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方法文章

稳定同位素 体内 用于质谱鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的父源代谢物的标记方法

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DOI：

10.3791/67765

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2025年6月17日

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

本文内容

摘要

本实验旨在通过使用2H2O或U13C葡萄糖进行稳定同位素标记，结合代谢组学分析，鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的代谢物。将氘标记的雄性个体与未标记的雌性个体交配，收集着床前胚胎，利用质谱分析技术区分父源（氘化）与母源（非氘化）代谢物。

摘要

几十年来，父源对胚胎遗传的贡献一直局限于等位基因序列。然而，近十年的研究结果表明，表观遗传因素——包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体结构以及调控性RNA——在父系遗传中发挥着关键作用，并影响胚胎发育及合子基因的表达。除核酸外，精子代谢组 （脂质、碳水化合物、游离氨基酸）也可能作为表观遗传信号。本实验方案旨在通过质谱技术鉴定从精子传递至卵母细胞的代谢物。该方法包括利用2H2O或U13C葡萄糖对精子细胞进行稳定同位素标记，从而通过代谢组学手段追踪受精过程中由父源传递至卵母细胞的代谢物。本方案的总体目标是揭示父源精子代谢组在子代代谢紊乱易感性中的作用，也可进一步调整用于研究环境因素（如饮食和污染物暴露）如何改变父源代谢信号，进而可能影响子代健康以及糖尿病、肥胖和心血管疾病等疾病的易感性。

引言

父系表观基因组影响子代代谢紊乱的易感性
与母亲在胚胎发育过程中发挥的大量孕前和孕后作用不同，几十年来人们一直认为精子细胞的贡献仅限于遗传物质。根据遗传理论，父系对个体表型变异（包括对疾病的易感性）的贡献，完全归因于父源遗传等位基因的DNA序列及其与母源遗传等位基因之间的相互作用1。如今已明确，等位基因并非父亲在受精过程中传递给子代的唯一遗传信息，实际上多种多样的表观遗传信号也参与了父系遗传2,3,4。目前已鉴定出的表观遗传信号包括：（1）共价添加至亲本基因组胞嘧啶上的甲基基团5,6,7；（2）与精子染色体结合并传递至卵母细胞的组蛋白翻译后修饰（如乙酰化、甲基化）8；（3）父源染色体的三维结构，导致染色体内相互作用（也称为拓扑关联结构域，TAD），并在受精卵中持续存在9,10；以及（4）在受精过程中由精子释放进入卵母细胞的调控性RNA分子，包括miRNA、tRNA衍生片段和piwi相互作用RNA（piRNA）11,12，以及rRNA13和tRNA14。

父系表观基因组是传递给子代的重要信息载体。父系信息将影响受精卵、胚胎发育过程，以及出生后子代发生代谢紊乱和疾病的风险。这种非孟德尔遗传（根据是否影响一代或多代连续世代，被称为跨代遗传或隔代遗传）被许多研究者认为是导致发达国家代谢性疾病急剧增加的潜在影响因素之一15。事实上，根据健康与疾病父源假说（PoHaD）和健康与疾病发育起源假说（DoHaD），亲代表观遗传贡献是使子代成年后易患糖尿病、肥胖症和心血管疾病的因素之一16,17。值得注意的是，亲代表观基因组对环境刺激极为敏感，可受到代谢状态（如药物使用、饮食习惯和代谢健康状况）18 以及严格意义上的环境因素（如接触污染物、社会关系，以及心理和人际关系压力）5,11 的影响。上述每一种刺激都可能改变生殖细胞（精子和卵母细胞）的表观基因组，从而影响后代。

高脂饮食（HFD）的摄入是最受广泛关注的环境刺激之一，能够改变父代表观基因组，并将有害信息传递给后代19。这种刺激会影响后代（直至第三代）的表型，这些后代通常表现出更高的代谢紊乱倾向，无论其热量摄入如何。在小鼠和大鼠中，摄入高脂饮食的父代所生育的后代表现出生长迟缓、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗20,21。在人类中，表观遗传继承主要研究的是在饥荒或过度进食时期及其紧随其后出生的几代人22。在Överkalix队列研究中，父系祖父母在缓慢生长期的食物可获得性与其孙辈的总体死亡风险、心血管疾病、BMI、腰围和脂肪质量相关23。最近，其他队列研究也证实了父系跨代传递的证据24。

