RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。
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摘要
摘要
RASopathies 是由 ERK 过度激活引起的一类遗传综合征，可导致多系统疾病，并可能增加患癌风险。尽管该病具有广泛的遗传异质性，但大多数病例均由 RAS-MAPK 信号通路关键调控因子的生殖系功能获得性突变所致。得益于先进的测序技术，影响 RAS-MAPK 通路的潜在致病性变异仍在不断被发现。对这些变异致病性的功能验证对于准确诊断至关重要，需要快速且可靠的实验方案，最好在 体内 进行。鉴于幼儿期有效治疗手段有限，此类方案若能在具有成本效益的动物模型中实现规模化，将有望为药物重新定位/再利用提供重要的临床前研究基础。
本文逐步描述了在斑马鱼胚胎中快速建立瞬时RASopathy模型的方案，并通过实时多光谱Förster共振能量转移（FRET）成像，直接观察在原肠胚形成期间即已发生的与疾病相关的活体ERK活性变化。该方案采用了一种近期建立并已整合到商用显微镜硬件中的转基因ERK报告系统。我们以Noonan综合征（NS）斑马鱼模型为例，该模型通过表达Shp2D61G构建而成。我们介绍了一种简便的方法，可在药理学信号调节前后，记录NS鱼模型中ERK信号的变化，所用调节剂为现有低剂量MEK抑制剂。我们详细说明了如何在处理前后生成、获取和评估来自多光谱采集的比率型FRET信号，并通过早期整体胚胎的经典免疫荧光染色对结果进行交叉验证。随后，我们描述了如何通过检测标准形态计量学参数，分析同一胚胎在受精后6小时通过活体FRET评估ERK活性后出现的后期胚胎形态改变，这些改变提示原肠胚形成过程可能受到损伤。
引言
RAS病是一类影响正常发育并累及多种器官和组织的遗传综合征。这些疾病通常由RAS/MAPK信号通路中关键基因的种系功能获得性（GoF）突变所致，导致细胞外信号调节激酶（ERK）的过度活化（磷酸化水平升高）。ERK通过转入细胞核来调控发育过程中的某些基本过程——如组织生长-1,2。RAS-MAPK通路相关基因的体细胞突变是导致癌症最常见的事件3。因此，RAS病患者同样表现出癌症易感性并不令人意外。努南综合征（Noonan syndrome, NS）是RAS病中最常见的类型，其特征为发育迟缓、身材矮小、程度不一的认知缺陷以及心肌病2。在大多数病例中，该疾病由PTPN11基因的功能获得性突变引起，该基因于2000年代初首次被发现，是第一个被确认的RAS病相关基因4，编码蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，后者作为该信号通路的正向调控因子发挥作用。
自那时以来，由于外显子组测序技术在未确诊患者中的广泛应用，不断发现影响RAS-MAPK通路相关因子的潜在致病性变异，这些变异可能与多种RASopathies疾病相关，但仍需进行功能表征，以实现对患者的高效分层2。为实现这一目标，亟需能够在整体生物水平上快速且信息丰富的实验方案，以进行功能验证。若采用经典且标准化的哺乳动物模型来检测意义未明的变异，将耗费高昂、耗时极长，并需要在不透明的大型动物中实施侵入性方法。鉴于目前大量RASopathies患者因诊断不足或未诊断而缺乏有效管理和治疗，给社会带来沉重负担，此类策略显然无法满足快速检测的需求。针对完整生物体中关键表型特征及其分子相关指标的定量评估方案，还将有助于加快现有药物在RASopathies患者中的临床转化，实现药物的再利用或重新定位。
斑马鱼是研究影响早期发育疾病的理想脊椎动物模型。首先，斑马鱼与人类具有高度的基因同源性。成年斑马鱼繁殖力高，可产生大量体型小且发育迅速的胚胎。胚胎在早期阶段具有透明性，使得主要的发育过程-表皮层扩展、原肠胚形成、轴向确定和体轴模式建立等过程均可通过标准显微镜技术轻松观察。此外，现有多种转基因品系可用于在发育过程中实时、原位追踪特定细胞行为和动态分子事件，结合先进的遗传模型构建技术，其优势无可比拟。此外，斑马鱼的表型读出可在多个层次进行评估（从整体生物体到细胞水平的缺陷），且已有多种针对特定疾病的专用检测方法建立，包括RASopathies相关疾病。5此外，对于水溶性化合物而言，在早期阶段采用相对简单的浸浴式给药方法，至少可实现高通量药物筛选。 体内 以96孔板格式。
从分子角度来看，采用免疫组织化学和免疫印迹等标准方法的研究有力地证明了ERK激活与鱼类胚胎中RAS病相关发育缺陷之间的关联6,7。近年来开发的斑马鱼EKAR型FRET生物传感器（Tg[ef1a:ERK biosensor-nes], Teen）提供了一种可靠的体内工具，能够以时空分辨的方式记录胚胎发生过程中的ERK激活。因此，该工具可用于更准确地评估RAS病鱼类模型中ERK动态变化及药物干预效应。
在 的 青少年 传感器中，报告基因的特定ERK底物会在ERK激活时被磷酸化，从而引发构象变化，使荧光CFP供体（D）与荧光Ypet（改良型YFP）受体（A）相互靠近。当D的发射光谱与A的吸收光谱显著重叠时，即可发生FRET（能量从D向A转移）。该过程与D和A之间的距离成正比，因此在Teen中可反映ERK的激活状态。可利用普通或共聚焦显微镜的标准及高级成像模块，针对活体或固定样本建立多种成像方案。在激发D后，沿CFP至YFP的特定发射光谱范围（λ）进行多光谱扫描采集，随后进行光谱分析 "解混" 算法是注册和量化FRET数据最可靠的方法之一8也可应用于活体斑马鱼样本以进行记录 体内 组织动力学
根据先前的报道6,9以及我们最近的研究应用7，本文详细描述了利用Teen鱼在原肠胚形成初期检测NS模型动物极边缘细胞中ERK激活的逐步操作流程，并将其与发育后期才显现的典型体轴缺陷进行关联分析。我们展示了如何在使用可获得的MEK抑制剂处理前后，从活体NS原肠胚中获取并分析定量的FRET数据，以及如何 通过针对磷酸化（活性）ERK的标准免疫组织化学方法对结果进行交叉验证，或对胚胎伸长缺陷进行相关的形态计量学分析。
该工作流程可用于促进对新出现的变异体和假定与RASopathies相关的疾病基因进行功能检测，并有助于深入了解在脊椎动物发育过程中ERK激活动态在空间和时间上的相关性及其与胚胎形态缺陷的关系。我们证明，该方案还可用于评估候选药物在调节ERK激活方面的有效性。
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方案
所有涉及动物饲养和繁殖的实验操作均按照动物研究中使用斑马鱼的ARRIVE指南进行，并由意大利卫生部（动物健康与兽药总局 - DGSAF）授权。所有DNA/RNA反应和成像实验可根据所需的最终材料量或所检测基因与变异的数量按需扩大或缩小规模。
1. 瞬时斑马鱼RASopathy模型的构建与药物处理
