需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

快速检测 幽门螺杆菌 利用量子点标记技术进行毒力分析与分型

1.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67792

⸱

2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在众多诊断方法中 幽门螺杆菌，量子点免疫荧光可快速分型并检测 幽门螺杆菌，为临床治疗决策提供依据。本文详细介绍了量子点技术在分型与检测中的应用价值 幽门螺杆菌.

摘要

我们提出一种基于量子点标记技术的快速检测毒力的方法 幽门螺杆菌 并进行分型，旨在克服传统诊断方法的局限性，为临床个体化治疗提供依据。采用双抗原夹心法设计了一种试剂盒，其制备过程包括建立缓冲反应体系、抗原抗体反应中的活化与偶联等系列精细步骤。此外，还包括样本采集、处理及检测操作等特定流程，以确定感染状态及毒力类型 幽门螺杆菌通过建立不同类型结果（阴性、II型和I型）的数据模型，验证了量子点技术在分型检测中的有效性。对于阴性样本，在相关检测区域中未见明显信号或仅有微弱信号。II型样本表现出不同抗体对应的特异性阳性和阴性信号模式；而I型样本则显示出与关键抗体相对应的一组明确阳性信号。此外，该技术在慢性胃炎和胃癌相关研究中的应用，体现了其作为筛查指标的价值。基于量子点的检测方法相较于传统诊断方法具有更高的灵敏度和特异性优势。然而，该技术也面临样本保存时间可能带来的影响以及相对较高的成本等挑战。尽管如此，随着持续的技术创新，预计其将在生物医学领域发挥更加重要的作用。 幽门螺杆菌 检测及未来相关疾病的诊断。

引言

幽门螺杆菌（H. pylori）是一种革兰氏阴性细菌，存在于胃窦部幽门黏膜与黏膜下层之间1,2。1994年，世界卫生组织/国际癌症研究机构（WHO/IARC）将其列为I类致癌物。根据是否表达空泡毒素A（VacA）和细胞毒素相关基因A（CagA）毒素，可将其分为两种类型：I型 H. pylori 感染为毒力较强的菌株，对患者的危害更大，与胃及十二指肠溃疡以及胃癌的发生密切相关；II型 H. pylori 感染则为低毒力菌株，致病性较弱，通常表现为轻度消化不良3,4。研究人员发现，I型的感染率高于II型，I型和II型的感染率分别为72.4%和27.6%5。快速检测H. pylori的类型，尤其是区分I型与II型，对于临床治疗和疾病预防具有重要意义。

由H. pylori感染引起的慢性胃炎可导致严重的消化系统疾病，例如在感染患者中出现的萎缩性胃炎、消化性溃疡病、胃腺癌以及黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤6,7,8。2014年全球疾病负担研究预测，自2010年起，每年每10万人中约有3.5人死于消化性溃疡病9。研究报告发现，2018年全球近80万例新发胃癌病例与H. pylori感染相关10。近年来，研究发现H. pylori感染还与神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病等密切相关。H. pylori感染已成为全球公共卫生问题。因此，准确检测H. pylori感染对于相关疾病的发现具有重要意义，而治疗的关键在于实现对H. pylori的精准检测，这使其成为当前研究的热点。

由于中国H. pylori的感染率较高，及时准确地检测H. pylori感染有助于疾病的早期发现与治疗，对胃癌的防治具有积极意义。目前检测H. pylori感染的方法多样，包括快速尿素酶试验（RUT）、胃黏膜组织切片染色显微镜检查、内镜检查等侵入性方法，以及C13或C14尿素呼气试验（UBT）、H. pylori粪便抗原检测（SAT）等非侵入性方法11,12,13。这些检测方法均存在一定局限性。例如，组织学检查可能因活检部位所取活检样本的质量和大小问题而出现假阴性结果；呼气试验可能受到患者近期使用抗生素或质子泵抑制剂（PPI）以及多种影响因素的干扰11,14,15。鉴于传统方法存在耗时较长、灵敏度和特异性不足等局限，基于量子点免疫荧光（QD-IF）的快速诊断技术在生物检测领域展现出巨大的应用潜力16,17。QD-IF分析通过引入量子点荧光探针，利用其与分子靶标的特异性结合，实现对目标分子的特异性检测18,19。