参与代际遗传的父源代谢物
尽管存在临床和流行病学证据，父源代际遗传的分子机制仍不明确。首先，所有传递表观遗传信息的分子介质尚未被完全鉴定。科学证据表明，仅精子的核酸成分本身无法解释代际遗传的复杂性。确实在高脂饮食（HFD）喂养的小鼠和大鼠精子中检测到DNA甲基化的改变，但发生改变的精子比例极低，不足以解释子代中观察到的代谢紊乱表型的高外显率25。另一方面，从精子传递至卵母细胞的信号RNA池半衰期极短，尽管其能够影响合子基因表达，但在受精后，包括2日龄、3日龄胚胎、桑葚胚和囊胚阶段，似乎难以维持有效的浓度。因此，显然需要有新的分子决定因子参与代际遗传机制。

除了核酸外，精子还向合子贡献代谢组分，例如脂质、碳水化合物和氨基酸26,27,28,29。这些代谢物，特别是具有调控活性的代谢物，可能影响合子基因表达和胚胎发育，因此可能作为表观遗传信号发挥作用30。此外，与核酸类似，精子中这些代谢物的浓度及其相对丰度可受到父本所经历环境条件的影响，因而可作为传递给子代的信息载体28,30,31,32,33,34。事实上，成熟精子的精子代谢组已被证明依赖于父本的健康状况，并受到饮食、体力活动、有毒物质和内分泌干扰物等环境因素的影响。

精子代谢物在胚胎发育中的作用因若干技术限制而难以阐明：（1）精子与卵母细胞之间的体积差异，导致精子对合子的代谢物质贡献极小；（2）精子在发生（精子发生）、附睾成熟、射精以及与卵母细胞融合等不同阶段中经历的多种代谢组学变化。

精子成熟过程中精子代谢组的波动
在哺乳动物中，精子通过依赖精原干细胞的生精过程在睾丸中产生，即定向分化的精原细胞发育为初级精母细胞，进入减数分裂并产生单倍体的圆形精细胞。这些细胞通过精子形成过程（spermiogenesis）转变为精子，该过程涉及精细胞大规模的形态与功能重塑，从圆形细胞转变为细长、浓缩且高度特化的细胞，这也是生精过程的最后阶段。然而，新形成的精子尚不具备运动能力，也无法完成受精35。在精子释放（spermiation）后，精子从睾丸网进入附睾，在此过程中与附睾上皮细胞相互作用，并与这些细胞分泌的蛋白质及外泌体囊泡（附睾体，epididymosomes，富含鞘磷脂和花生四烯酸）结合。精子在附睾中的迁移过程使其达到完全成熟，即使仍处于前获能状态，也获得了运动能力36。在附睾转运期间，精子膜的负电荷增加，并富含鞘磷脂。同时，由于胆固醇水平逐步降低，以及多不饱和脂肪酸（主要是花生四烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸）含量相应增加，精子膜流动性也随之增强。射精后，在雌性生殖道内，精液中的蛋白质和白蛋白通过促进膜超极化和钙离子内流，诱导精子获能，从而激活精子运动能力。获能后的精子质膜表现出更高的流动性、较低的胆固醇/磷脂比值，并且唾液酸、GM1神经节苷脂和甘油三酯的含量减少31,37。

在接触卵母细胞之前，精子会发生顶体反应，即顶体（一种在精子形成过程中由高尔基体衍生而来的膜性细胞器，覆盖于精子细胞核前部）与精子质膜融合，从而促进精子质膜的重组，并获得穿透卵母细胞周围糖蛋白基质——透明带（ZP）的能力。35,38最后一步是精子与卵细胞膜之间的半融合，该过程由精子蛋白IZUMO1、SPACA6和TMEM95促进。39导致精子脂质整合到卵细胞膜中，并将核酸和代谢物质转移至卵细胞内。

