从全血中分离与鉴定低密度和正常密度中性粒细胞

摘要

本文提供了一种利用磁性分离法（阴性筛选）结合不连续密度梯度介质从全血中分离低密度和正常密度中性粒细胞的可靠方法。该方法可实现未受干扰的高纯度细胞分离（≥93%），有助于对中性粒细胞亚群进行准确的下游分析，对于理解其在健康与疾病中的作用至关重要。

摘要

新兴研究表明，人体循环中的中性粒细胞群体包含多种不同的亚型，不应再像以往那样将其视为单一群体进行研究。特别是低密度和正常密度中性粒细胞（LDNs、NDNs）已被证明具有功能和代谢上的显著差异，这一因素在发表中性粒细胞相关研究时必须予以考虑。本文介绍了一种改进的方法，用于从全血中无接触地分离和纯化LDNs与NDNs。

将密度梯度介质（1.135 g/mL）以9:10的比例与10倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）混合。通过将100%密度梯度介质与1倍浓度的磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合，配制出55%、70%和81%的特定密度梯度。使用基于阴性筛选的磁珠分离试剂盒，从已签署知情同意书的供体获取的12 mL外周全血中分离中性粒细胞，并将其重悬于55%密度梯度层中。在15 mL离心管中，依次加入3 mL的81%和70%密度梯度液，随后小心加入含有全部中性粒细胞的55%梯度层。密度梯度样品在720 × g 条件下离心30分钟。在55%/70%界面处获得低密度中性粒细胞（LDNs），在70%/81%界面处获得正常密度中性粒细胞（NDNs）。将细胞小心吸取至不同的离心管中，并用PBS洗涤。采用流式细胞术测定分离组分的纯度。LDNs和NDNs在流式细胞术中均定义为CD14lo CD15+ SSChi表型。两种细胞类型的分离纯度均达到≥93%的活细胞比例。

该方法提供了一种可靠且高效的从外周血中分离LDN和NDN的策略，可确保分离细胞的高纯度和高活性。提高中性粒细胞分离的精确性，有助于对这些不同的中性粒细胞亚群进行更准确的下游分析。这对于深入理解中性粒细胞异质性及其在多种生理和病理过程中的意义至关重要。

引言

中性粒细胞是具有颗粒的免疫细胞，也是外周血中最丰富的白细胞，平均占白细胞总数的50%–70%。它们在骨髓中由粒细胞-单核细胞前体（GMPs）发育而来，而GMPs又在粒细胞集落刺激因子（G-CSF）存在的情况下由造血祖细胞（HPCs）发育形成。在稳态条件下，中性粒细胞的寿命约为24小时，但研究表明，在特定生理条件及其相关微环境（如慢性免疫激活¹、炎症¹，甚至稳态下的组织驻留²）中，其寿命可被延长。长期以来，中性粒细胞被认为是抵御病原体的第一道防线，主要通过三种主要效应功能发挥其抗微生物作用：脱颗粒、吞噬作用以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的激活与释放（NETosis）。

大多数关于中性粒细胞功能与生物学的研究均针对整个中性粒细胞群体的结局进行分析。然而，随着在癌症环境中对N1（抗肿瘤）/N2（促肿瘤）亚型的研究，以及基于成熟度、疾病状态、生理状态甚至细胞密度（低密度和正常密度中性粒细胞）对中性粒细胞的分类，人们日益认识到人类中性粒细胞群体在表型上具有高度异质性。无论这些中性粒细胞亚型的存在是源于完全不同的细胞类型，还是源于细胞可塑性的复杂特性，目前已有越来越多的文献报道了非典型中性粒细胞，这为将低密度中性粒细胞与正常密度中性粒细胞分开研究提供了有力契机³。