注意：为了监测与 RASopathy 相关的变异体的表达，可以使用包含目的蛋白特定编码序列（cds）的构建体，该序列需与小的非荧光标签（如 myc 或类似标签）的编码序列保持读框一致。通过针对标签的标准 Western 印迹法，可评估突变蛋白的表达水平。如果存在针对特定目的蛋白的抗体，则可避免使用标签。也可采用免疫荧光法，根据标准实验流程检测胚胎组织内的蛋白表达。此类对照实验有助于将突变蛋白的表达水平与所诱导的 ERK 激活程度相关联。由于显微镜成像过程中可能出现荧光发射信号串扰，因此不建议将荧光标签与 FRET 成像结合使用。
- 质粒线性化（第1-2天）图1A)
注意：在由影响特定基因的获得性功能（GoF）突变引起斑马鱼（此处为RASopathy）瞬时疾病模型的构建过程中，一种快速方法是制备编码目的野生型（WT）和突变蛋白的mRNA，随后按照以下步骤将其注射到斑马鱼胚胎中。用于转录mRNA的质粒模板应包含目标基因所需的全长CDS（编码序列），该序列克隆于T7、Sp6或T3聚合酶启动子的下游，并位于多聚腺苷酸化（polyA）信号序列的上游。若该质粒不可用，则首先需通过将斑马鱼或人类的目标CDS克隆至合适的载体中来构建该质粒。10 并通过SANGER测序进行验证。对于克隆步骤，需额外预留时间（包括克隆、菌落筛选以及正确克隆的分离与扩增，平均约需1周）。- 使用合适的限制性内切酶在多聚腺苷酸化信号（polyA信号）下游仅切割一次，将质粒线性化 KpnI). 为实现高效的质粒线性化，混合 3 γ (µg/µL质粒DNA的量 2 µL 限制性内切酶（20,000 单位/毫升） 10 µL 10倍反应缓冲液，最终体积为 100 µL 在无核酸酶的 水。用移液器反复吹打充分混匀各组分，并将反应混合物于指定温度孵育 37 °C 2-4 小时。
- 通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测线性化结果。
- 将10倍浓度的TBE贮存液（含48.5 g Tris、11.4 mL冰醋酸、20 mL 0.5 M EDTA [pH 8.0]）用无核酸酶水稀释。
- 将1.5 g琼脂糖加入终体积为100 mL的1×TBE溶液中，微波加热溶解，制备琼脂糖凝胶。然后，加入 3.5 µL 染料凝胶染色
- 根据实验条件/质粒的数量，将琼脂糖溶液倒入适当大小的制胶模具中制备凝胶。插入梳子，室温静置约1小时，待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子，将凝固好的凝胶置于合适的电泳槽中。
- 混合少量 µL 的消化质粒（"切割"）和 1.5 µL 6×上样缓冲液（含有用于监测电泳进程的染料），定容至最终体积 10 µL 无核酸酶水。同时以相同方法制备一份未消化质粒的独立对照样品（"未剪切"将样品加入琼脂糖凝胶的加样孔中，并在第一孔加入1 Kb DNA Marker。在100 V电压下进行DNA电泳30分钟。
- 在标准紫外透射仪上观察并记录电泳产生的DNA条带。通过比较DNA条带的图谱，检查质粒线性化的效率。 "切割" 以及 "未切割"
注意：线性化充分的质粒应以一条清晰的单一条带快速迁移。务必确保DNA切割完全，因为转录反应的起始是一个关键的限速步骤，若存在环状质粒形式会阻碍该过程，导致mRNA产量低下。
- 使用市售的基于离心柱的DNA纯化试剂盒纯化线性化质粒，并将纯化的DNA样品储存在-20 °C 直至需要时。
注意：除了线性化外，也可使用包含位于终止密码子上游的聚合酶启动子序列和下游的polyA信号序列的PCR产物作为mRNA转录的模板。PCR产物在进行后续操作前应经过纯化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
- 体外 mRNA转录、纯化及质量控制（第2-3天）图1A)
注意：使用RNase去污染溶液仔细清洁工作区域和移液器。使用无核酸酶的耗材和试剂；佩戴手套。这将最大限度地减少RNase污染，从而获得更高产量的全长mRNA。
使用标准的体外 mRNA 转录试剂盒，按照制造商说明书，从线性化质粒中转录编码野生型和突变型蛋白的带帽且带多聚腺苷酸尾的 mRNA。- 将纯化的线性化质粒在17,949 × g下离心数秒 × g 以确保杂质沉积在管底，不会被转移至转录反应中。
- 除 NTP 和 CAP 类似物的混合物需保持在冰上外，其余组分均在室温（RT）下解冻。将聚合酶置于 -20 °C 直至使用。
- 将所有试剂在17,949 × g下短暂离心 × g 使用前为防止试剂损失或意外污染，应短暂涡旋10x反应缓冲液和即用型NTP/CAP类似物混合物，直至完全溶解。将10x反应缓冲液置于室温保存。
- 在室温下，将600–800 ng线性化并纯化的质粒加入到含有以下成分的溶液中，以制备转录反应： 10 µL 2x NTP/CAP类似物混合物 2 µL 10x 反应缓冲液 2 µL SP6、T7 或 T3 酶（根据质粒中 CDS 上游的特定启动子而定）于终体积 20 µL 用无核酸酶水配制，通过反复吹打数次充分混匀。
- 将转录反应在 37 °C 在热循环仪中进行。确保同时将盖子温度设置为 37 °C 并反应2小时。
- 为了去除在反应过程中未转录的残余质粒，加入 1 µL 标准DNA酶溶液（2单位/µL). 用移液器反复吹打数次以充分混匀反应液，并在指定条件下孵育 37 °C 再继续孵育30分钟。
- 在继续之前，检查质量和完整性 体外 通过 TBE/甲酰胺琼脂糖电泳合成 mRNA。将 1.0 g 琼脂糖溶解于 50 mL 1x TBE 溶液中，加入 5.5 mL 37% 甲酰胺并 3.5 µL 染料凝胶染色，混合并按上述方法制胶。
警告：操作甲酰胺时，应穿戴个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中进行。 - 混合 1 µL 转录的mRNA的 2.5 µL 在无核酸酶水中加入2x甲酰胺染料上样缓冲液，总体积为 5 µL用移液器反复吹打充分混匀各组分，将样品加入凝胶的加样孔中。在预冷的1×TBE缓冲液中以100 mV电压电泳10–15分钟。同时加入1 kb DNA和/或RNA Ladder。
- 可选：将ladder和mRNA变性 70 °C 10分钟
- 在标准紫外透射仪上观察并记录产生的 mRNA 条带。
注意：长时间运行和高温会增加 RNA 降解的可能性。 - 如果合成的加帽RNA完整且大小合适，则通过向反应体系中添加以下成分，对C末端进行加尾反应： 36 µL 无核酸酶水 20 µL 5× 变性上样缓冲液 10 µL 25 mM MnCl2, 10 µL 10 mM ATP 4 µL 多聚腺苷酸化酶（如纯化的 E. 大肠杆菌 多聚(A)聚合酶）。用移液器吹打数次以充分混匀反应体系，并孵育 100 µL 最终反应的 37 °C 再孵育1小时。
注意：不建议在polyA反应后通过凝胶电泳检测RNA质量，因为由于polyA尾的存在，RNA会出现拖尾现象。 - 使用适当的盐（如LiCl）沉淀并回收合成的加帽和polyA尾mRNA。简要而言，将无核酸酶水与标准2.5 M LiCl溶液等体积混合（30 µL）并孵育 >30 min at -20 °C.
