本方案介绍了用于昆虫的谐波雷达标签的制备、附着与追踪方法。
本文内容
摘要
摘要
利用追踪设备监测动物活动长期以来一直是研究脊椎动物行为与生态学的标准方法。直到最近，由于必须附着在昆虫身上的追踪设备体积和质量过大，这些追踪技术一直无法应用于昆虫学研究。应用于昆虫追踪的技术包括无线电遥测、蓝牙、射频识别（RFID）和谐波雷达。其中，无线电遥测是追踪较大型昆虫最常用的方法，其优势在于具有较长的探测距离，并能为每只被追踪昆虫提供独特的信号，但其标签成本高昂，使用寿命有限（包括储存寿命和野外使用时间），且重量较大，通常至少为150毫克。相比之下，自1986年起首次使用的谐波雷达标签重量至少轻一个数量级，成本低廉，且具备足够的探测范围，可用于在野外追踪多种体型较小的昆虫。本文中，我们将展示一种市售的、专为野外救援设计的收发器在昆虫追踪中的应用。结合低成本的标签与市售收发器，该昆虫追踪技术将极大提升昆虫行为与生态学研究人员对该技术的可及性。在本文中，我们将介绍标签的制作、将标签附着于昆虫个体、对已标记昆虫进行追踪的过程，并展示 一些典型的追踪结果。
引言
利用追踪装置研究脊椎动物的活动长期以来一直是收集哺乳动物、鸟类和鱼类等较大型动物行为与生态数据的标准方法，此类追踪主要采用无线电遥测和GPS追踪技术1。然而，直到最近，由于必须附着在动物身上的追踪装置体积和质量过大，这些追踪方法一直无法应用于昆虫学研究2。应用于昆虫追踪的技术包括无线电遥测、蓝牙、射频识别（RFID）和谐波雷达2,3。其中，无线电遥测是目前追踪较大型昆虫使用最广泛的方法2。该方法具有较长的检测范围，并能为每只被追踪昆虫提供独特的信号。然而，该方法所需的标签成本高昂，保存寿命和野外使用时间有限，且重量较大，通常至少为150 mg。蓝牙技术目前发展程度最低，其标签虽比无线电遥测标签更小，但作用距离也更短3。RFID标签体积非常小，价格低廉，但作用距离最短（通常仅几毫米）4。使用RFID标签标记昆虫最常见于研究蜜蜂工蜂进出蜂巢的行为5。相比之下，谐波雷达标签的重量至少比无线电遥测标签轻一个数量级，成本低，且具备允许在野外追踪更小型昆虫的检测范围6（图1）。
谐波雷达使用一种收发器，该收发器发射信号以激发昆虫携带的标签，并接收标签返回的频率倍增信号7,8,9（图2）。尽管已有许多研究描述了将谐波雷达标签用于中等体型昆虫的案例6,10,11,12,13，但尚无关于如何制作此类标签的完整演示。本文提供了制作两种不同尺寸谐波雷达标签的分步说明，每种标签均由肖特基二极管和镍钛诺金属丝构成。较小的标签更轻，适用于体型较小的昆虫6，而较大的标签作用距离更远，适合体型较大的昆虫11。镍钛诺金属丝是设计中的关键组件，因其具有良好的柔韧性，可使标记昆虫相对自由地活动；同时它还能迅速恢复至直线状态，从而实现最大化的信号回传6,10,11。我们还展示了市售收发器的应用（见下文“信号获取”部分），该设备原本用于野外救援7,9,14。低成本的标签与市售收发器相结合，使这种昆虫追踪技术对研究昆虫行为与生态的昆虫学家而言极具可及性。本文中，我们 介绍 标签 的制作方法、标签在昆虫体上的附着、对标记昆虫的追踪过程，并提供 一些典型的追踪结果。
方案
1. 准备
- 准备制作标签所需的所有材料：镍钛诺丝（小标签使用 0.0254 mm，大标签使用 0.0762 mm）、肖特基二极管（每个标签一个）、导电粘合剂（建议使用银导电环氧树脂以获得最大强度，轻质标签可使用银导电漆）以及用于切割金属丝和组装标签的 3D 打印夹具（参见材料表）。
- 确保备有两种不同规格的镍钛诺丝，分别为 25 µm 和 75 µm，分别用于小标签和大标签。
2. 大标签
注意：本节介绍大型标签的组装。组装大型标签时，必须使用两根长度合适的天线导线（8.25 cm，以匹配收发器频率）。
- 使用测量夹具和剪刀，将导线重复性地切割至所需长度（8.25 cm）。
- 首先，使用单面胶带将导线固定在夹具上。
- 将导线缠绕在夹具上（最多 20–30 圈），保持轻微张力。
- 使用剪刀在槽道内切断导线。所得导线长度为 8.25 cm。
- 然后小心地将导线从圆柱体上取下。
注意：每个标签需要两根导线。
- 准备二极管以便连接导线。
- 使用胶带将二极管封装固定在显微镜上。用镊子掀开盖子，并用双面胶带取出二极管。
- 在封装上贴上双面胶带，以便轻松取下二极管。
注意：此时所有二极管均处于正确方向，电极朝上，便于天线焊接。
- 将带有二极管（电极朝上）的胶带固定在夹具上。在两侧平行放置卡纸，并抚平边缘，防止天线粘附到胶带上。
- 在显微镜下，将导线与二极管对齐，准备连接，并 调整导线位置，使其各自仅接触一个电极。
注意：导线不应同时接触两个电极。 - 使用昆虫针将导电材料涂覆到每个电极上。确保电极接触点和导线均被覆盖。