量子点是半径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米颗粒，通常尺寸为1至10 nm。量子点可用作荧光探针。通过激发量子点产生荧光信号，并通过仪器测量获得定量数据。其优点包括激发波长范围宽、发射波长窄、荧光尺寸可调、灵敏度高、光学稳定性好、荧光寿命长、斯托克斯位移大以及量子荧光效率高。量子点克服了其他标记物的缺点，如发光时间短、对环境条件要求严格、重复性差、稳定性差（如荧光染料）、酶易失活以及灵敏度低等问题。量子点荧光免疫分析结合了量子点荧光标记与生物标志物免疫分析的优点，具有操作简便、快速、特异性强和灵敏度高的优势20,21。

用于检测幽门螺杆菌（H. pylori）的传统诊断工具，包括细菌培养、尿素呼气试验和血清学检测，均存在各自的局限性。细菌培养耗时较长，且需要严格的实验室条件，由于幽门螺杆菌生长条件苛刻，常导致敏感性相对较低。尿素呼气试验在某些情况下可能出现假阴性结果，例如近期使用过抗生素或质子泵抑制剂22,23,24。血清学检测在某些情况下仅能提示既往感染，而无法反映当前的感染状态，且无法区分该病原体的不同毒力类型。

相比之下，量子点免疫荧光（QD-IF）技术已成为一种颇具前景的替代方法。QD-IF 将量子点优异的光学特性（如高荧光强度、窄发射光谱和良好的光稳定性）与免疫反应的特异性相结合，从而实现对生物样本中H. pylori抗原或抗体的快速、灵敏检测。此外，该技术具有传统方法难以实现的独特优势，即可同时鉴定感染菌株的毒力类型。通过弥补诊断流程中的这一空白，QD-IF 技术有望彻底改变我们诊断和管理H. pylori感染的方式，推动实现更个性化、更有效的医学干预。

总体而言，临床上迫切需要一种能够同时检测幽门螺杆菌（H. pylori）感染及其毒力类型（I型和II型）的非侵入性、有效的诊断方法。本文旨在利用量子点免疫荧光法（QD-IF）评估组织样本中H. pylori感染的存在，并建立一种快速、准确检测H. pylori感染类型的方法。快速检测H. pylori感染及其毒力类型对于实现精准医疗、提高治疗效果、降低相关疾病风险以及预防胃癌具有重要意义。该方法为临床医务人员选择准确的H. pylori感染检测手段提供了科学理论依据。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究（KY2025-191-01）严格遵循南方医科大学广东省人民医院（广东省医学科学院）人体研究伦理委员会的指导原则进行。本文符合免除知情同意申请的要求。

注：本研究旨在利用量子点技术设计并开发一种试剂盒，用于检测受试者血液样本中的物种来源 幽门螺杆菌 尿素酶（Urease）抗体、空泡毒素A（VacA）抗体和细胞毒素相关基因A（CagA）毒素抗体，以确定是否 H. pylori 感染情况以及感染的菌株是否为I型或II型。该设计试剂盒采用双抗原夹心法进行检测 幽门螺杆菌 尿素酶抗体、CagA抗体和VacA抗体。当含有目标物质的待测样本被加入到样本垫时，通过虹吸作用流经量子垫和膜，形成固相抗原-抗体复合物。点样后，由分析仪分别读取检测线和质控线的信号值。根据三种抗体各自的T/C信号值，利用质控线信号值来判断尿素酶抗体、CagA抗体和VacA抗体的阴性或阳性状态。设计示意图如下所示 图1.