注意：2 小时后可实现有效沉淀，但通常过夜孵育可提高 mRNA 的最终得率。 - 为沉淀纯化的 mRNA，将反应物在 30 分钟内离心 4 °C 在17,949处 × g 并去除上清液。随后，用约1 mL的70%乙醇（EtOH）洗涤沉淀，于4 °C下以12,000 × g离心15分钟 4 °C 在17,949处 × g 以去除反应中的污染物和残留核苷酸。
- 离心后将沉淀空气干燥，然后重新悬浮于 20 µL 加入无核酸酶水。在室温下轻轻反复吹打使RNA充分溶解，并孵育10分钟。
注意：每5分钟检查一次沉淀，以确保乙醇完全蒸发。重悬时，由于RNA具有黏性，需用移液器反复吹打，直至其在水中充分溶解。 - 通过分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光度（260/280比值），评估所制备mRNA的浓度和纯度。对RNA样品进行不同梯度的稀释，以确保准确测定其浓度。
注意：通常，合成的 RNA 浓度范围为 1 至 2 µg/mL但最终产量可能因CDS长度和起始材料的量而有所不同。 - 在评估质量时，将 mRNA 原液置于冰上保存，然后将其分装成等份 5 µL 分装并储存在 -80 °C 直至需要注射时使用。
- 标准溶液和胚胎注射及药物处理所需材料的准备（第2-3天） 图1B)
- 使用无菌毛细管（标准毛细管尺寸：外径1.0 mm × 内径0.58 mm × 长度100 mm）制备斑马鱼胚胎显微注射针。采用市售的拉针仪，根据所需的输出电压、拉制模式（一步法或两步法）和拉力，调节参数以获得不同尖端长度、直径和针形。有关斑马鱼实验中常用针头特性的参考，参见Abdelrahman及其同事的研究。11.
注意：由于环境条件（如湿度或室温）可能影响拉针结果，不同实验室的最优设置可能存在差异。应定期重新测试并校准参数。拉制好的针头可于室温下保存在洁净容器中数月。 - 准备 30x "Danieau" pH 7.6 的贮存液：溶解 101.7 g NaCl、1.56 g KCl、2.96 g MgSO₄4 x 7H2O，4.25 g Ca(NO3)2, 和 35.75 g HEPES 溶于 1 L 双蒸水（DD 水）中以制备显微注射溶液。另用双蒸水配制 5% 酚红储存液，作为注射混合物的可见示踪剂。
- 通过将 4 mL NaCl (5 M) 稀释，配制用于胚胎生长的 E3 培养基溶液 680 µL KCl（1 M）1.32 mL，CaCl2 × 2H2O (1 M) 和 1.32 mL MgSO₄4 (1 M) 溶于 4 L 反渗透水中。
- 根据产品说明书和溶解度，配制所需药物的储备液（本示例中：MEK抑制剂[MEKi] PD032590），如将5 mg药物溶于1.036 mL DMSO中，配制成10 mM的MEKi储备液。充分混匀后，分装成小份，于-20 °C保存。80 °C 直至使用。
注意：DMSO 是一种常用溶剂，可溶解极性和非极性化合物，且在多种有机溶剂及水中均具有良好的溶解性。 - 通过让活体丰年虾悬浮液静置一段时间来制备活体丰年虾悬浮液 卤虫 囊肿在孵化液（2 g/L）中孵化 卤虫（Artemia salina） 在反渗透水中预先溶解的30 g/L海盐中培养，温度为28-30 °C 至少 18 小时，提供持续通气。
注意：培养条件和孵化时间可能受实验设施环境条件及 cysts 批次的影响，应定期重新测试并在必要时调整。
- 使用无菌毛细管（标准毛细管尺寸：外径1.0 mm × 内径0.58 mm × 长度100 mm）制备斑马鱼胚胎显微注射针。采用市售的拉针仪，根据所需的输出电压、拉制模式（一步法或两步法）和拉力，调节参数以获得不同尖端长度、直径和针形。有关斑马鱼实验中常用针头特性的参考，参见Abdelrahman及其同事的研究。11.
- 准备用于繁殖的配对 Tg[ef1α:ERK 生物传感器-nes] (Teen) 斑马鱼（第3天）
- 交配当天，按照批准的动物饲养设施规程定期喂食成年鱼对。
- 用两个不同滤网孔径的滤筛通过两步过滤法去除未孵化或空的卵囊，从而清洁含有已孵化卤虫的培养液（过滤步骤 I： 180 µm，过滤步骤 II： 112 µm).
