本实验旨在通过使用2H2O或U13C葡萄糖进行稳定同位素标记，结合代谢组学分析，鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的代谢物。将氘标记的雄性个体与未标记的雌性个体交配，收集着床前胚胎，利用质谱分析技术区分父源（氘化）与母源（非氘化）代谢物。
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本文内容
摘要
摘要
几十年来，父源对胚胎遗传的贡献一直局限于等位基因序列。然而，近十年的研究结果表明，表观遗传因素——包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体结构以及调控性RNA——在父系遗传中发挥着关键作用，并影响胚胎发育及合子基因的表达。除核酸外，精子代谢组 （脂质、碳水化合物、游离氨基酸）也可能作为表观遗传信号。本实验方案旨在通过质谱技术鉴定从精子传递至卵母细胞的代谢物。该方法包括利用2H2O或U13C葡萄糖对精子细胞进行稳定同位素标记，从而通过代谢组学手段追踪受精过程中由父源传递至卵母细胞的代谢物。本方案的总体目标是揭示父源精子代谢组在子代代谢紊乱易感性中的作用，也可进一步调整用于研究环境因素（如饮食和污染物暴露）如何改变父源代谢信号，进而可能影响子代健康以及糖尿病、肥胖和心血管疾病等疾病的易感性。
引言
父系表观基因组影响子代代谢紊乱的易感性
与母亲在胚胎发育过程中发挥的大量孕前和孕后作用不同，几十年来人们一直认为精子细胞的贡献仅限于遗传物质。根据遗传理论，父系对个体表型变异（包括对疾病的易感性）的贡献，完全归因于父源遗传等位基因的DNA序列及其与母源遗传等位基因之间的相互作用1。如今已明确，等位基因并非父亲在受精过程中传递给子代的唯一遗传信息，实际上多种多样的表观遗传信号也参与了父系遗传2,3,4。目前已鉴定出的表观遗传信号包括：（1）共价添加至亲本基因组胞嘧啶上的甲基基团5,6,7；（2）与精子染色体结合并传递至卵母细胞的组蛋白翻译后修饰（如乙酰化、甲基化）8；（3）父源染色体的三维结构，导致染色体内相互作用（也称为拓扑关联结构域，TAD），并在受精卵中持续存在9,10；以及（4）在受精过程中由精子释放....
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方案
所有动物实验均经意大利那不勒斯费德里科二世大学机构动物护理与使用委员会批准。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. C57BL/6J 雄性小鼠的选择与分组
- 选择约12周龄的C57BL/6J雄性小鼠。
- 将雄性小鼠分为两组，并命名为标记组（接受稳定同位素标记）和未标记组（作为对照组，用于检测精子细胞和桑葚胚中同位素标记的效率）。
- 为清除附睾中未标记的精子细胞，让雄性小鼠与配对的雌性小鼠交配。
2. C57BL/6J 雄性小鼠的稳定同位素标记
- 如果使用 2H2O 表示 体内 标记，准备10% v/v 2H2O-富集水，通过将100 mL的 2H2O，加入900 mL自来水。若使用U13C-葡萄糖用于 体内 标记，准备5%-15% U13C-葡萄糖水作为饮用水使用，通过将50-150 g的U溶解于水中制备13C-葡萄糖溶于1升自来水中；
警告：长期摄入 2H....
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结果
为了监测精子向卵母细胞的代谢物传递，收集来自与标记组（LABELED）和未标记组（UNLABELED）雄鼠交配的C57 BL/6J雌鼠的桑葚胚，并通过基于质谱的代谢组学方法进行分析。代谢物的提取按照步骤6-7所述进行，并按步骤8所述用TMS衍生化。对标记桑葚胚、未标记桑葚胚、未标记卵母细胞、标记精子和未标记精子细胞进行了代谢组学和脂质组学分析。对所得谱图进行统计分析、比对和比较，以鉴定在标记桑葚胚和标记精子细胞中均存在，但在未标记桑葚胚和未标记卵母细胞中缺失的化学物质。候选化学物质应具有较高的分子质量（主要为m/z值增加2-4 Da），并与天然存在的对应物共洗脱。这些较重物质的存在可能表明在受精过程中存在特定父源代谢物向卵母细胞的传递。
在图2A所示的代表性结果中，氘标记的胆固醇从标记的雄性亲本转移至卵母细胞，这通过其在标记的桑葚胚中的存在得以证实。在图2B、C中，主成分分析（PCA）图和热图显示，与未标记的桑葚胚、未标记的卵母细胞以及标记的精子细胞相比，标记的桑.......
