从全血中分离与鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

摘要

本文提供了一种利用磁性分离法（阴性筛选）结合不连续密度梯度介质从全血中分离低密度和正常密度中性粒细胞的可靠方法。该方法可实现未受干扰的高纯度细胞分离（≥93%），有助于对中性粒细胞亚群进行准确的下游分析，对于理解其在健康与疾病中的作用至关重要。

摘要

新兴研究表明，人体循环中的中性粒细胞群体包含多种不同的亚型，不应再像以往那样将其视为单一群体进行研究。特别是低密度和正常密度中性粒细胞（LDNs、NDNs）已被证明具有功能和代谢上的显著差异，这一因素在发表中性粒细胞相关研究时必须予以考虑。本文介绍了一种改进的方法，用于从全血中无接触地分离和纯化LDNs与NDNs。

将密度梯度介质（1.135 g/mL）以9:10的比例与10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）混合。通过将100%密度梯度介质与1倍浓度的磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，配制出55%、70%和81%的特定密度梯度。使用基于阴性筛选的磁珠分离试剂盒，从已签署知情同意书的供体获取的12 mL外周全血中分离中性粒细胞，并将其重悬于55%密度梯度层中。在15 mL离心管中，依次加入3 mL的81%和70%密度梯度液，随后小心加入含有全部中性粒细胞的55%梯度层。密度梯度样品在720 × g 条件下离心30分钟。在55%/70%界面处获得低密度中性粒细胞（LDNs），在70%/81%界面处获得正常密度中性粒细胞（NDNs）。将细胞小心吸取至不同的离心管中，并用PBS洗涤。采用流式细胞术测定分离组分的纯度。LDNs和NDNs在流式细胞术中均定义为CD14lo CD15+ SSChi表型。两种细胞类型的分离纯度均达到≥93%的活细胞比例。

该方法提供了一种可靠且高效的从外周血中分离LDN和NDN的策略，可确保分离细胞的高纯度和高活性。提高中性粒细胞分离的精确性，有助于对这些不同的中性粒细胞亚群进行更准确的下游分析。这对于深入理解中性粒细胞异质性及其在多种生理和病理过程中的意义至关重要。

引言

中性粒细胞是具有颗粒的免疫细胞，也是外周血中最丰富的白细胞，平均占白细胞总数的50%–70%。它们在骨髓中由粒细胞-单核细胞前体（GMPs）发育而来，而GMPs又在粒细胞集落刺激因子（G-CSF）存在的情况下由造血祖细胞（HPCs）发育形成。在稳态条件下，中性粒细胞的寿命约为24小时，但研究表明，在特定生理条件及其相关微环境（如慢性免疫激活¹、炎症¹，甚至稳态下的组织驻留²）中，其寿命可被延长。长期以来，中性粒细胞被认为是抵御病原体的第一道防线，主要通过三种主要效应功能发挥其抗微生物作用：脱颗粒、吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的激活与释放（NETosis）。

大多数关于中性粒细胞功能与生物学的研究均针对整个中性粒细胞群体的结局进行分析。然而，随着在癌症环境中对N1（抗肿瘤）/N2（促肿瘤）亚型的研究，以及基于成熟度、疾病状态、生理状态甚至细胞密度（低密度和正常密度中性粒细胞）对中性粒细胞的分类，人们日益认识到人类中性粒细胞群体在表型上具有高度异质性。无论这些中性粒细胞亚型的存在是源于完全不同的细胞类型，还是源于细胞可塑性的复杂特性，目前已有越来越多的文献报道了非典型中性粒细胞，这为将低密度中性粒细胞与正常密度中性粒细胞分开研究提供了有力契机³。