- 用 200 mL 反渗透水收集并清洗过滤后的卤虫，用于喂养 10–15 条成年鱼，每条鱼约 5–10 mL 卤虫 溶液
注意：检查孵化的卤虫溶液的质量，观察其活力、运动能力、大小和颜色，并务必去除未孵化或空的囊壳，这些囊壳对鱼类难以消化，可能对其胃肠道造成伤害。对于繁殖配对的鱼类，建议在将配对隔离至繁殖缸前至少3小时提供当天最后一餐，以确保食物充分消化并维持较高的水质水平。
- 选择在之前至少2周内未进行过交配配对的鱼对，以尽量减少应激并促进配子发育。 使选定的成年鱼适应环境 青少年 鱼对（通常为此组成：1 ♂: 2 ♀) 放入合适的繁殖缸中。使用隔板将雌鱼和雄鱼分隔开，直至次日早晨。确保14小时光照/10小时黑暗的标准光周期。
注意：也可安排群体交配。然而，此种情况下，产卵可能在不同时间发生，因而从混合的卵块中挑选相同发育阶段的胚胎会更加困难。由暗至光的转变对于成功交配至关重要。
- 交配当天，按照批准的动物饲养设施规程定期喂食成年鱼对。
- 野生型和突变型 mRNA 的胚胎收集与显微注射（第 4 天）
- 一旦实验室内灯光开启，立即移除分隔雌雄鱼的水箱隔板，并根据需要，用循环水生系统中的新鲜水更换约20%的水箱水体，以维持较高的水质，同时避免过度稀释鱼类释放的激素。
- 让鱼保持不受干扰，并定期检查产卵情况（通常在光照开始后的前30分钟至1小时内）。鱼卵（2–3 mm）产出后会穿过网格沉入缸底，从而防止成鱼吞食。将成功交配的成鱼隔离，并用标准滤网（如茶滤网）过滤含有鱼卵的缸水，以收集鱼卵。
注意：可以将同一条鱼放回繁殖缸中进行下一轮交配，或将其返回原始饲养缸，并记录交配配对、日期及繁殖表现。 - 用新鲜的E3培养基洗涤收集的胚胎，并使用巴斯德吸管去除未受精卵、退化的卵、粪便及其他来自配对鱼的杂质。
注意：收集约 n = 100 个受精 青少年 将卵置于直径为90 mm的培养皿中，以避免胚胎过度拥挤。 - 排列并校准受精卵 青少年 在定制的显微注射板中放置卵子，该注射板通过将2%琼脂糖在E3培养基中 molding 形成适当的通道，以在显微注射过程中容纳并固定卵子。
注：可使用定制或商用模具。 - 制备新鲜的显微注射混合液以生成突变胚胎，方法如下：将30–60 pg带帽且带多聚腺苷酸尾的mRNA（此处为shp2）溶解于0.3x Danieau溶液（由原液稀释而成）中，终体积为 20 µL添加 0.2 µL (0.05%) 酚红储备液作为显微注射示踪剂。
- 用移液器将针头重新装填 2 µL 使用微量移液器将注射材料注入单细胞期胚胎。 青少年 使用市售的压力显微注射装置对斑马鱼胚胎进行显微注射，通过手动调节压力和时间参数，根据针头和胚胎的质量校准每次注射。可参考文献中已有的标准斑马鱼显微注射方案11,12.
- 显微注射后培养 青少年 在受控的饲养条件下（温度： 28 °C，湿度：70%，光/暗循环：14/10 小时）以确保最佳发育，并在产卵后接下来的3小时内清除任何浑浊或退化的卵。
- 在受精后约 4 小时（hpf），使用配备适当光源和滤光片设置（465–500 nm）的标准荧光体视显微镜，对胚胎进行荧光（报告基因表达）筛选。使用 青少年用于FRET成像的阳性鱼和用于免疫组织化学（IHC）评估的阴性同胞（见下文）。
注意：鉴于基于 Tol2 的转基因表达存在已知的变异性13，胚胎可能表现出不同程度的 青少年 荧光。建议检查未注射的同胞胚胎，以控制同一批次内个体间的荧光差异；鉴于FRET成像的动态范围较低，应剔除基础荧光水平极低的胚胎。
- 使用 MEK 抑制剂处理斑马鱼胚胎（第 4 天）
- 通过稀释制备 MEKi PD0325901 的中间溶液（1 mM） 1 µL 10 mM 储存液 9 µL 使用E3培养基配制中间溶液，再用该中间溶液配制最终的低剂量溶液。准备低剂量（0.25 µMPD0325901（MEK抑制剂）在总体积为3 mL中的处理 0.75 µL 1 mM 中间溶液的 2.25 µL E3 培养基的稀释 0.75 µL 将10% DMSO与2.25 mL E3培养基混合，制备对照（Ctrl）溶液。
- 将数量相等的胚胎分组放入6孔板的不同孔中，并通过浸泡开始处理：对每个孔，将E3培养基更换为含有对照溶剂（0.0025% DMSO）或所需浓度稀释药物的E3培养基0.25 µM，0.0025% DMSO），如前所述。每孔使用 3 mL 药物溶液。
注意：为了消除因载体（DMSO）浓度不同所引起的各种影响，必须确保对照组和处理组溶液中的DMSO终浓度相同。 - 将处理后的胚胎置于 28 °C 在收集样本之前，需培养至后续实验所需的发育阶段 （此处：形态计量学分析和免疫组化验证）
2. 原肠胚期 RASopathy 斑马鱼模型的活体多光谱FRET成像及数据分析
- 用于活体成像的原肠胚固定（第4天）图2A)
- 通过将1.5 g低熔点琼脂糖（LMA）溶解于1x PBS中，制备适用于活体胚胎的封片介质，配制成1.5% LMA/E3溶液。
注意：根据发育阶段和限制鱼类活动的具体需求，选择0.8%至1.5%的琼脂糖浓度。将新配制的低熔点琼脂糖（LMA）溶液分装成所需规格的 aliquot，并以聚合状态在室温下储存（可稳定数月）。此方法可最大限度减少细菌和真菌污染，但在使用前应定期检查LMA aliquot的质量。 - 在样品固定之前，将1.5% LMA分装样品置于恒温混匀仪或无菌水浴中融化 50 °C溶解后，将恒温混匀仪的温度降至约 30 °C.
- 放置单个已注射的 青少年+ 胚胎（此处为表达 Shp2D61G 的囊胚）D61G将胚胎置于直径为35 mm的玻璃底培养皿中央，用于活体成像，并使用细毛发调整其方向。吸除多余的E3培养基，随后在胚胎上方滴加一滴低熔点琼脂糖（LMA），于室温下使其聚合以固定胚胎。
注意：在聚合过程开始时，可将鱼体调整至所需位置。强烈建议使用LMA的温度不超过 35 °C 以避免组织损伤。
- 通过将1.5 g低熔点琼脂糖（LMA）溶解于1x PBS中，制备适用于活体胚胎的封片介质，配制成1.5% LMA/E3溶液。
- 设置显微镜参数并进行囊胚期多光谱FRET成像（第4天）图2B)
注意：本方案适用于配备有执行FRET成像所需全部硬件和软件的任何共聚焦显微镜平台。本文中使用的共聚焦显微镜配备有波长线为458-476-488-496-514 nm的氩离子激光器、可分离激发光和发射光的可编程声光分光器（AOBS）、两个光谱型混合探测器（HyD）以及用于维持稳定温度条件（在 28 °C）以及样品活体成像过程中的湿度。
如Fasano等人所示，所述的活体多光谱FRET成像方案可应用于早期原肠胚以外的不同发育阶段的胚胎。7对于较晚的发育阶段（例如24 hpf），应考虑采用更大的z轴堆栈，以及设置适当的z轴和时间间隔，以在光谱FRET图像采集过程中允许多光谱检测步骤的进行。- 至少在开始采集前1小时打开培养箱控制器，并将温度设置为 28 °C 以保持斑马鱼胚胎处于健康状态。待培养箱温度稳定后，将含有胚胎的成像培养皿置于样品台上，使用10倍干镜（数值孔径0.4）快速观察样品。
- 在 激光配置 参考软件的相应设置中，打开氩离子激光器，并使用滑块调节 激光功率 至 50%. 在 硬件设置，选择 8位深度分辨率 图像采集的时间点。
- 选择 光谱检测 XYλZ 扫描模式 在 采集面板 并设置以下采集参数： 图像格式：512 x 512 像素；扫描速度 的 400 Hz; 光学变焦 的 0.75.
