RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
RASopathies 是由 ERK 过度激活引起的一类遗传综合征，可导致多系统疾病，并可能增加患癌风险。尽管该病具有广泛的遗传异质性，但大多数病例均由 RAS-MAPK 信号通路关键调控因子的生殖系功能获得性突变所致。得益于先进的测序技术，影响 RAS-MAPK 通路的潜在致病性变异仍在不断被发现。对这些变异致病性的功能验证对于准确诊断至关重要，需要快速且可靠的实验方案，最好在 体内 进行。鉴于幼儿期有效治疗手段有限，此类方案若能在具有成本效益的动物模型中实现规模化，将有望为药物重新定位/再利用提供重要的临床前研究基础。
本文逐步描述了在斑马鱼胚胎中快速建立瞬时RASopathy模型的方案，并通过实时多光谱Förster共振能量转移（FRET）成像，直接观察在原肠胚形成期间即已发生的与疾病相关的活体ERK活性变化。该方案采用了一种近期建立并已整合到商用显微镜硬件中的转基因ERK报告系统。我们以Noonan综合征（NS）斑马鱼模型为例，该模型通过表达Shp2D61G构建而成。我们介绍了一种简便的方法，可在药理学信号调节前后，记录NS鱼模型中ERK信号的变化，所用调节剂为现有低剂量MEK抑制剂。我们详细说明了如何在处理前后生成、获取和评估来自多光谱采集的比率型FRET信号，并通过早期整体胚胎的经典免疫荧光染色对结果进行交叉验证。随后，我们描述了如何通过检测标准形态计量学参数，分析同一胚胎在受精后6小时通过活体FRET评估ERK活性后出现的后期胚胎形态改变，这些改变提示原肠胚形成过程可能受到损伤。
引言
RAS病是一类影响正常发育并累及多种器官和组织的遗传综合征。这些疾病通常由RAS/MAPK信号通路中关键基因的种系功能获得性（GoF）突变所致，导致细胞外信号调节激酶（ERK）的过度活化（磷酸化水平升高）。ERK通过转入细胞核来调控发育过程中的某些基本过程——如组织生长-1,2。RAS-MAPK通路相关基因的体细胞突变是导致癌症最常见的事件3。因此，RAS病患者同样表现出癌症易感性并不令人意外。努南综合征（Noonan syndrome, NS）是RAS病中最常见的类型，其特征为发育迟缓、身材矮小、程度不一的认知缺陷以及心肌病2。在大多数病例中，该疾病由PTPN11基因的功能获得性突变引起，该基因于2000年代初首次被发现，是第一个被确认的RAS病相关基因4，编码蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，后者作为该信号通路的正向调控因子发挥作用。
自那时以来，由于外显子组测序技术在未确诊患者中的广泛应用，不断发现影响RAS-MAPK通路相关因子的潜在致病性变异，这些变异可能与多种RASopathies疾病相关，但仍需进行功能表征，以实现对患者的高效分层2
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方案
所有涉及动物饲养和繁殖的实验操作均按照动物研究中使用斑马鱼的ARRIVE指南进行，并由意大利卫生部（动物健康与兽药总局 - DGSAF）授权。所有DNA/RNA反应和成像实验可根据所需的最终材料量或所检测基因与变异的数量按需扩大或缩小规模。
1. 瞬时斑马鱼RASopathy模型的构建与药物处理
注意：为了监测与 RASopathy 相关的变异体的表达，可以使用包含目的蛋白特定编码序列（cds）的构建体，该序列需与小的非荧光标签（如 myc 或类似标签）的编码序列保持读框一致。通过针对标签的标准 Western 印迹法，可评估突变蛋白的表达水平。如果存在针对特定目的蛋白的抗体，则可避免使用标签。也可采用免疫荧光法，根据标准实验流程检测胚胎组织内的蛋白表达。此类对照实验有助于将突变蛋白的表达水平与所诱导的 ERK 激活程度相关联。由于显微镜成像过程中可能出现荧光发射信号串扰，因此不建议将荧光标签与 FRET 成像结合使用。
- 质粒线性化（第1-2天）图1A)
注意：在由影响特定基因的获得性功能（GoF）突变引起斑马鱼（此处为RASopathy）瞬时疾病模型的构建过程中，一种快速方法是制备编码目的野生型（WT）和突变蛋白的mRNA，随后按照以下步骤将其注射到斑马鱼胚胎中。用于转录mRNA的质粒模板....