- 注意不要使导电材料在各电极之间扩散。如果导电材料混合或接触到另一根导线或电极，将显著降低标签的信号强度。
- 根据需要重新涂抹导电材料，以牢固固定每根导线并确保电导性。
- 让标签静置数小时，使导电材料充分固化。
3. 小标签
注意：本节介绍小型标签的组装。
- 将导线剪成 4.1 cm 长。
- 使用单面胶带将导线固定在夹具上，注意不要过度拉紧导线。
- 将导线缠绕在夹具上，并用剪刀沿凹槽切断。
注意：每个标签需要两段上述制备好的导线。 - 准备用于连接的二极管。在夹具上贴上双面胶带，用镊子将二极管转移至胶带上，保持其间有适当间距。
- 在显微镜下确认二极管的接触面朝上，以便对齐导线与二极管。根据需要重新调整位置，并确保其被压紧在胶带上，防止在组装过程中移动。
- 沿二极管方向贴上单面胶带，以抬高导线至接触点水平，防止导线粘附到底层胶带上。将胶带抚平，并将导线大致放置在二极管附近。
- 在显微镜下小心地将导线放置在每个接触点上，避免导线重叠。
- 在接触点和导线上涂抹导电材料，并确保导电材料不会流动合并或淹没二极管表面。
- 让标签 静置数小时，使导电材料充分固化。
4. 大型标签附着——昆士兰长角甲虫（QLB）
- 穿戴适当的个人防护装备以防止紫外线暴露（建议佩戴护目镜）。
- 固定甲虫以方便接触粘贴部位。轻轻握住甲虫，并对其施加轻微压力使其紧贴桌面。
- 在粘贴部位滴加一滴紫外光固化胶。
- 调整标签方向，使二极管的电极接触面朝下，贴附于胸部。
- 确认标签位置合适后，从多个角度使用紫外光照射，总照射时间为5至10秒，以固化胶水。此前已有研究使用该紫外光固化胶将标签粘附于较大的昆虫，未观察到紫外线暴露产生明显负面影响11。
5. 小型标签附着——实蝇科果蝇
- 穿戴适当的个人防护装备以防止紫外线暴露（建议佩戴护目镜）。
- 将果蝇置于 4 oC 下进行麻醉。通常情况下，果蝇在 10–15 分钟后停止活动。
- 挤出一滴胶水，将标签的二极管 浸入紫外光固化胶中。确保在胶水中滚动二极管，以实现完全覆盖。注意避免过多胶水粘附到导线上。
- 用拇指和食指固定昆虫，以便暴露粘贴部位。
- 调整标签方向，将其纵向放置在果蝇胸部的背侧。前后移动标签以铺展胶水，确保牢固粘接。注意不要将胶水沾到头部或翅膀上。
- 当确认标签位置合适后，使用紫外灯固化胶水。已有多个研究使用这种紫外光固化胶将标签粘附于果蝇，未观察到紫外线暴露的明显负面影响6,10,12,13。
6. 获取信号
- 在附着标签后测试昆虫的飞行能力。可通过飞行管进行测试。
- 随后让果蝇起飞进入其栖息环境。
- 使用收发器（见材料表）接收来自大型和小型昆虫的信号。
注意：当收发器与标签对齐时，会发出声音；当收发器旋转90度时，由于标签与收发器未对齐，将接收到微弱信号或无信号。
结果
检测范围和标签尺寸可能是昆虫追踪标签的两个最重要特征。本文展示了本研究所制备的大尺寸和小尺寸标签的最大检测距离的代表性结果。最大检测距离的测定方法是将标签用双面胶纵向固定在一根粗木杆（约1.5 m）上，然后将收发器逐渐远离标签，直到无法听到标签信号为止，以此确定可检测到信号的最大距离。每种尺寸的标签均在开阔场地中测试了10个样本。较大标签的最大检测距离约为较小标签的四倍（表1）。在实际野外条件下，标签与收发器之间的未对准以及植被干扰通常会降低检测距离。根据我们的经验，在果树田间作业时，我们通常假设较大标签的检测距离约为10 m，较小标签的检测距离约为5 m。
最后，我们希望分享一项针对昆士兰长角甲虫（QLB）的代表性追踪研究结果。本研究旨在探究QLB的移动生态学特征，因为目前关于成年甲虫在环境中活动区域的信息十分有限。由于这类甲虫具有隐蔽性，若无诸如谐波雷达（HR）之类的追踪技术，很难在自然环境中定位它们。该研究在夏威夷大岛的一片 kukui 树（Aleurites moluccana）林中进行。研究过程中，多只甲虫被标记后释放，并利用本文前述的追踪技术进行定位。其中一只甲虫在10天内的移动路径示例见图4。请注意，该甲虫被追踪至多个位置，包括高处的kukui树冠以及枯叶中。这是本研究的一项重要发现。由于QLB具有高度隐蔽性，农民常常询问这些甲虫在树体周围“藏匿”于何处。通过追踪个体QLB，我们确定甲虫常隐藏于干枯叶片中，因此难以被发现。本研究为了解QLB成虫在白天的停留位置以及夜间的活动模式提供了重要的新见解。
图1：常用于追踪昆虫的设备比较。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：谐波雷达通过发射某一频率的信号（蓝色），然后接收返回的频率倍增信号（红色）来工作。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：信号强度与标签和收发器的相对方向有关。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：在夏威夷榄仁树中追踪单只昆士兰长角甲虫的代表性结果。请点击此处查看该图的放大版本。