操作步骤的原理
该实验的目的是鉴定精子所携带并在受精过程中转移至卵母细胞的代谢物。图1）。为了区分受精卵中来自精子和卵母细胞的代谢物，需用氘（Deuterium）标记精子2H（氢的同位素）或 13C（一种碳同位素）使用 体内 重水代谢标记 2H2O40，或均匀标记的 U13C 葡萄糖41将同位素标记的雄性小鼠与未标记的雌性小鼠交配，最终收集受精卵、桑葚胚和囊胚。对早期胚胎进行处理，以提取（1）极性代谢物、（2）非极性代谢物和（3）甾醇。随后采用质谱技术分析代谢组。通过该方法可明确鉴定并区分同位素标记的（父源）代谢物与未标记的（母源）代谢物，从而确证其父系来源。

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方案

所有动物实验均经意大利那不勒斯费德里科二世大学机构动物护理与使用委员会批准。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. C57BL/6J 雄性小鼠的选择与分组

  1. 选择约12周龄的C57BL/6J雄性小鼠。
  2. 将雄性小鼠分为两组，并命名为标记组（接受稳定同位素标记）和未标记组（作为对照组，用于检测精子细胞和桑葚胚中同位素标记的效率）。
  3. 为清除附睾中未标记的精子细胞，让雄性小鼠与配对的雌性小鼠交配。

2. C57BL/6J 雄性小鼠的稳定同位素标记

  1. 如果使用 2H2O 表示 体内 标记，准备10% v/v 2H2O-富集水，通过将100 mL的 2H2O，加入900 mL自来水。若使用U13C-葡萄糖用于 体内 标记，准备5%-15% U13C-葡萄糖水作为饮用水使用，通过将50-150 g的U溶解于水中制备13C-葡萄糖溶于1升自来水中；
    警告：长期摄入 2H2O 对小鼠具有毒性。针对每种特定的小鼠品系，设定最大用量 2H2O 以添加至饮水中，以实现最佳标记效率并最小化副作用。长期摄入葡萄糖会导致小鼠高血糖和糖尿病。设定 U 的最大用量13为达到最佳标记效率和最小副作用，需添加至饮用水中的 C-葡萄糖。
  2. 将水瓶更换为含有同位素标记的饮用水，让小鼠饮用 2.5–5 周（覆盖至少一半的精子发生过程），每周更换液体两次。
  3. 在处理期结束时，让标记的雄性与超排卵的雌性交配。

3. C57BL/6J 雌性小鼠的超数排卵

  1. 选择约4周龄、体重在12.5–14 g之间、处于青春期前的雌性小鼠。
  2. 通过腹腔注射5 IU/50 µL/只PMSG（孕马血清促性腺激素）以诱导卵泡成熟。
  3. 47小时后，进行腹腔注射HCG（人绒毛膜促性腺激素，5 IU/50 µL/只），以促进卵泡成熟完成，并诱导排卵及黄体形成。
  4. 注射HCG后，按照图1的步骤1，让雌鼠与标记和未标记的小鼠交配。
  5. 交配后，进行阴道栓检查42。将检测阳性雌鼠分离并单独饲养。

4. 通过冲卵法收集植入前胚胎

  1. 按照机构批准的方案处死阴道栓阳性的雌性小鼠（交配后2.5天以收集桑葚胚）。
  2. 将动物仰卧置于实验台上，用70%乙醇润湿腹部，并进行广泛剖腹手术。
  3. 在一侧通过夹住宫颈并在宫颈尾端切断的方式取出子宫；在另一侧，则于子宫角末端（漏斗部）切断取出。
  4. 将子宫放入含有PBS的培养皿中冲洗，随后转移至另一干净的培养皿中，以避免残留物存在。
  5. 为冲洗子宫，用培养基填充一支2.5 mL注射器，并连接至33 G钝头汉密尔顿针头。
  6. 将针头插入如上所述准备好的输卵管漏斗部，冲洗整个子宫。
  7. 将收集到的桑葚胚置于一滴培养基中，以去除任何残留的黏膜和血液。
  8. 将收集的样本转移至新的收集管中，并根据其是否来自与标记或未标记雄鼠交配事件，分别归类为“标记桑葚胚”和“未标记桑葚胚”。在液氮中速冻保存样本。
  9. 处死一组未经交配但已超数排卵的雌性小鼠（遵循机构批准的方案），以收集未受精卵母细胞。将收集的样本转移至新的收集管中，并标记为“未标记卵母细胞”。在液氮中速冻保存样本。