低密度中性粒细胞（LDNs）最初在系统性红斑狼疮（SLE）患者中被描述为一种促炎性中性粒细胞亚群⁴，此后在慢性疾病、妊娠期甚至健康个体的循环血液中也被发现，具有促炎性和免疫抑制性双重功能^5,6,7,8。当全血经密度梯度介质离心时，LDNs会与外周血单个核细胞（PBMCs）同时出现。其特定密度约为1.077 g/mL，而正常密度中性粒细胞（NDNs）的密度为1.083 g/mL⁹。尽管目前对此仍有较大争议，但有推测认为LDNs可能类似于更不成熟的粒细胞表型（类似于早幼粒细胞和中幼粒细胞，密度低于1.080 g/mL）^9,10。也有观点认为，LDNs存在成熟与不成熟两种表型，具体取决于疾病的存在与否^11,12,13。然而，LDNs亦已在健康个体中被检测到；但由于难以分离出足够数量，其在部分研究中的纳入仍受限⁵。

本研究旨在分离出足够数量的这两个群体，以便进行后续分析 原位 代谢实验（最少 0.5 × 10⁶ 细胞/毫升）。通过此操作，对现有方案⁵ 使用常被报道的表型标志物进行了优化^13,14 可从全血中分离和表征LDN和NDN并获得最佳效果的方法（图1A).

方案

在取得健康参与者的知情同意后采集血液样本。该研究已获得圣詹姆斯医院和塔拉赫特大学医院研究伦理委员会的批准。

1. 密度梯度介质、等渗工作溶液组分及细胞分离缓冲液的制备

1. 从密度梯度介质制备等渗工作液
   1. 制备等渗100%工作液（~1.123 g/mL）
      1. 为制备等渗100%工作液，将27 mL密度梯度介质与3 mL 10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）混合。所得溶液为等渗溶液，适用于进一步稀释。
   2. 制备等渗81%工作液（~1.0996 g/mL）
      1. 将8.1 mL等渗100%工作液（按步骤1.1.1制备）与1.9 mL 1倍浓度磷酸盐缓冲液（1x PBS）混合，制得等渗81%工作液。充分混匀以确保溶液均一。
   3. 制备等渗70%工作液（~1.0861 g/mL）
      1. 为制备等渗70%工作液，将7 mL等渗100%工作液与3 mL 1x PBS混合。确保溶液充分混匀。
   4. 制备等渗55%工作液（1.0676 g/mL）
      1. 将5.5 mL等渗100%工作液与4.5 mL 1x PBS混合，配制等渗55%工作液。充分混匀。
2. 梯度组分的分层
   1. 梯度组分分层
      1. 使用15 mL锥形管，小心地将3 mL等渗81%工作液置于管底。随后缓慢而轻柔地将3 mL等渗70%工作液叠加于上层，避免各层混合。该梯度用于细胞分离。
3. 细胞分离缓冲液的制备
   1. 制备500 mL细胞分离缓冲液
      1. 将2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）加入1x PBS中，定容至500 mL，以制备细胞分离缓冲液。在细胞分离过程中，使用该缓冲液洗涤和重悬细胞。
         注：确保各层之间界限清晰且未受扰动。本方案中，等渗工作液根据其制备方法分别称为"100%"、"81%"、"70%"和"55%"，此命名方式与先前研究一致⁵。但需明确指出，这些标识并不代表工作液的实际最终浓度。例如，"100%"密度梯度介质是通过将27 mL纯密度梯度介质与3 mL 10x PBS混合制得，其最终浓度为90%等渗工作液。后续稀释液（如"81%"、"70%"和"55%"）同样反映的是制备比例，而非真实百分比浓度。保留此命名法是为了与该领域早期文献中的术语保持一致。