侧向流动检测示意图，量子点垫，抗体标记，PVC板，NC膜。
图1：H. pylori 分型检测试剂卡示意图。该图展示了试剂卡的结构与组成。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 试剂盒准备

  1. 建立量子点-2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）缓冲反应体系
    1. 将原始量子点溶液平衡至室温（RT）。然后吸取1000 µL，并加入等体积的2x MES溶液（MES的终浓度为10 mmol/L）。
    2. 混合、振荡并超声处理30秒至3分钟。
  2. 活化
    1. 按10:1的比例，向量子点-MES缓冲体系中加入20 mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。混合、振荡并超声处理3分钟。
    2. 将制备好的溶液置于37 °C水浴中15分钟，并在13,000 × g 条件下离心20分钟。
    3. 弃去离心后的上清液，用1x MES溶液重新溶解沉淀。用移液枪反复吹打溶液，振荡使其充分混匀，并超声处理3分钟。
    4. 将上述溶液再次置于37 °C水浴中15分钟，并在13,000 × g 条件下离心20分钟。
  3. 偶联
    1. 向1000 µL活化溶液中加入0.03 mg的尿素酶抗原、CagA抗原、VacA抗原以及羊抗小鼠IgG，用移液枪反复吹打枪头，振荡混匀，并超声处理3分钟。
    2. 将上述溶液置于37 °C水浴中反应3小时。
  4. 封闭与保存
    1. 加入100 µL封闭液（补充表1），孵育1小时。
    2. 将封闭后的溶液在13,000 × g 条件下离心15分钟。
    3. 弃去离心后的上清液，加入750 µL复溶液（补充表1），反复吹打、振荡并超声处理5分钟，随后于4 °C保存。

2. 包被板的制备

  1. 量子垫的制备
    1. 用量子点稀释缓冲液将量子点标记的H. pylori抗原复合物按1:5比例稀释，根据批量生产需要制备相应用量。
    2. 取量子垫，使用喷膜仪将一定量的量子点标记的H. pylori抗原复合物均匀喷涂于垫上，37 °C干燥30分钟。
  2. 膜的制备
    1. 用打印缓冲液稀释质控线和检测线包被材料，并根据批量生产量制备所需用量。
    2. 将硝酸纤维素膜贴附于聚氯乙烯（PVC）板上，使用划膜喷金仪将质控线和检测线材料均匀涂布于膜上，57 °C干燥24小时。

3. 组装

  1. 依次将量子垫和样品垫粘贴到覆膜的PVC板上。

4. 切割成条状

  1. 使用条带切割器将组装好的大板切割成测试条。

5. 内包装

  1. 根据试剂盒组成要求完成包装。
    注意：试剂盒的组分如下：(i) 检测卡：由检测条外壳和检测条组成。检测条包含PVC板、样品垫、量子点垫（用量子点标记的抗原复合物；该复合物含有尿素酶抗原、CagA抗原、VacA抗原以及鼠IgG）、硝酸纤维素膜（检测区固定有VacA抗原、CagA抗原和尿素酶抗原（重组抗原真核表达），质控区包被有羊抗鼠IgG（羊多克隆抗体））和吸水纸。不同包装规格的检测卡数量不同。每人份试剂需使用一张检测卡。(ii) SD卡：1片/盒。不同批次试剂盒的检测卡与安全数字（SD）卡组件不得混用。

6. 样品处理

注意：样本采集请参照《全国临床检验操作规程》。

  1. 使用分离胶管采集血液，注意避免溶血。
  2. 分离后的血清样本应在室温（RT）下4小时内完成检测。若无法及时检测，可将样本在2–8 °C条件下保存3天；如需长期保存（1年内），应密封后于–20 °C以下保存。
  3. 使用前将样本恢复至室温，并充分混匀。
    注意：冷冻保存的样本使用前必须完全解冻，且冻融循环次数不应超过五次。反复冻融可能导致待测物降解，应尽量避免。严重乳糜和溶血样本也会影响检测结果，应避免使用。