5. 从附睾尾采集精子

  1. 处死已标记或未标记的雄性动物。
  2. 将动物仰卧固定于操作台，用70%乙醇润湿腹部，进行广泛的剖腹手术。
  3. 取出附睾，并立即浸入3 mL PBS（pH 7.6）中，轻轻剪开以释放输精管中的精子。
  4. 用纱布过滤精子样品。
  5. 在室温下以800 × g 离心10分钟，收集精子细胞。
  6. 将沉淀重悬于1 mL冷去离子水中。只有精子细胞能够耐受低渗溶液，而非精子细胞则会破裂。
  7. 在室温下以800 × g 再次离心10分钟，收集精子细胞。
  8. 标记试管，并根据精子来源的雄性动物是否标记，将其分为“已标记精子”和“未标记精子”两组。
  9. 将样品在液氮中快速冷冻，并于-80 °C保存。

6. 脂质和极性代谢物的提取

  1. 将步骤1-5得到的样品置于冰上，在4°C条件下平衡。
  2. 向样品中加入225 µL预冷的甲醇（MeOH），在-30 °C孵育1分钟，随后放入超声水浴中处理10分钟。
    1. 可选：在设定实验条件时，可分别加入0.1–2 ppm的C16-神经酰胺-13C3-15N和L-赖氨酸-ε-15N盐酸盐作为内标物，用于评估非极性代谢物和极性代谢物的提取效率。
  3. 在4 °C、550 rpm条件下，使用Thermomixer向样品中加入750 µL预冷的甲基叔丁基醚（MTBE），振荡反应1小时。
  4. 离心后向样品中加入188 µL H2O。分离上层相（脂质）与下层相（极性代谢物），并分别干燥。
    警告：甲醇（MeOH）若被吞咽，可导致失明，并对肝脏、肾脏和心脏造成损害。过量暴露对中枢神经系统具有累积性影响。甲基叔丁基醚（MTBE）可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。请在通风橱中操作。
  5. 使用真空浓缩仪干燥样品。干燥后的样品应保存于-80 °C，直至进行质谱分析。
    备注：干燥样品可在-80 °C保存长达6个月，以待质谱分析。若需鉴定在胚胎着床前阶段含量较低的代谢物，可能需要合并来自同一配对及同一次交配事件所获得的多个样品。

7. 甾醇的提取

注意：避免使用塑料管和枪头［它们会被非极性有机溶剂溶解］；应使用玻璃管和玻璃巴斯德吸管来移取液体。

  1. 将步骤1-5得到的样品置于冰上，在4 °C条件下平衡。用500 µL甲醇/H2O 70%（v/v）溶液重悬收集的样品，并将悬液转移至玻璃管中。
    1. 涡旋振荡30秒进行匀浆。将匀浆液在4 °C下静置16小时。
    2. 可选：在设定实验条件时，加入0.1–2 ppm植物甾醇Sitostanol-5,6,22,23-d4作为内标，用于测定甾醇提取效率。
      警告：甲醇（MeOH）若被吞食，可导致失明，并对肝脏、肾脏和心脏造成损害。长期暴露对中枢神经系统具有累积性影响。
  2. 在室温下以3.220 × g离心15分钟。将上清液转移至洁净的玻璃管中，并加入500 µL PBS。
  3. 加入7 mL预冷的乙醚，涡旋振荡1分钟。让样品静置1–2分钟，等待相分离。将试管浸入干冰/丙酮浴中冷冻。将未冻结的乙醚相转移至新标记的玻璃管中。
    警告：乙醚为极易燃液体和蒸气，在空气和光照下会分解生成爆炸性过氧化物。操作时切勿靠近火焰。乙醚若被吞食有害，且对皮肤具有危害性。
  4. 在37 °C下解冻水相，并重复步骤4.3。将步骤4.3至4.4中收集的乙醚相合并至同一玻璃管中。
  5. 使用真空浓缩仪干燥样品。将干燥后的样品储存于-80 °C，直至进行质谱分析。