- 激活 458 nm 激光线 的 氩离子激光器 并设置其 强度 值，通常 <10%（此处 8.5%).
- 选择一个 HyD检测器 并调整检测器的灵敏度（获得）通过输入所需数值（此处 500).
注意：对于活体、弱荧光样品，为减少背景噪声的积累，建议使用混合探测器而非光电倍增管（PMTs）。
在所引用的软件中，显示染料的发射光谱需要激活检测器。 - 首先，启动第一个探测器（HyD）并选择 青色荧光蛋白（CFP） 以显示其发射曲线。打开下拉菜单 检测器 软件工具栏中的选择列表以打开 CFP 发射光谱现在，激活第二个检测器以显示第二种染料的发射光谱曲线 黄色荧光蛋白（YFP）. 以同时显示 Ypet 发射曲线，激活第二个检测器，然后选择 YFP 发射光谱曲线 在关闭第二个检测器后，将出现在光谱图像中。
注意：此步骤完成后，应关闭第二个检测器，因为在光谱采集模式下仅使用一个检测器。 - 开始活体成像采集时，将检测光标定位至信号发射最强的波长范围（本例中为YFP的发射波长），以观察样本，并在z-stack LAS X窗口中确定并设置样本厚度的起始与终止位置。
- 对于 λ-扫描范围属性，设置以下参数： 开始（460 nm） 和 结束（570 nm） 检测范围的 检测带宽：5 nm； λ-扫描步长：5 nm开始进行Z轴层扫采集。
注意：所列参数可使用户以可接受的分辨率实现相对较快的成像，但也可采用其他设置。在 荧光增强圆盘设置，可取消自动插入的NOTCH滤波器，以避免单一强度损失。 - 为评估 MEKi 暴露后实时信号变化，将单个突变体胚胎（此处为 Shp2D61G) 置于玻璃培养皿中，在药物处理前后进行成像。对于此类活体实验，可在成像过程中通过浸泡法直接施加药物处理，所用含溶解药物的溶液体积最多不超过2 mL。
- 图像后期处理与多光谱染料分离以获得比率型FRET图像（第5天）图2C)
- 为分离供体（CFP）和受体（Ypet）的发射信号，务必消除两种分子荧光发射对FRET通道的贡献，该贡献称为 光谱渗漏（SBT）.
- 参考公开可用的染料/荧光蛋白数据库，以显示并下载与标准CFP发射光谱（激发和发射光谱）相关的.cvs文件。
- 在 数据面板 .cvs 文件的，选择 文本转列 选择该选项，并使用逗号作为分隔符将数据拆分为列。生成的文件将包含额外信息（例如，CFP 激发、CFP 2P），应予以删除。仅保留与波长和发射相关的列数据。
- 在CFP发射列中，删除501 nm及之后的所有强度数据。
- 将调整后的CFP发射光谱文件（460至500 nm）以.xls格式保存（命名为 "经修饰的eCFP" 在 图 2C).
- 对YFP蛋白发射光谱重复相同的步骤进行下载和处理，仅保留与波长和发射相关的列数据。删除524 nm以下的所有发射值。将调整后的YFP发射光谱文件（525至650 nm范围）保存为.xls格式（命名为 "525 nm 的 Ypet 信号" 在 图2C).
- 为了排除可用染料数据库中的光谱渗漏（SBT） 配置 在软件窗口中，插入并保存针对CFP和YFP的两条经调整的参考发射光谱。
- 从成像会话中选择生成的光谱图像文件并打开 流程 窗口，并选择 光谱染料分离 在 染料分离工具配置染料分离设置如下：在对话框左侧的下拉列表中，第一个位置选择新的CFP发射光谱（eCFP修饰型），并从光谱数据库中选择新的YFP发射光谱（Ypet，525 nm起）。
- 在……之下 重缩放，选择 逐通道 对各通道进行单独缩放，然后在 λ扫描 选择信号强度最大的图像（对应于光谱扫描的第14步，在FRET通道发射峰水平处，该位置由右侧检测步骤图示中的白色箭头指示） 图2B然后，沿样本的Z轴扫描，选择能清晰显示边缘区域感兴趣区的光学切片。
- 使用 ROI 选择模式 在动物极的边缘区点击，以确定光谱最佳的区域。 ROICrosshair 在显示窗口顶部指示的位置调用十字准线，并通过输入值来调整参考感兴趣区域（ROI）的大小 40 体素 在 测量区域. 通过精确界定感兴趣区域 ROICrosshair在图像示意图中选择 数据归一化，然后单击 应用 使用已配置的参数执行染料分离。
- 打开通过两个通道分离获得的此新生成文件，并从三维图像序列生成二维投影图像（最大强度投影），用于数据可视化。
- 在 流程 窗口，选择 裁剪 将通道分离为两个独立的文件，即 CH1 和 CH2（或 FRET）通道。
- 在 流程 窗口，选择 合并图像，选择 CH2 文件 并将其插入到 第一个选项，然后选择 CH1 文件 并将其插入到 第二个选项. 设置一个 重缩放 与 因子 5 并选择 比值运算。然后，单击 应用 生成包含比值图像（YFP/CFP）的新文件，并保存该文件以供后续数据分析。
- 为分离供体（CFP）和受体（Ypet）的发射信号，务必消除两种分子荧光发射对FRET通道的贡献，该贡献称为 光谱渗漏（SBT）.
- FRET信号的定量分析与图像呈现（第5-6天）图2D)
- 为对FRET/CFP比率图像中的FRET信号进行定量测量，应在N个样本上开展实验>2 个胚胎（重复），取决于一个 先验地 基于预期效应的统计学评估。使用图像处理软件包，例如开源软件 Fiji. 将从光谱成像和染料分离获得的图像文件导入开源的图像分析软件包 Fiji
- 在开始对原肠胚图像进行感兴趣区域（ROI）选择之前，先通过使用以下参数将其设置为读出测量值 分析 功能 | 设置测量 | 选择感兴趣的参数，例如 面积、积分密度和平均灰度值.