7. 检测步骤

  1. 取出试剂盒和质控品，置于室温下平衡。
  2. 样本处理：将全血样本在 1467 g 条件下离心 10 分钟。
  3. 确认 SD 卡的批号与试剂盒批号一致。将 SD 卡插入仪器中以进行自动校准。
  4. 开启仪器及操作计算机，启动指定软件，选择 检测 模块。选择 初始化设置 以初始化仪器，并等待初始化成功完成。
  5. 打开仪器试剂区，取出测试卡插槽。打开试剂盒，选取所需数量的测试卡。
  6. 打开测试卡的铝箔袋，按照指示方向将测试卡放入插槽中。将插槽重新插入仪器的试剂区。
  7. 质控（QC）检测
    1. 在 检测 模块中，选择 手动录入。点击 信息录入，输入特定的质控品信息，点击 生成。将质控品放入指定的样本架中，确保顺序和方向正确。
    2. 点击 开始检测 以启动质控检测。仪器的样本针将吸取 80 µL 样本，并垂直加入样本孔中。加样完成后，仪器将自动开始计时。15 分钟后，仪器将进行检测，读取测量值并输出结果。
  8. 样本检测：在 检测 模块中，选择 双向 LIS。将待测样本按正确顺序和方向放入指定的样本架中，点击 开始检测。仪器将同样吸取每份样本 80 µL，并以与质控流程相同的方式进行处理。
  9. 检测完成后，从仪器中取出已使用的测试卡，并作为医疗废物妥善处理。

8. 质量控制

  1. H. pylori 阴性：检查并确保幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）阴性参考品（即尿素酶抗体、CagA抗体和VacA抗体）的结果均为阴性。
  2. H. pylori II型感染：检查并确保幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）II型参考品，即尿素酶抗体为阳性，而CagA抗体和VacA抗体结果均为阴性。
  3. H. pyloriI型感染：检查并确保幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）I型参考品，即尿素酶抗体为阳性，且CagA抗体和/或VacA抗体为阳性。

9. 结果分析

  1. II型感染，由弱毒或非产毒菌株引起：当尿素酶抗体检测结果为阳性，而CagA抗体和VacA抗体检测结果均为阴性时，判定为感染了弱毒或非产毒的H. pylori菌株。
  2. I型感染，由高致病性产毒菌株引起：当尿素酶抗体检测结果为阳性，且CagA抗体或VacA抗体检测结果为阳性（任一或两者均为阳性），判定为感染了高致病性的H. pylori产毒菌株。
  3. 阴性：当尿素酶抗体、CagA抗体和VacA抗体检测结果均为阴性时，判定为未感染H. pylori菌株。
  4. 无效：当仪器判定结果为无效时，应检查操作是否错误或试剂盒是否存在故障，并重新进行检测。

10. 荧光分析仪的校准

  1. 首先，打开分析仪并预热约15分钟，以使其性能稳定。然后，将制造商提供的校准标准品插入样品架中。
  2. 接下来，在分析仪的界面上进入校准功能并启动校准程序。分析仪将自动检测标准品的荧光信号，并相应调整其内部参数，以匹配预设的参考值。
  3. 随后，取出校准标准品，插入空白样品以确认读数处于可接受范围内。
  4. 按照推荐的时间间隔定期重复上述步骤，有助于保持分析仪的准确性，确保测量结果可靠。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图2 显示了量子点荧光免疫分析仪的工作原理。该仪器主要由激发光源、接收光源、光电转换电路模块、信号处理电路、AD值转换电路和信号处理计算模块组成；激发光源产生荧光标记物，吸收波长相近的单色光，该单色光通过激发光路照射到试剂条的固定扫描点（即试剂条的检测窗口处）。扫描点附近的荧光材料（位于试剂条的检测窗口）被激发后发射荧光。经过收集光路滤除杂散光后，特定波长的荧光被收集并聚焦到光电转换电路模块，将光信号转换为电信号，再通过信号处理电路和AD值转换电路将电信号转换为数值，并通过放大系统进行放大。经过信号处理计算模块后，通过特定算法计算出待测物质的浓度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

