0 × 10-3 ng/生物体。所有校准曲线均表现出高线性度 （r2 > 0.999）。使用从基质样品中获得的提取物确定的精密度值低于 5%。加标回收率从 82.0% 到 96.3% 不等（表 1）。

如 表 2 和 补充图 S2 所示，在 EOM 暴露的斑马鱼胚胎中成功检测到六种多环芳烃，即菲 （Phe）、蒽 （Ant）、芴 （Flu）、苊 （Acp）、氟蒽 （Fla） 和芘 （Pyr）。相比之下，在 DSMO 对照样品中仅鉴定出两种 PAHS，即 Phe 和 Flu，其水平显著低于 EOM 样品中的水平。

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Discussion

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斑马鱼胚胎是用于发育毒性研究的强大脊椎动物模型，但它们的小尺寸使 PAH 等半挥发性有机化合物 （SVOC） 的检测变得复杂。在样品制备过程中，防止斑马鱼胚胎受到污染至关重要。正确清洁样品是避免化合物从暴露介质中残留到样品提取物中的关键步骤。不完全清洗会导致高估，而过度清洗会导致胚胎内部物质的损失，从而导致低估。在提取 PAH 过程中，有必要去除来自斑马鱼胚胎的水和杂质。

脱水时，通常使用硅藻土或无水硫酸钠。然而，我们在硅藻土和无水硫酸钠中均检测到痕量的 PAHs，品牌之间略有不同。因此，这些材料在使用前需要在 450 °C 下烘烤至少 2 小时。我们采用一种方便的低温冷冻干燥方法对样品进行干燥，并添加了 PSA 和 C18 以避免污染并去除杂质。

本研究优化了各种预处理参数，包括提取溶剂、温度、时间和纯化试剂剂量。所得线性范围为 5.0 至 500 ng/mL，相关系数超过 0.999。16 种 PAHs 的日内精密度低于 6%，回收率...

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Disclosures

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作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

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这项工作得到了中国国家自然科学基金（资助号：81972999）和苏州市科学技术发展计划（医学应用基础研究，SKY2023036和SKY2023115）的财政支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16种PAHs混合标准溶液 o2si Smart Solutions （South Carolina， USA）110124-0616 PAHs混合标准溶液 包括萘（Nap）、苊（Acy）、乙萘（Ace）、芴（Flo）、菲（Phe）、蒽（Ant）、芽（Flu）、芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、烯（Chr）、苯并[b]芴（BbF）、苯并[k]芴（BkF）、苯并[a]芘（BaP）、芘[1,2,3-cd]芘（IcdP）、二苯并[a，h]蒽 （DahA），苯并 [g，h，i] 苜 （BghiP）。
1260 Infinity II LC 系统Agilent Technologies（美国圣克拉拉）FLD（G1321A）;DAD SL （G1315C）
乙腈Scharlab（西班牙巴塞罗那）AC03661000溶剂
CNWBOND HC-C18 SPE 安宝实验室技术（上海）有限公司（中国上海）SBEQ-CA0801C18填料是一种亲水疏水平衡良好的反相填料，能很好地吸附和分离极性和非极性有机化合物。
硅藻土Agilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）12214013用于分离、纯化和去除有机杂质‌
分散SPE 15 mL，ENAgilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）5982-5056样品纯化
过滤器ANPEL Laboratory Technologies （Shanghai） Inc.（中国上海）SCAA-104有机相针式过滤器（尼龙），0.22µm
HexaneScharlab（西班牙巴塞罗那）HE02481000剂
MilliporeMerck（美国新泽西州）制备超纯水
有机化 - N-EVAP 氮气蒸发器化（美国蒸发溶剂
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）离心
 Vortex- Genie 2 （G560E）Scientific Industries（美国纽约）Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies， Inc（美国圣克拉拉）959990-918色谱柱通常用于HPLC系统，以实现PAHs的精确可靠分析。
溶有机马萨诸塞州）该

References

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QuEChERS HPLCPolycyclic Aromatic HydrocarbonsZebrafish EmbryosFine Particulate MatterPAH DetectionSample PreparationFluorescence DetectorDiode Array DetectorExtractable Organic MatterDevelopmental Toxicity

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