- 选择 感兴趣区域 （在本项研究中：该） 原肠胚边缘) 使用 多边形选择工具 从工具栏中保存 感兴趣区域 x,y 规格参数 通过点击 分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器.
- 要对选定的感兴趣区域（ROI）进行测量，请单击 分析 | 测量对每个 ROI 以及每张图像/条件重复上述步骤。
注意：如有需要，可将图像保存为 .TIFF 格式。可将来自多幅图像的所有感兴趣区域（ROI）测量结果保存为一个 ROI 文件。在 ROI 管理器列表中，使用与每个样本/图像相对应的正确名称重命名每项测量。 - 对于每种条件（此处为突变体及突变体加处理组），提取每个选定感兴趣区域（ROI）获得的FRET/CFP比值的所有数值，并将这些数值整理到工作表中，例如将实验分组设为列，每个原始数值设为行。
- 使用任何合适的软件评估不同实验条件下FRET信号的统计学差异，并用于图表生成和数据可视化。
注意：可用于数据分析和绘图的开源软件及授权软件均有提供。 - 为统计评估设计一个特定项目，需考虑所有原始测量数据及每种实验条件下重复实验的次数。对于单个生物学重复的统计分析，创建一个列联表，设置一个分组变量，每个组由一列定义；对于多个生物学重复的统计分析，创建一个分组表，至少包含两个分组变量，一个由列定义（如实验条件），另一个由行定义（如重复实验的均值）。
- 在工作表中合理安排实验分组后，评估数据分布（正态性检验，例如 D'Agostino-Pearson、Anderson-Darling），并根据结果选择最合适的统计学检验方法。
- 对符合正态分布的参数数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），对非参数数据进行Kruskal-Wallis检验。若存在多个因素（如基因型和药物浓度），则采用双因素方差分析（Two-Way ANOVA）。对每种条件下的平均FRET值进行两两比较（多重比较），并使用多重比较校正方法对结果进行校正 事后 检验（例如，针对参数数据的Tukey检验和针对非参数数据的Dunn检验）。
3. FRET 结果的免疫组织化学验证及原肠胚形成缺陷的相关形态计量学分析
- 用于针对 tERK 和 pERK 进行免疫组化（IHC）的溶液制备、胚胎固定 和封片 （第7天）（图3A）
- 准备免疫组化所需的使用液。
- 通过将80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na2HPO4 和 2.4 g KH2PO4 溶解于1 L去离子水中，配制10x PBS储存液。将溶液高压灭菌以保持无菌状态。
- 通过将8 mL 10% Triton X-100 加入最终体积为100 mL的1x PBS中，配制0.8% PBS-Triton（PBSTr）溶液。
- 通过分别将3 mL、7.5 mL和12 mL的100%甘油稀释至最终体积为15 mL的1x PBS中，配制20%、50%和80%甘油溶液。
- 通过将2.5 mL 16%多聚甲醛（PFA）与先前溶解于最终体积为10 mL的1x PBS中的250 µL 10% Triton X-100混合，配制含4% PFA/0.25% PBSTr的固定液。使用该溶液在4 °C下过夜固定6 hpf的胚胎。使用2 mL离心管，每管最多放置五个胚胎，以确保固定和洗涤效率。
注意：建议每次固定时新鲜配制固定液。警告：操作16%甲醛时，应在化学通风橱内佩戴个人防护装备（PPE）。 - 在2 mL离心管中用1.5 mL 0.8% PBSTr多次洗涤胚胎。将胚胎转移至新的2 mL离心管中，并在1x PBS中保存至使用。
注意：若不熟悉早期斑马鱼胚胎的操作，建议在体视显微镜下操作，以避免移液过程中胚胎丢失。使用“低吸附”塑料耗材，以减少胚胎粘附于管壁的可能性。
- 准备免疫组化所需的使用液。
- 组织通透化及针对 pERK 和 tERK 的免疫组化（第7–9天）
注意：免疫组化结果受多种变量影响，不同实验室之间可能存在差异，因此可能需要对方案进行特定优化。- 在室温下用1 mL 0.8% PBSTr对固定的斑马鱼胚胎洗涤3次，每次10分钟。
- 在0.8% PBSTr中加入2 µL蛋白酶K（稀释比例1:1,000），于室温处理2分钟，以实现样本通透化。
- 用1 mL 0.8% PBSTr洗涤样本3次，每次10分钟，终止通透化反应；随后在500 µL含4% PFA的1x PBS中于室温后固定20分钟。再用1 mL 0.8% PBSTr洗涤3次，每次10分钟。
注意：组织通透化的方法和时间是关键步骤，可能受抗原类型、组织保存质量及环境因素影响。在珍贵样本上应用前应先优化该步骤。 - 将样本与1x封闭缓冲液（BB）孵育，该缓冲液含5%正常山羊血清（NGS）、1%牛血清白蛋白（BSA）、1% DMSO，配制方法如下：在最终体积为1.5 mL的0.8% PBSTr中加入75 µL 100% NGS、150 µL 10% BSA和15 µL 100% DMSO。每管使用200 µL溶液，在室温下孵育胚胎20–30分钟。
- 移除上一步的1x BB，将样本置于含有目标一抗混合物的溶液中孵育（此处：将1 µL小鼠单克隆一抗p44/42 MAPK（总ERK，tERK）和1 µL兔多克隆一抗phospho-p44/42 MAPK（磷酸化ERK，pERK）加入250 µL新鲜配制的1x BB溶液中）。每管使用200 µL溶液，在20 °C下轻轻摇动过夜孵育。
- 为消除非特异性结合，用1 mL 0.8% PBSTr多次洗涤样本（首次每10分钟一次，之后每30分钟一次）。
- 在室温下用新鲜配制的1x BB孵育样本20分钟。每管使用200 µL。