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结果
本方案展示了一种简单的操作流程，可快速建立斑马鱼胚胎中的瞬时RAS病模型，并利用 recently established ERK斑马鱼传感器6,9，结合标准的活体FRET成像方法，检测早期突变体中ERK的动态变化。如近期研究所示6,7，在同一实验流程中，可通过针对磷酸化ERK和总ERK的标准免疫组化（IHC）在整体胚胎上对FRET结果进行交叉验证。在FRET检测所用的同一胚胎中，还可于后续发育阶段追踪体轴形成障碍与ERK激活增强之间的相关性7。本文展示了通过FRET记录到的早期原肠胚中典型的ERK波动，这些波动与导致努南综合征（NS）的Shp2D61G表达相关。此外，还收集了经低剂量MEK抑制剂（MEKi）处理后信号呈负向调控的突变体数据，该处理可抑制RAS/MAPK信号通路。
.......
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讨论
尽管数十年的研究已发现大量突变，导致如今已明确多种高度异质性的RASopathies亚型，但在对尚未确诊的患者进行测序时，仍不断出现意义未明的遗传变异。实际上，在许多情况下，仅依靠临床特征进行诊断具有挑战性，因此仍需依赖功能基因组学方法来验证测序结果。此外，尽管已有部分抗癌药物（例如 MEK抑制剂）被提议用于治疗部分RASopathies，并且已出现一些成功的案例，但目前仍缺乏广泛共识。这主要是由于大多数现有药物缺乏充分的临床前证据支持，包括在儿童患者中使用强效抗癌药物时的有效剂量和治疗窗也尚不明确。
动物模型中的功能分析是疾病亚型分类、患者分层以及药物初步评估的重要步骤。斑马鱼可作为用于验证导致儿童疾病（包括RASopathies）的潜在致病性变异体功能的高效体内模型14。目前针对与RASopathy相关变异体影响的表型评估已有先进方法，适用于斑马鱼RASopathy模型，主要依赖形态学指标——即在原肠胚形成结束时测量胚胎体轴的"卵形测试"。然而，与ERK激活的相关性分析通常仍主要通过标准.......
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致谢
我们感谢荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的Jeroen den Hertog博士慷慨提供了pCS2+_eGFP-2a-Shp2a质粒，我们从中提取了shp2的全长CDS以构建所使用的质粒模板7。我们感谢奈良先端科学技术大学院大学（Takaaki Matsui）和日本国立遗传学研究所（NIG/ROIS）（Koichi Kawakami）提供了转基因Teen报告基因品系。本研究得到了意大利卫生部2021年和2024年常规研究基金以及青年研究人员定向研究基金GR-2019-12368907（AL）；2019年常规研究基金、PNRRMR1-2022-12376811、2019年5x1000项目、AIRC（IG-21614和IG-28768）以及LazioInnova（A0375-2020-36719）（MT）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塑料器皿 | |||
| 1.7 L 繁殖缸 - 沙滩式设计 | Tecniplast | 1.7L SLOPED | 繁殖缸 |
| 毛细管 GC100F-10 | Harvard apparatus | 30-0019 | 单细胞期胚胎显微注射 |
| 细胞与组织培养板 - 12 孔 | BIOFIL | TCP011012 | 胚胎收集与处理 |
| 细胞与组织培养板 - 6 孔 | BIOFIL | TCP011006 | 胚胎收集与处理 |
| 细胞培养皿 | SPL Life Sciences | 20100 | 胚胎收集 |
| Nunc 玻璃培养皿 12 mm | Thermo Fisher | 150680 | 胚胎 FRET 光谱成像 |
| 巴斯德移液管 | Corning | 357524 | 胚胎转移 |
| 蛋白抗吸附管 2 ml | Eppendorf | 30108450 | 免疫组化检测 |
| 试剂及其他 | |||
| 鱼子粒径 500–800 µm | Rettenmaier Italia | BE2269 (500-800) | 干燥鱼类饲料 |
| 大盐湖蓝卤虫卵囊 | Sanders | 00004727 | 活体鱼类饲料 |
| Instant Ocean 海盐 | Tecniplast | XPSIO25R | 活体饲料制备用脱水海盐 |
| Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen) | 订购联系方式*： 日本国立生物资源计划斑马鱼项目，理化学研究所脑科学中心资源开发支援部门。https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *需签署材料转让协议（MTA）。 | - | ERK 报告基因斑马鱼品系供应商。签署材料转让协议（MTA）后，可从日本斑马鱼国家生物资源计划（理化学研究所，日本）获取鱼胚胎。该斑马鱼品系由奈良先端科学技术大学院大学（松井贵明）和日本遗传学研究所（NIG/ROIS）（河上晃一，Tol2 系统专利）提供（Wong 等，2018；Urasaki 等，2006；Okamoto 与 Ishioka，2010）。 |
| 6x 上样缓冲液 | Cell Signaling | B7024S | 凝胶电泳 |
| 100 bp DNA 标准分子量标记 | NEB | N3231S | 凝胶电泳 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 1,01,236 | 凝胶电泳 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414-10G | FRET 光谱成像与免疫组化检测中的胚胎封片 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A8022 | 免疫组化检测 |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 223506 | E3 培养基组分 |
| 硝酸钙 | Sigma-Aldrich | 237124 | Danieau 储存液组分 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | 免疫组化检测 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| 乙醇 99%+ | Fisher Scientific | 10048291 | 体外 RNA 纯化 |
| 16% 甲醛 | Thermo Fisher | 28908 | 胚胎固定 |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F9037 | 凝胶电泳 |