目前，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的诊断方法主要分为两类：侵入性和非侵入性26。快速尿素酶试验（RUT）、组织学检查、分子生物学检测和细菌培养等方法在侵入性、敏感性、特异性、时间限制、成本、设备要求、样本处理及实时监测方面均存在局限性。目前更常用的是基于尿素呼气试验、粪便抗原检测和血清抗体检测等方法的快速体外诊断。然而，尿素呼气试验受多种因素影响。同时，其操作步骤基本由受试者自行完成，操作规范的质量存在差异22,23,24。粪便抗原检测需要收集受试者的粪便样本，在实际操作中极为不便，且敏感性较低，容易出现漏检。尽管血清学抗体检测在上述方面有所改进，但部分患者在根除治疗后复查呈阳性结果，并不能证明其存在活动性感染27。血清学检测方法种类繁多，检测的敏感性和特异性差异较大。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由广东省基础与应用基础研究基金项目资助（资助号：2021A1515220022，2022A1515220023）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）Sigma25952-53-85 g/瓶
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）Sigma145224-94-8100 g/瓶
离心机Sigma3K15
荧光免疫分析仪广州莱赛生物技术有限公司粤械注准2017221743
幽门螺杆菌分型检测试剂盒 重庆宜搜生物科技有限公司国械注准20203400330量子点免疫荧光法
N-羟基琥珀酰亚胺钠盐（NHS）Sigma106627-54-71 g/瓶