- 移除上一步的1x BB，将样本与二抗混合物孵育（将1 µL荧光标记的488偶联山羊抗小鼠抗体和1 µL荧光标记的633偶联山羊抗兔抗体加入600 µL 1x BB溶液中）。在20 °C下轻轻摇动过夜孵育。
注意：我们在用于FRET成像的同一批次中选取了非转基因的Teen鱼作为阴性对照进行免疫组化。也可使用Teen+鱼，但此时应选用发射光谱不与CFP或YFP重叠的荧光染料标记的二抗。 - 按上述方法去除非特异性结合。
- 在室温下依次用20%、50%、80%甘油/1x PBS梯度溶液洗涤样本，每种溶液15分钟。将样本保存于90%甘油/1x PBS中，置于4 °C。
注意：为尽量减少荧光衰减，应将样本避光保存。
- 免疫染色组织的共聚焦显微镜观察与定量分析（第10–11天）（图3B–E）
- 按前述方法封片胚胎。
- 设置 共聚焦显微镜采集参数如下：白光激光器 设置为 80%，荧光发射 范围设置为 507–551 nm（用于检测荧光标记的山羊抗小鼠抗体，此处为488 nm发射光谱，用于检测tERK），644–740 nm（用于检测荧光标记的山羊抗兔抗体，此处为633 nm发射光谱，用于检测pERK）。选择逐帧扫描模式，扫描格式 为 512 × 512 像素，扫描速度 为 400 Hz。设定扫描的起始和终止位置，z轴步进厚度 为 4–5 µm，标准数字放大倍数 为 1。使用25倍水浸物镜（数值孔径 0.05）采集6 hpf时期的完整原肠胚图像。
警告：本方案涉及激光使用，可能对人体有害，因此操作人员需根据国家相关规定接受培训。 - 共聚焦图像采集后，使用如开源软件Fiji等图像处理软件检查原始图像文件。
- 在Fiji中，从图像 菜单下的颜色 子菜单中选择拆分通道命令，获得单通道图像（总ERK：通道 = 0，C = 0；pERK：通道 = 1，C = 1），然后点击图像 | 图像栈 | Z轴投影生成两个通道的最大强度投影图像。
- 重复前述 感兴趣区域（ROI）强度测量 步骤，并将数据 导出至工作表。
- 为推断实验组间目标ROI内p-ERK信号强度的变化，通过将p-ERK染色的原始积分密度值除以t-ERK信号的原始积分密度值，计算p-ERK/t-ERK比值。随后按步骤2.4进行统计学显著性评估。
注意：可根据具体需求调整成像参数设置，包括每个样本的采集时间、期望图像质量以及需采集的平面数量。
- 11 hpf胚胎的轴长测量（胚胎固定为第4天，数据采集与分析为第12天）（图4A–D）
- 在原肠胚形成结束时（11 hpf），用含4% PFA的1x PBS在室温下固定胚胎20分钟，用1x PBS多次洗涤后，于4 °C保存直至成像。
- 使用巴斯德吸管在含有新鲜1x PBS的12孔板单个孔中将胚胎侧向排列。
- 为评估是否存在椭圆形（胚胎Y/X轴比值 > 1）——这是斑马鱼RASopathies的典型表型，以及治疗效果导致的胚胎轴比形态学恢复情况，使用体视显微镜以3.4倍放大倍数（0.63倍扫描物镜 × 8.60 变焦系数）在明场模式下直接拍摄整个胚胎图像。
- 将图像文件导入如开源软件Fiji等图像分析软件。
- 从工具栏选择直线工具，点击分析 | 测量，测量胚胎的轴长（x，短轴；y，长轴）。完成选定测量后，将其添加至ROI管理器列表，并按上述FRET成像分析说明保存ROI文件。
注意：对每张胚胎图像重复这些步骤。
- 从工具栏选择直线工具，点击分析 | 测量，测量胚胎的轴长（x，短轴；y，长轴）。完成选定测量后，将其添加至ROI管理器列表，并按上述FRET成像分析说明保存ROI文件。
- 将数据导出至工作表，通过将长轴长度（y）除以短轴长度（x）计算轴比。计算不同重复样本的平均值、平均值的标准差或平均值的标准误。
- 按步骤2.4进行统计学数据分析。
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结果
本方案展示了一种简单的操作流程，可快速建立斑马鱼胚胎中的瞬时RAS病模型，并利用 recently established ERK斑马鱼传感器6,9，结合标准的活体FRET成像方法，检测早期突变体中ERK的动态变化。如近期研究所示6,7，在同一实验流程中，可通过针对磷酸化ERK和总ERK的标准免疫组化（IHC）在整体胚胎上对FRET结果进行交叉验证。在FRET检测所用的同一胚胎中，还可于后续发育阶段追踪体轴形成障碍与ERK激活增强之间的相关性7。本文展示了通过FRET记录到的早期原肠胚中典型的ERK波动，这些波动与导致努南综合征（NS）的Shp2D61G表达相关。此外，还收集了经低剂量MEK抑制剂（MEKi）处理后信号呈负向调控的突变体数据，该处理可抑制RAS/MAPK信号通路。
...
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讨论
尽管数十年的研究已发现大量突变，导致如今已明确多种高度异质性的RASopathies亚型，但在对尚未确诊的患者进行测序时，仍不断出现意义未明的遗传变异。实际上，在许多情况下，仅依靠临床特征进行诊断具有挑战性，因此仍需依赖功能基因组学方法来验证测序结果。此外，尽管已有部分抗癌药物（例如 MEK抑制剂）被提议用于治疗部分RASopathies，并且已出现一些成功的案例，但目前仍缺乏广泛共识。这主要是由于大多数现有药物缺乏充分的临床前证据支持，包括在儿童患者中使用强效抗癌药物时的有效剂量和治疗窗也尚不明确。
动物模型中的功能分析是疾病亚型分类、患者分层以及药物初步评估的重要步骤。斑马鱼可作为用于验证导致儿童疾病（包括RASopathies）的潜在致病性变异体功能的高效体内模型14。目前针对与RASopathy相关变异体影响的表型评估已有先进方法，适用于斑马鱼RASopathy模型，主要依赖形态学指标——即在原肠胚形成结束时测量胚胎体轴的"卵形测试"。然而，与ERK激活的相关性分析通常仍主要通过标准...
