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方法文章

大型动物临床前模型中的肾脏获取

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DOI：

10.3791/67835

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2025年5月2日

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于临床前猪模型中肾脏获取的手术方案，以进行后续的机械灌注或移植。

摘要

机械灌注已发展成为一种可行的策略 离体 器官评估、监测、治疗、优化以及延长保存时间。大型动物模型对于这些技术的开发与优化至关重要。然而，为了确保移植物质量和数据的可重复性，应遵循标准化且具有临床可转化性的器官与组织获取手术技术。因此，本文描述了一种在临床前猪模型中优化的肾脏获取方案。肾脏获取采用杂交品种（约克夏杂交/混合）猪进行。简要而言，在对手术区域进行无菌消毒和铺巾后，行完整的正中切口，以充分暴露双侧肾脏。游离输尿管、肾静脉和肾动脉，直至其分别起源于下腔静脉和腹主动脉处。完成全肾游离后，远端结扎并切断输尿管。随后，按每公斤体重100 IU剂量对供体动物全身肝素化。接着，使用Satinsky血管钳在靠近腹主动脉处夹闭肾动脉，在靠近下腔静脉处夹闭肾静脉。切除肾脏移植物后，立即在修肾台上对肾动脉进行插管。随后用冰冻保存液冲洗肾脏，并将其置于冰上保存，直至进行机械灌注或移植。最后，使用2-0丝线结扎肾动脉残端，采用6-0聚丙烯缝线关闭下腔静脉。该技术可用于获取肾脏，模拟活体（单肾）或死亡（双肾）供体环境。单肾获取的优势在于可进行后续自体移植。在死亡供体模型中，可在实施安乐死前将血袋针直接插入腹主动脉采集血液，从而放空动物全身血液并获取供体血样 离体 机械灌注

引言

肾移植是终末期肾病（ESRD）的最佳治疗方式，与透析相比，可显著改善患者的生活质量并提高长期预后1尽管器官保存技术已取得进展，但每天仍有数十名终末期肾病患者在等待肾移植期间死亡2机器灌注是一个不断发展的领域，可延长器官保存时间，从而扩大供体网络并提高器官分配效率。该技术还允许对器官进行 离体 器官监测与优化，从而最大限度地减少缺血-再灌注损伤（IRI）的影响。与静态冷保存（SCS）相比，机械灌注已被证明可显著降低移植肾功能延迟恢复的发生率3,4机器灌注还显示出可使边缘性移植物恢复活力，否则这些移植物将无法达到移植标准5. 尽管技术不断进步，目前最常用的保存方法仍是冷静态保存（SCS）并置于冰上。进一步的临床前实验和数据积累有助于使机器灌注成为肾脏保存的常规手段。

猪作为肾脏移植的模型已得到广泛认可，并在肾脏保存技术（尤其是机械灌注）的发展中发挥了关键作用。与单叶结构的啮齿类动物肾脏不同，猪和人类的肾脏均为多叶结构，大小相似，且具有类似的动脉、静脉和泌尿系统解剖结构6,7。因此，猪肾脏能够直接转化为临床应用，尤其在医疗器械和药物治疗方面具有高度可比性。此外，猪肾脏在缺血-再灌注损伤（IRI）方面的病理生理学特征与人类肾脏相似8，使其成为肾脏保存研究的理想模型。

为确保移植物质量和数据的可重复性，应遵循标准化且具有临床转化价值的器官与组织获取外科技术。因此，本文介绍了一种在临床前猪模型中优化的肾脏获取方案。该方案可实现肾脏的获取，并可模拟活体（单侧肾脏）或尸体（双侧肾脏）供体环境。单侧肾脏获取的优势在于可进行后续自体移植。在双侧肾脏获取模型中，可在实施安乐死后通过将血袋针直接插入主动脉采集血液，从而放空动物体内血液并获取可用于后续实验的血液样本。 离体 机械灌注

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方案

所有实验程序均经美国农业部（USDA）许可、实验动物福利办公室（OLAW）认证并经实验动物护理与使用评估认证协会（AAALAC）认证的约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理与使用委员会批准。动物的饲养和管理严格遵循美国农业部《动物福利法》、美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》以及美国公共卫生服务部《实验动物人道护理与使用政策》。

1. 动物与饲养

  1. 本方案使用3至6月龄、临床健康的约克夏猪（Sus scrofa domesticus），体重20-40 kg，或可比动物。
  2. 将动物饲养在带有格栅地板或其他符合物种需求的圈舍中的链式围栏内。