方案

在取得健康参与者的知情同意后采集血液样本。该研究已获得圣詹姆斯医院和塔拉赫特大学医院研究伦理委员会的批准。

1. 密度梯度介质、等渗工作溶液组分及细胞分离缓冲液的制备

1. 从密度梯度介质制备等渗工作液
   1. 制备等渗100%工作液（~1.123 g/mL）
      1. 为制备等渗100%工作液，将27 mL密度梯度介质与3 mL 10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）混合。所得溶液为等渗溶液，适用于进一步稀释。
   2. 制备等渗81%工作液（~1.0996 g/mL）
      1. 将8.1 mL等渗100%工作液（按步骤1.1.1制备）与1.9 mL 1倍浓度磷酸盐缓冲液（1x PBS）混合，制得等渗81%工作液。充分混匀以确保溶液均一。
   3. 制备等渗70%工作液（~1.0861 g/mL）
      1. 为制备等渗70%工作液，将7 mL等渗100%工作液与3 mL 1x PBS混合。确保溶液充分混匀。
   4. 制备等渗55%工作液（1.0676 g/mL）
      1. 将5.5 mL等渗100%工作液与4.5 mL 1x PBS混合，配制等渗55%工作液。充分混匀。
      <....

结果

在图1B中可观察到总中性粒细胞在密度梯度介质上的成功分层。应获得两条明显不同的条带。如果梯度发生混合，或每管所加总中性粒细胞数量过高（大于约5-6 × 10⁶），条带将呈现弥散状（图1C），两种中性粒细胞亚群发生混合的风险将显著增加。为避免此情况，建议每根密度梯度管中分层的总中性粒细胞数量不超过5-6 × 10⁶。尽管有报道称健康个体中低密度中性粒细胞（LDNs）数量极低，因而难以满足后续研究需求，但本方法在健康受试者中可获得较高的LDNs（平均3.28 × 10⁶ 个细胞/mL）和正常密度中性粒细胞（NDNs）（平均10.64 × 10⁶ 个细胞/mL）得率及纯度（图2）。

LDN 的平均分离纯度为 93.80%（± 5.80），NDN 的平均分离纯度为 96.30%（± 3.30；图 2A

讨论

本文介绍了一种优化方法，可将中性粒细胞总体群分离为低密度和正常密度中性粒细胞，并采用既往方法改进的流式细胞术对每种细胞类型进行表型表征⁵。

本方案基于从全血中分离LDN和NDN。关键步骤是通过阴性选择方法分离中性粒细胞。阳性选择方法涉及使用可结合表面标志物的抗体，可能激活中性粒细胞并触发脱颗粒⁵。这种激活会改变中性粒细胞的功能和代谢状态，从而干扰下游实验，导致结果不准确并影响实验结果的解读。因此，采用阴性选择可确保在不诱导激活或功能变化的前提下分离中性粒细胞。此外，基于阴性分离的磁性分离法无需红细胞（RBC）裂解步骤。这不仅减少了额外的洗涤步骤和细胞死亡，从而提高细胞得率，还通过降低红细胞污染提高了分离中性粒细胞的纯度。与原始方案相比，整个操作过程（包括洗涤和重悬）均使用细胞分离缓冲液替代PBS。该缓冲液含有可减少细胞聚集并在磁性分离过程中最小化非特异性结合的添加剂。通过持续使用细胞分离缓冲液，相较于使用PBS，我们实现了更高效的细胞分离、更高的纯度以及更多活的、未受干扰的中性粒细胞得率.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 聚丙烯圆底试管（17 x 100 mm）	Corning Science	352059
APC 抗人 CD14（63D3）	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 抗人 CD10（25 次检测）	BioLegend	312217
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep 磁力架	StemCell Technologies	#18103
EasySep 缓冲液（细胞分离缓冲液）	StemCell Technologies	#20144
EasySep 直接人中性粒细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	#19666
人 FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC 抗人 CD16（3G8）	BioLegend	302005
OneComp eBeads 补偿微球	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 抗人 CD86（BU63）	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 抗人 CD15（SSEA-1）	BioLegend	323037
磷酸盐缓冲液片剂	Gibco	18912-014
Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒	BioLegend	423105