| 凝胶上样缓冲液 II（变性 PAGE） | Thermo Fisher | AM8546G | 体外 RNA 转录 |
| 冰乙酸 | Sigma-Aldrich | 695092 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G6279-1L | 免疫组化检测 |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | 免疫组化检测 |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher | A21070 | 免疫组化检测 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Danieau 储存液组分 |
| KpnI - HF（酶 + rCutSmart 缓冲液） | NEB | R3142 | 质粒线性化 |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 230391 | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 |
| Millennium RNA 标记物 | Thermo Fisher | AM7150 | 凝胶电泳 |
| Monarch 基因组 DNA 纯化试剂盒 | NEB | T3010L | 质粒线性化 |
| 小鼠单克隆 p44/42 MAPK 抗体 | Cell Signaling | 4696S | 免疫组化检测 |
| mMACHINE SP6 转录试剂盒 | Thermo Fisher | AM1340 | 体外 RNA 转录 |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma-Aldrich | G9023 | 免疫组化检测 |
| 无核酸酶水 Ambion | Thermo Fisher | AM9937 | 体外 RNA 转录 |
| PD0325901 | Sigma-Aldrich | PZ0162 | MEK 抑制剂 |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | P0290 | 显微注射混合液组分 |
| 多聚 A 尾添加试剂盒 | Thermo Fisher | AM1350 | 体外 RNA 转录 |
| 高纯度氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分 |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P0662 | PBS 储存液组分 |
| 蛋白酶 K | Sigma-Aldrich | P2308 | 免疫组化检测 |
| 兔多克隆磷酸化 p44/42 MAPK 抗体 | Cell Signaling | 4695S | 免疫组化检测 |
| SYBR safe DNA 凝胶染色剂 | Thermo Fisher | S33102 | 凝胶电泳 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 31434-M | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 71643 | PBS 储存液组分 |
| Trizma 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | PBSTr 缓冲液组分 |
| 设备 | |||
| Alliance Mini HD9 | Uvitec | - | 成像系统 |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000205 | 微量离心机 |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | - | 胚胎封片 |
| FemtoJet 4x | Eppendorf | - | 显微注射系统 |
| Infinite M Plex | Tecan | - | 多功能酶标仪 |
| Leica M205FA | Leica Microsystems | - | 荧光体视显微镜 |
| Leica TCS-SP8X（配备 OkoLab 培养箱） | Leica Microsystems | - | 共聚焦显微镜 |
| Mini-sub Cell GT 水平电泳系统 | Bio-Rad | 1704406 | 凝胶电泳 |
| PC-100 垂直拉针仪 | Narishige | - | 玻璃微针拉制仪 |
| PowerPac Universal 电源供应器 | Bio-Rad | 1645070 | 凝胶电泳 |
| Stellaris 5 | Leica Microsystems | - | 共聚焦显微镜 |
| Vortex MiniStar silverline | VWR | - | 质粒制备 |
| 软件 | |||
| Biorender | Biorender | CC-BY 4.0 许可证 | 图示卡通绘制 |
| Excel | Microsoft Office Professional Plus 2019 | - | 数据分析 |
| Fiji 软件 | ImageJ | 15.3t | 图像处理与定量分析（FRET 信号测量、免疫组化检测中 ERK 荧光强度、胚胎轴长测量） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software LLC | v. 9 | 统计学数据分析 |
| iControl 分光光度计软件 | Tecan | v. 2.0 | RNA 定量 |
| Illustrator | Adobe | 26.0.3 (64 位) | 图像整合 |
| LASX 软件 | Leica Microsystems | v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X) | 光谱 FRET 实验成像采集及用于轴长测量的胚胎成像 |
| Q9 Mini 18.02-SN 软件 | Uvitec | - | 凝胶图像采集 |
参考文献
- Iroegbu, J. D., Ijomone, O. K., Femi-Akinlosotu, O. M., Ijomone, O. M. ERK/MAPK signalling in the developing brain: Perturbations and consequences. Neurosci Biobehav Rev. 131, 792-805 (2021).
- Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D.
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重印与许可