8. 样品衍生化

注意：样品经TMS衍生化处理后，有利于特定代谢物（胆固醇、脂肪酸、氨基酸）的分析。

  1. 将样品在室温下平衡
    注意：平衡不充分可能导致大气中的水分在管壁和样品上冷凝。水会严重干扰TMS衍生化反应。
  2. 用50 µL吡啶溶解样品，并加入25 µL的N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化。在60 °C下孵育90分钟。离心样品后立即进行GC-MS分析。
    注意：吡啶易燃、有刺激性且有毒。BSTFA易燃、具有腐蚀性且有刺激性。操作时应在通风橱中进行，并使用防护手套。

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结果

为了监测精子向卵母细胞的代谢物传递，收集来自与标记组（LABELED）和未标记组（UNLABELED）雄鼠交配的C57 BL/6J雌鼠的桑葚胚，并通过基于质谱的代谢组学方法进行分析。代谢物的提取按照步骤6-7所述进行，并按步骤8所述用TMS衍生化。对标记桑葚胚、未标记桑葚胚、未标记卵母细胞、标记精子和未标记精子细胞进行了代谢组学和脂质组学分析。对所得谱图进行统计分析、比对和比较，以鉴定在标记桑葚胚和标记精子细胞中均存在，但在未标记桑葚胚和未标记卵母细胞中缺失的化学物质。候选化学物质应具有较高的分子质量（主要为m/z值增加2-4 Da），并与天然存在的对应物共洗脱。这些较重物质的存在可能表明在受精过程中存在特定父源代谢物向卵母细胞的传递。

在图2A所示的代表性结果中，氘标记的胆固醇从标记的雄性亲本转移至卵母细胞，这通过其在标记的桑葚胚中的存在得以证实。在图2B、C中，主成分分析（PCA）图和热图显示，与未标记的桑葚胚、未标记的卵母细胞以及标记的精子细胞相比，标记的桑...

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讨论

本方案通过使用2H2O或U13C葡萄糖对雄性小鼠进行稳定同位素标记，随后进行代谢组学分析，从而鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的代谢物。在桑葚胚中检测到的同位素标记代谢物均来源于父本。

尽管氢和氘是同位素，但它们在化学行为上并不完全相同。2H2O的熔点和沸点高于H2O。此外，常见于生物体系中的盐类（如KCl、NaCl和磷酸盐）在2H2O中的黏度和溶解度也存在显著差异。这种差异会改变溶解于2H2O中生物体系的三维结构和性质，使得重水无法支持生命活动。因此，尽管可以通过将2H2O作为饮用水来实现小鼠和大鼠的氘标记，但代谢标记的持续时间必须谨慎选择，以平衡标记效率、不良反应及整体毒性。

可追溯至20世纪早期的初步研究th 世纪以来的研究表明，当总身体...

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披露

作者声明无竞争利益。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
²H2O过滤，99.8 原子% 2HSigma Aldrich756822
丙酮Sigma Aldrich179124
安捷伦  SIL-8Agilent（美国加利福尼亚州圣克拉拉）
C16-神经酰胺-13C3-15NLGC 标准TRC-C342770-25MG
二氯甲烷Sigma Aldrich34856
乙醚 Sigma Aldrich673811
乙醇Sigma Aldrich1,11,727
人绒毛膜促性腺激素（HCG，Sigma AldrichCG5-1VL
L-赖氨酸-ε-15N 盐酸盐Sigma Aldrich608971
雄性和雌性  C57BL/6JOlaHsd 小鼠Inotiv C57BL/6JOlaHsd
甲基叔丁基醚（MTBE）Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-双(三甲基硅基(TMS)
N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）		Supelco15238
PBSApplichemA0965-9010
PMSG（孕马血清促性腺激素）’血清Lee Biosolutions493-10
吡啶Sigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
三氟乙酸钠Sigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF 布鲁克道尔特尼克斯
U13C 葡萄糖 Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Scientific
VanGuard CSHTM 预柱（5.0 × 2.1 mm；1.7 μm, 130 Å)Waters

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