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讨论
本方案通过使用2H2O或U13C葡萄糖对雄性小鼠进行稳定同位素标记，随后进行代谢组学分析，从而鉴定受精过程中由精子传递至卵母细胞的代谢物。在桑葚胚中检测到的同位素标记代谢物均来源于父本。
尽管氢和氘是同位素，但它们在化学行为上并不完全相同。2H2O的熔点和沸点高于H2O。此外，常见于生物体系中的盐类（如KCl、NaCl和磷酸盐）在2H2O中的黏度和溶解度也存在显著差异。这种差异会改变溶解于2H2O中生物体系的三维结构和性质，使得重水无法支持生命活动。因此，尽管可以通过将2H2O作为饮用水来实现小鼠和大鼠的氘标记，但代谢标记的持续时间必须谨慎选择，以平衡标记效率、不良反应及整体毒性。
可追溯至20世纪早期的初步研究th 世纪以来的研究表明，当总身体.......
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披露
作者声明无竞争利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ²H2O过滤，99.8 原子% 2H | Sigma Aldrich | 756822 | |
| 丙酮 | Sigma Aldrich | 179124 | |
| 安捷伦 SIL-8 | Agilent（美国加利福尼亚州圣克拉拉） | ||
| C16-神经酰胺-13C3-15N | LGC 标准 | TRC-C342770-25MG | |
| 二氯甲烷 | Sigma Aldrich | 34856 | |
| 乙醚 | Sigma Aldrich | 673811 | |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | 1,11,727 | |
| 人绒毛膜促性腺激素（HCG， | Sigma Aldrich | CG5-1VL | |
| L-赖氨酸-ε-15N 盐酸盐 | Sigma Aldrich | 608971 | |
| 雄性和雌性 C57BL/6JOlaHsd 小鼠 | Inotiv | C57BL/6JOlaHsd | |
| 甲基叔丁基醚（MTBE） | Sigma Aldrich | 306975 | |
| MetOH | Sigma Aldrich | 1,06,035 | |
| N,O-双(三甲基硅基(TMS) N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA） | Supelco | 15238 | |
| PBS | Applichem | A0965-9010 | |
| PMSG（孕马血清促性腺激素）’血清 | Lee Biosolutions | 493-10 | |
| 吡啶 | Sigma Aldrich | 360570 | |
| Shimadzu GCMS 2010plus | Shimadzu | ||
| Sitostanol-5,6,22,23-d4 | Sigma Aldrich | 680028 | |
| 三氟乙酸钠 | Sigma Aldrich | 1615138 | |
| SolariX XR 7T | Bruker Daltonics | ||
| TimsTOF Pro Q-TOF | 布鲁克道尔特尼克斯 | ||
| U13C 葡萄糖 | Sigma Aldrich | 389374 | |
| Ultimate RS3000 UHPLC | Thermo Fisher Scientific | ||
| VanGuard CSHTM 预柱（5.0 × 2.1 mm；1.7 μm, 130 Å) | Waters |
参考文献
- Wang, Y., Liu, H., Sun, Z. Lamarck rises from his grave: Parental environment-induced epigenetic inheritance in model organisms and humans. Biol Rev. 92 (4), 2084-2111 (2017).
- Champroux, A., Cocquet, J., Henry-Berger, J., Drevet, J. R., Kocer, A.
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重印与许可