2. 使用阴性选择法从全血中分离中性粒细胞

1. 磁珠的制备
   1. 使用前将磁珠充分涡旋振荡30秒，以确保完全重悬。
2. 血液准备
   1. 对每位供体，将4 mL全血分装至三个独立的14 mL圆底管中。
3. 中性粒细胞分离试剂和磁珠的添加
   1. 每毫升血液向每管中加入50 µL中性粒细胞分离试剂和50 µL磁珠。对于4 mL血液，每种试剂各加200 µL。
   2. 轻轻吹打混匀，室温（RT）孵育5分钟，使试剂与非目标细胞结合。
4. 洗涤与磁性分离——第一轮
   1. 用细胞分离缓冲液将每管体积补至12 mL，并充分混匀。
   2. 将无盖的管子置于磁架上，室温孵育10分钟，使与磁珠结合的非目标细胞被吸附至管壁。
5. 未结合细胞的收集
   1. 用移液管小心地将含有中性粒细胞的澄清细胞悬液从每根管中转移至新的洁净管中。将原管从磁架上移除。
6. 磁珠再次添加与孵育——第二轮
   1. 再次涡旋振荡磁珠30秒。向新转移的细胞悬液中加入与步骤2.3相同体积的磁珠，充分重悬后室温再孵育5分钟。
7. 最终磁性分离与收集
   1. 将管子重新放回磁架上（不加盖），室温再孵育10分钟。
   2. 小心地将澄清的细胞悬液转移至新管中。此最终悬液即为分离得到的总中性粒细胞群体。

3. 从总中性粒细胞群体中分离低密度中性粒细胞（LDNs）和正常密度中性粒细胞（NDNs）

1. 细胞悬液的合并与制备
   1. 将每位供体分离得到的中性粒细胞悬液合并至50 mL离心管中。使用细胞分离缓冲液将每管补至总体积50 mL。
2. 离心
   1. 在室温下以400 x g 离心5分钟，离心时开启刹车。
3. 重悬与细胞计数
   1. 弃去上清液，将中性粒细胞沉淀用1 mL细胞分离缓冲液重悬。进行细胞计数，以确定中性粒细胞的总数。
4. 密度梯度介质的制备
   1. 再次在室温下以400 x g 离心5分钟（开启刹车），弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于3 mL 55%密度梯度介质中。为获得最佳分离效果，每5-6 × 10⁶个总中性粒细胞使用3 mL 55%密度梯度介质。
   2. 如有必要，可将重悬后的细胞分装至多个预先制备好的密度梯度离心管中，确保每管中加入3 mL细胞悬液。
5. 叠加至密度梯度离心管
   1. 将含有55%密度梯度介质的3 mL细胞悬液缓慢叠加至预先制备的密度梯度离心管（按第1节所述方法制备）。操作时应小心叠加，避免扰动梯度层。
6. 密度梯度离心
   1. 以720 x g 离心30分钟，离心过程中不使用刹车。离心结束后，小心操作离心管，避免扰动已形成的分层。
7. 中性粒细胞组分的分离
   1. 离心后，可见中性粒细胞分为两个明显的层：
      低密度中性粒细胞（LDNs）位于55%/70%界面处，形成约在3 mL刻度位置的上层条带；正常密度中性粒细胞（NDNs）位于70%/81%界面处，表现为约在6 mL刻度位置的下层条带。
   2. 使用移液管小心分离每一层，并转移至不同的15 mL离心管中。
8. 分离组分的洗涤
   1. 为去除残留的密度梯度介质，向每个15 mL离心管中加入1x PBS至15 mL刻度线。
   2. 在室温下以400 × g 离心5分钟（开启刹车）。若细胞未能形成紧密的沉淀而仍悬浮于溶液中，则需重复洗涤步骤，表明仍有残留的密度梯度介质存在。
9. 细胞计数与后续应用
   1. 对各组分中的细胞进行计数，并根据需要进行后续实验，如代谢实验、流式细胞术染色、RNA提取或蛋白裂解等。
      注意：细胞铺板后，建议以210 × g 离心1分钟（关闭刹车）使细胞沉降。