参考文献

  1. Tacconelli, E., et al. research and development of new antibiotics: WHO priority list of antibioticresistant bacteria and tuberculosis. Lancet Infect Dis. 18 (3), 318-327 (2018).
  2. Kamboj, A. K., et al. Helicobacter pylori: past, present, and future of treatment. Mayo Clin Proc. 92 (4), 599-604 (2017).
  3. Yamaoka, Y. Disease mechanisms: Helicobacter pylori virulence factors. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 7 (11), 629-641 (2010).
  4. Sharndama, H. C., Mba, I. E. Helicobacter pylori: an updated overview on its virulence and pathogenesis. Braz J Microbiol. 53 (1), 33-50 (2022).
  5. Lin, Y., et al. Infection status of type I and type II Helicobacter pylori in areas with high incidence of gastric cancer and its impact on gastrin and pepsinogen levels. World J Gastroenterol. 26 (25), 3673-3685 (2020).
  6. Li, Y. H., et al. Global prevalence of Helicobacter pylori infection from 1980 to 2022: a systematic review and metaanalysis. Lancet Gastroenterol Hepatol. 8 (6), 553-564 (2023).
  7. Karbalaei, M., Keikha, M. Rescue effect of lactobacillicontaining bismuth regimen on Helicobacter pylori treatment failure. New Microbiol New Infect. 42, 100904(2021).
  8. Malfertheiner, P., et al. Helicobacter pylori infection. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 19(2023).
  9. Stewart, B., et al. Global burden of disease requiring emergency surgery. Br J Surg. 101 (1), e9-e22 (2014).
  10. de Martel, C., et al. The global burden of cancer attributable to infection in 2018: a global incidence analysis. Lancet Glob Health. 8 (2), e180-e190 (2020).
  11. Godbole, G., et al. Review: diagnosis of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 25 (S1), e12735(2020).
  12. Lee, Y. C., et al. Diagnosis and treatment of Helicobacter pylori infection. Annu Rev Med. 73 (1), 183-195 (2022).
  13. Fischbach, W., Malfertheiner, P. Helicobacter pylori infection. Ger Int Med J. 115, 429-436 (2018).
  14. Zhang, C., et al. Survey on the quantitative detection of serum Helicobacter pylori antibodies in clinical laboratories in my country. J Clin Lab Anal. 36 (1), e24069(2021).
  15. Wan, W. S., et al. Improving the detection rate of Helicobacter pylori in chronic gastritis biopsies: a comparative analysis of H&E, methylene blue, WarthinStarry, immunohistochemistry, and quantum dot immunohistochemistry. Front Oncol. 13, 1229871(2023).
  16. Bodo, J., et al. Quantitative in situ detection of phosphoproteins in fixed tissues using quantum dot technology. J Histochem Cytochem. 57 (7), 701-708 (2009).
  17. Chen, C., et al. Quantum dotbased immunofluorescence technology for quantitative determination of HER2 expression in breast cancer. Biomaterials. 30 (15), 2912-2918 (2009).
  18. Kuang, H., et al. Recent developments in quantum dot analytical applications. TrAC Trends Anal Chem. 30 (10), 1620-1636 (2011).
  19. Park, Y., et al. Medically transformable quantum dots for biosensing and imaging. J Photochem Photobiol C Photochem Rev. 30, 51-70 (2017).
  20. SanmartinMatalbobs, J., et al. Semiconductor quantum dots as target analytes: properties, surface chemistry and detection. Chem Detect Nanomaterials. 12 (14), 2501(2022).
  21. Katan, C., Mercier, N., Even, J. Quantum and dielectric confinement effects in lowerdimensional hybrid perovskite semiconductors. Chem Rev. 119 (5), 3140-3192 (2019).
  22. Chinese Medical Association Branch of Health Management. Physical examination population 13C expert consensus on technical specifications for urea breath tests. Health Exam Manag. 2 (2), 94-96 (2021).
  23. National Clinical Medical Research Center for Digestive Diseases. Expert consensus on clinical application of Helicobacter pyloriurea breath test (2020). Chin J Health Manag. 14 (2020), 510-513 (2020).
  24. Zhang, Y., et al. The influence factors of Helicobacter pylori infection were detected by urea breath test. Chin J Clin Gastroenterol. 32 (3), 197-202 (2020).
  25. Lin, B., et al. Diagnostic value of gastric function triad and Helicobacter pylori typing in chronic gastritis and gastric cancer. Labeled Immunoassays Clin Med. 30 (1), 74-76 (2023).
  26. Cardos, A. I., et al. Evolution of diagnostic methods for Helicobacter pylori infection: from traditional tests to hightech, advanced sensitivity and identification tools. Diagnostics. 12 (508), 1-23 (2022).
  27. Ding, S. Z., et al. Chinese consensus report on familybased Helicobacter pylori infection control and management (2021 edition). Gut. 71 (2), 238-253 (2021).
  28. Wan, W., et al. Comparison of quantum dot immunofluorescence histochemistry and conventional immunohistochemistry in detecting Helicobacter pylori infection in paraffinembedded tissue of gastric biopsy. J Mol Histol. 52, 461-466 (2021).
  29. Zhou, Y., et al. Development of a fast and sensitive doubleantigen sandwich lateral flow immunoassay based on quantum dot nanobeads and its clinical performance in detecting SARSCoV2 total antibodies. Sens Actuators B Chem. 343, 130139(2021).
  30. Liu, H., et al. Consistency analysis of highsensitivity cardiac troponin I in peripheral blood and venous blood using quantum dot immunofluorescence method and its clinical application in acute myocardial infarction. J Chest Dis. 14 (4), 1267-1274 (2022).
  31. Xirong, W., et al. Development of quantum dotbased lateral flow immunoassay test strips for rapid and sensitive detection of SARSCoV2 neutralizing antibodies. Sci Rep. 13, 22253(2023).
  32. Purwidyantri, A., et al. Programmable graphenebased microfluidic sensor for DNA detection. Sens Actuators B Chem. 367, 132044(2022).
  33. Lee, K. S., Wagner, M., Stocker, R. Ramanbased sorting of microbial cells to link functions to their genes. Microb Cell. 7 (3), 62-65 (2020).
  34. Hu, C., et al. Design and fabrication of carbon dots for energy conversion and storage. Chem Soc Rev. 48 (8), 2315-2337 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

幽门螺杆菌检测毒力分型抗原抗体结合免疫层析试剂双抗原夹心法慢性胃炎筛查胃癌生物标志物受试者工作特征曲线诊断敏感性
快速检测 幽门螺杆菌 利用量子点标记技术进行毒力分析与分型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。