| 大型标签 | 小型标签 |
| 64 ± 1 m | 12 ± 1 m |
表1：昆虫谐波雷达标签的最大探测距离（均值 ± 标准误，m）（N = 10）。
讨论
在本实验方案中，我们描述并演示了如何制备两种尺寸的谐波雷达标签。此外，我们还展示了如何使用紫外固化胶将这些标签粘附到昆虫体表，并演示了收发器的信号强度。本方案经过优化，可在仅需最少专用实验设备的情况下，高效地批量制备低成本的谐波雷达标签。同时，该方案适用于具备在解剖显微镜下操作物体经验的研究人员。我们建议初次尝试制备标签的研究人员从较大的标签开始，以掌握二极管操作及导电胶涂敷的技能。这些操作起初可能较难，但根据我们的经验（已指导超过20人），学习曲线较为平缓，研究人员通常能够较快地掌握技术，进而高效且可重复地制备更小的标签。
虽然展示了两种标签尺寸的制备，但我们还制作了带有中等尺寸二极管的标签6，使用较细和较粗直径的镍钛诺金属丝。不同的应用，例如昆虫的体型大小和所需的探测范围，会影响 二极管和导线尺寸的选择。
本方案中使用的标签设计比其他用于追踪昆虫的标签更为简单15,16,17,18一种常用的设计是在天线中设置一个环路，从而形成直流短路 穿过二极管18,19天线带有环状结构的标签通常垂直安装在昆虫胸部，而不是像本方案中所示的纵向安装。垂直方向可能有助于昆虫飞行时标签与接收器之间实现更好的对齐（因为昆虫通常不会横向飞行） 倒挂或腿部朝向侧面飞行）。然而，垂直的标签朝向会使标签的质量中心远离昆虫的质心，从而可能对平衡和飞行能力产生更大的影响。
披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
我们谨感谢凯特·费尔班克斯和詹姆斯·斯奈德（佛罗里达州农业部） & 消费者服务）、Nicholas Manoukis（美国农业部农业研究局 PBARC）、James Yoder（东门诺大学）和 Stefano De Faveri（昆士兰农业与渔业部）对本实验方案的审阅。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大型组装夹具 | https://www.thingiverse.com/thing:6784793 | ||
| 大型线材夹具 | https://www.thingiverse.com/thing:6784784 | ||
| Nitinol 导线（小型） | Fort Wayne Metals (Fort Wayne, IN, USA) | 17822174 | |
| RECCO R9 手持式探测器 | RECCO AB (Lidingo··, 瑞典) | 工作频率：欧洲，866.9 MHz（发射），1733.8 MHz（接收）；美国，902.85 MHz（发射），1805.7 MHz（接收） | |
| 射频肖特基二极管（小型） | MACOM Technology Solutions (Lowell, MA, USA) | MA4E2501L-1290 | 通过 Richardson RFPD 购买 |
| 肖特基二极管（大型） | RECCO AB (Lidingo··, 瑞典) | ||
| 银导电环氧胶粘剂 | MG Chemicals | 12642-14 (Amazon: 8331D) | 通过 Amazon 购买 |
| 小型组装夹具 | https://www.thingiverse.com/thing:6784791 | ||
| 小型线材夹具 | https://www.thingiverse.com/thing:6784775 | ||
| 超弹性 Nitinol 导线（大型） | McMaster-Carr (Brookpark, Ohio, USA) | 8320K31 | 直径 0.003"，长度 30 英尺 |
| Ted Pella 公司银导电环氧树脂 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC9959045 | |
| 紫外光固化胶 | Bondic (Niagara Falls, NY, USA) | 通过 Amazon 和/或 Bondic 官网 (notaglue.com) 购买 |
参考文献
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