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致谢
我们感谢荷兰乌得勒支Hubrecht研究所的Jeroen den Hertog博士慷慨提供了pCS2+_eGFP-2a-Shp2a质粒，我们从中提取了shp2的全长CDS以构建所使用的质粒模板7。我们感谢奈良先端科学技术大学院大学（Takaaki Matsui）和日本国立遗传学研究所（NIG/ROIS）（Koichi Kawakami）提供了转基因Teen报告基因品系。本研究得到了意大利卫生部2021年和2024年常规研究基金以及青年研究人员定向研究基金GR-2019-12368907（AL）；2019年常规研究基金、PNRRMR1-2022-12376811、2019年5x1000项目、AIRC（IG-21614和IG-28768）以及LazioInnova（A0375-2020-36719）（MT）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 塑料器皿 | |||
| 1.7 L 繁殖缸 - 沙滩式设计 | Tecniplast | 1.7L SLOPED | 繁殖缸 |
| 毛细管 GC100F-10 | Harvard apparatus | 30-0019 | 单细胞期胚胎显微注射 |
| 细胞与组织培养板 - 12 孔 | BIOFIL | TCP011012 | 胚胎收集与处理 |
| 细胞与组织培养板 - 6 孔 | BIOFIL | TCP011006 | 胚胎收集与处理 |
| 细胞培养皿 | SPL Life Sciences | 20100 | 胚胎收集 |
| Nunc 玻璃培养皿 12 mm | Thermo Fisher | 150680 | 胚胎 FRET 光谱成像 |
| 巴斯德移液管 | Corning | 357524 | 胚胎转移 |
| 蛋白抗吸附管 2 ml | Eppendorf | 30108450 | 免疫组化检测 |
| 试剂及其他 | |||
| 鱼子粒径 500–800 µm | Rettenmaier Italia | BE2269 (500-800) | 干燥鱼类饲料 |
| 大盐湖蓝卤虫卵囊 | Sanders | 00004727 | 活体鱼类饲料 |
| Instant Ocean 海盐 | Tecniplast | XPSIO25R | 活体饲料制备用脱水海盐 |
| Tg(EF1a:ERK Biosensor-nes) (Teen) | 订购联系方式*： 日本国立生物资源计划斑马鱼项目，理化学研究所脑科学中心资源开发支援部门。https://shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html *需签署材料转让协议（MTA）。 | - | ERK 报告基因斑马鱼品系供应商。签署材料转让协议（MTA）后，可从日本斑马鱼国家生物资源计划（理化学研究所，日本）获取鱼胚胎。该斑马鱼品系由奈良先端科学技术大学院大学（松井贵明）和日本遗传学研究所（NIG/ROIS）（河上晃一，Tol2 系统专利）提供（Wong 等，2018；Urasaki 等，2006；Okamoto 与 Ishioka，2010）。 |
| 6x 上样缓冲液 | Cell Signaling | B7024S | 凝胶电泳 |
| 100 bp DNA 标准分子量标记 | NEB | N3231S | 凝胶电泳 |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | 1,01,236 | 凝胶电泳 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414-10G | FRET 光谱成像与免疫组化检测中的胚胎封片 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A8022 | 免疫组化检测 |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich | 223506 | E3 培养基组分 |
| 硝酸钙 | Sigma-Aldrich | 237124 | Danieau 储存液组分 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | 免疫组化检测 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| 乙醇 99%+ | Fisher Scientific | 10048291 | 体外 RNA 纯化 |
| 16% 甲醛 | Thermo Fisher | 28908 | 胚胎固定 |
| 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | F9037 | 凝胶电泳 |
| 凝胶上样缓冲液 II（变性 PAGE） | Thermo Fisher | AM8546G | 体外 RNA 转录 |
| 冰乙酸 | Sigma-Aldrich | 695092 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G6279-1L | 免疫组化检测 |
| 山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | 免疫组化检测 |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher | A21070 | 免疫组化检测 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Danieau 储存液组分 |
| KpnI - HF（酶 + rCutSmart 缓冲液） | NEB | R3142 | 质粒线性化 |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | 230391 | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 |
| Millennium RNA 标记物 | Thermo Fisher | AM7150 | 凝胶电泳 |
| Monarch 基因组 DNA 纯化试剂盒 | NEB | T3010L | 质粒线性化 |
| 小鼠单克隆 p44/42 MAPK 抗体 | Cell Signaling | 4696S | 免疫组化检测 |
| mMACHINE SP6 转录试剂盒 | Thermo Fisher | AM1340 | 体外 RNA 转录 |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma-Aldrich | G9023 | 免疫组化检测 |
| 无核酸酶水 Ambion | Thermo Fisher | AM9937 | 体外 RNA 转录 |
| PD0325901 | Sigma-Aldrich | PZ0162 | MEK 抑制剂 |
| 酚红溶液 | Sigma-Aldrich | P0290 | 显微注射混合液组分 |
| 多聚 A 尾添加试剂盒 | Thermo Fisher | AM1350 | 体外 RNA 转录 |
| 高纯度氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分 |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P0662 | PBS 储存液组分 |
| 蛋白酶 K | Sigma-Aldrich | P2308 | 免疫组化检测 |
| 兔多克隆磷酸化 p44/42 MAPK 抗体 | Cell Signaling | 4695S | 免疫组化检测 |
| SYBR safe DNA 凝胶染色剂 | Thermo Fisher | S33102 | 凝胶电泳 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 31434-M | E3 培养基组分 / Danieau 储存液组分 / PBS 储存液组分 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 71643 | PBS 储存液组分 |
| Trizma 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | 凝胶制备用 TBE 缓冲液组分 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | PBSTr 缓冲液组分 |
| 设备 | |||
| Alliance Mini HD9 | Uvitec | - | 成像系统 |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000205 | 微量离心机 |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | - | 胚胎封片 |
| FemtoJet 4x | Eppendorf | - | 显微注射系统 |
| Infinite M Plex | Tecan | - | 多功能酶标仪 |
| Leica M205FA | Leica Microsystems | - | 荧光体视显微镜 |
| Leica TCS-SP8X（配备 OkoLab 培养箱） | Leica Microsystems | - | 共聚焦显微镜 |
| Mini-sub Cell GT 水平电泳系统 | Bio-Rad | 1704406 | 凝胶电泳 |
| PC-100 垂直拉针仪 | Narishige | - | 玻璃微针拉制仪 |
| PowerPac Universal 电源供应器 | Bio-Rad | 1645070 | 凝胶电泳 |
| Stellaris 5 | Leica Microsystems | - | 共聚焦显微镜 |
| Vortex MiniStar silverline | VWR | - | 质粒制备 |
| 软件 | |||
| Biorender | Biorender | CC-BY 4.0 许可证 | 图示卡通绘制 |
| Excel | Microsoft Office Professional Plus 2019 | - | 数据分析 |
| Fiji 软件 | ImageJ | 15.3t | 图像处理与定量分析（FRET 信号测量、免疫组化检测中 ERK 荧光强度、胚胎轴长测量） |
| GraphPad Prism | GraphPad Software LLC | v. 9 | 统计学数据分析 |
| iControl 分光光度计软件 | Tecan | v. 2.0 | RNA 定量 |
| Illustrator | Adobe | 26.0.3 (64 位) | 图像整合 |
| LASX 软件 | Leica Microsystems | v. 4.5 (Stellaris 5), v. 3.0 (M205FA), v. 3.5 (TCS-SP8X) | 光谱 FRET 实验成像采集及用于轴长测量的胚胎成像 |
| Q9 Mini 18.02-SN 软件 | Uvitec | - | 凝胶图像采集 |
参考文献
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- Tartaglia, M., Aoki, Y., Gelb, B. D. The molecular genetics of RASopathies: An update on novel disease genes and new disorders. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 190 (4), 425-439 (2022).
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