4. 分离的低密度中性粒细胞和正常密度中性粒细胞的表型分析

1. 分离约 0.5–1 × 10⁶ 个 LDN 和 NDN。使用 CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fc 封闭抗体及活率染料配制 2 倍浓缩的抗体混合液。
2. 用等体积的上述抗体混合液对分离得到的 LDN 和 NDN 细胞群体进行染色，使抗体（CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fc 封闭）的最终稀释比例为 1:100，活率染料为 1:50。
3. 在室温避光条件下孵育 10 分钟。
   注意：确保细胞与抗体混合液及 Fc 封闭抗体充分混匀。
4. 用 PBS 洗涤细胞一次，然后在 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 在室温避光条件下，用 1% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 15 分钟。
6. 再次用 PBS 洗涤细胞，在 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 将细胞重悬于 200 µL PBS 中，或根据需要调整体积，并尽快上流式细胞仪检测。
   注意：染色并固定后的细胞可在 4 ^◦C 避光短期保存，以防止荧光染料发生光漂白。但理想情况下，表型分析应在染色和固定后尽快完成，以确保细胞活性最佳且结果准确。

结果

在图1B中可观察到总中性粒细胞在密度梯度介质上的成功分层。应获得两条明显不同的条带。如果梯度发生混合，或每管所加总中性粒细胞数量过高（大于约5-6 × 10⁶），条带将呈现弥散状（图1C），两种中性粒细胞亚群发生混合的风险将显著增加。为避免此情况，建议每根密度梯度管中分层的总中性粒细胞数量不超过5-6 × 10⁶。尽管有报道称健康个体中低密度中性粒细胞（LDNs）数量极低，因而难以满足后续研究需求，但本方法在健康受试者中可获得较高的LDNs（平均3.28 × 10⁶ 个细胞/mL）和正常密度中性粒细胞（NDNs）（平均10.64 × 10⁶ 个细胞/mL）得率及纯度（图2）。

LDN 的平均分离纯度为 93.80%（± 5.80），NDN 的平均分离纯度为 96.30%（± 3.30；图 2A

讨论

本文介绍了一种优化方法，可将中性粒细胞总体群分离为低密度和正常密度中性粒细胞，并采用既往方法改进的流式细胞术对每种细胞类型进行表型表征⁵。

本方案基于从全血中分离LDN和NDN。关键步骤是通过阴性选择方法分离中性粒细胞。阳性选择方法涉及使用可结合表面标志物的抗体，可能激活中性粒细胞并触发脱颗粒⁵。这种激活会改变中性粒细胞的功能和代谢状态，从而干扰下游实验，导致结果不准确并影响实验结果的解读。因此，采用阴性选择可确保在不诱导激活或功能变化的前提下分离中性粒细胞。此外，基于阴性分离的磁性分离法无需红细胞（RBC）裂解步骤。这不仅减少了额外的洗涤步骤和细胞死亡，从而提高细胞得率，还通过降低红细胞污染提高了分离中性粒细胞的纯度。与原始方案相比，整个操作过程（包括洗涤和重悬）均使用细胞分离缓冲液替代PBS。该缓冲液含有可减少细胞聚集并在磁性分离过程中最小化非特异性结合的添加剂。通过持续使用细胞分离缓冲液，相较于使用PBS，我们实现了更高效的细胞分离、更高的纯度以及更多活的、未受干扰的中性粒细胞得率...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 聚丙烯圆底试管（17 x 100 mm）	Corning Science	352059
APC 抗人 CD14（63D3）	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 抗人 CD10（25 次检测）	BioLegend	312217
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep 磁力架	StemCell Technologies	#18103
EasySep 缓冲液（细胞分离缓冲液）	StemCell Technologies	#20144
EasySep 直接人中性粒细胞分离试剂盒	StemCell Technologies	#19666
人 FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC 抗人 CD16（3G8）	BioLegend	302005
OneComp eBeads 补偿微球	eBioscience Inc.	01-1111-42
PE/Cy7 抗人 CD86（BU63）	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 抗人 CD15（SSEA-1）	BioLegend	323037
磷酸盐缓冲液片剂	Gibco	18912-014
Zombie NIR 可固定活力检测试剂盒	BioLegend	423105