2. 术前准备与麻醉

  1. 在麻醉前至少 12 小时开始禁食动物。
  2. 在手术前至少 12 小时给予口服西咪替康（20 mg/kg），并在麻醉前至少 1 小时重复给药一次，以减少肠道扩张。
  3. 将氯胺酮（20–30 mg/kg）和赛拉嗪（2–3 mg/kg）混合于同一注射器中，通过肌内注射给药，以避免多次注射。
  4. 将猪转移至术前准备区，在耳缘静脉放置静脉导管。在整个手术过程中持续输注 0.9% 氯化钠溶液或乳酸林格液，剂量为 3–10 mL/kg/h。
  5. 当猪达到充分镇静状态后，插入气管插管（20–30 kg 动物使用 6.0–6.5 mm 带套囊气管插管；30–40 kg 使用 6.5–7.0 mm 带套囊插管），用于吸入麻醉和机械通气。如有需要，可静脉给予丙泊酚（0.8–1.66 mg/kg）辅助插管，按需给药至起效。
  6. 在将动物转移至手术室前，使用电动剪刀去除手术区域及其周围毛发，并对手术部位进行初步清洁擦洗。
  7. 将动物转移至手术台。在手术开始前 10 分钟静脉给予头孢唑林（20–22 mg/kg），之后每 90 分钟术中重复给药一次。在手术开始时静脉给予泮托拉唑（0.5–1 mg/kg）。
  8. 在切口前，于手术部位皮下注射利多卡因（最高剂量达 2 mg/kg）进行局部阻滞，以增强镇痛效果。
  9. 以无菌方式准备手术区域，交替使用氯己定或碘伏与 70% 乙醇或生理盐水，至少消毒三次。
  10. 持续监测液体输注量、心率、血压、脉搏血氧饱和度、二氧化碳波形图、心电图及直肠温度，每 10–15 分钟记录一次数值。使用加热垫和暖风毯以防止低体温。
  11. 在开始手术前，结合下颌张力、眼睑反射以及前述步骤中列出的各项参数，确认动物已处于适当的外科麻醉深度。

3. 肾脏摘取操作步骤

  1. 按照第2节所述步骤进行动物术前准备。
  2. 对手术区域进行无菌消毒并铺巾后，行正中腹切口（25–30 cm），以充分暴露双侧肾脏。插入标准腹腔牵开器。
  3. 用温盐水浸湿的纱布覆盖结肠和小肠，并将肠管向右侧牵开以暴露左肾，或向左侧牵开以暴露右肾。
  4. 切开肾脏表面的腹膜，游离肾脏周围组织以清除任何粘连。继续游离输尿管，直至获得10–12 cm长度。
  5. 游离肾静脉和肾动脉，分别至其起源于下腔静脉和腹主动脉的根部。
  6. 完成肾脏完全游离后，使用2-0丝线在远端结扎输尿管，并在其近端结扎处上方切断。保留近端输尿管开放，以利于尿液引流（在存活手术中，用纱布收集尿液）。
  7. 通过静脉注射肝素（100 IU/kg）进行肝素化，并等待2分钟，确保肾脏充分肝素化。每次切除肾脏前均应重复此步骤。
  8. 分别用两把Satinsky血管钳夹闭肾动脉和肾静脉靠近腹主动脉及下腔静脉的根部。在靠近血管钳处切断肾动脉和肾静脉，摘除肾脏移植物。
  9. 立即使用直径3 mm的钝头灌注导管插入肾动脉，用冰冻的威斯康星大学（UW）溶液或 Custodiol 组氨酸-色氨酸-酮戊二酸（HTK）器官保存液对肾脏进行灌洗。
  10. 灌洗完成后，取出灌注导管，将肾脏置于无菌器官保存袋中，袋内充满与灌洗时相同的冰冻保存液。再将此袋放入第二个无菌器官保存袋中。随后可储存器官或启动机械灌注。
  11. 使用2-0丝线结扎肾动脉残端。使用6-0聚丙烯缝线以两层连续缝合法闭合肾静脉残端。
  12. 对于存活实验动物，在关腹前应用无菌生理盐水冲洗腹腔。

4. 血液采集步骤

  1. 如果该操作为终末性操作，且所有其他外科干预均已完成后，可进行机器灌注用血液采集，并通过放血实施安乐死。
  2. 将肠管向右侧牵开，辨认肾下腹主动脉。分离覆盖血管的任何大块粘连或组织。
  3. 将采血袋针头直接插入主动脉，将血袋悬挂于动物下方以利于血液流入。当血袋充满后（约450 mL血液），拔出主动脉内的针头，并对穿刺部位施加压力止血。
  4. 如需采集第二袋血，将新针头插入前一穿刺点近端1-2 cm处。根据需要重复此步骤，每次进针位置较前一次向近端移动1-2 cm。
  5. 在完成所有必要血液采集后，静脉注射戊巴比妥钠/苯妥英钠，剂量至少为戊巴比妥成分78 mg/kg，以诱导心脏停搏。若担心戊巴比妥可能干扰后续肾脏检测，可在麻醉状态下的猪中使用氯化钾（KCl）（75–100 mg/kg，静脉注射）作为替代的化学安乐死方法。通过无心跳、角膜反射消失以及体温显著下降来确认动物死亡。
    注意：安乐死后猪的其余器官和组织可在符合3R原则的前提下，用于其他科研或教学用途。

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结果

我们的研究团队在猪的实体器官移植和血管化复合组织异体移植模型方面拥有近15年的广泛经验9,10,11,12,13,14,15,16,17。本文中，我们报告了猪肾脏获取实验的结果（n = 139）。我们已将获取的肾脏用于移植、机械灌注或原代细胞培养，迄今为止在该手术模型中未遇到任何并发症（图1）。我们将成功的肾脏获取定义为手术无技术性失败，且未出现与解剖结构或手术技术相关的不良结果。...

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讨论

猪肾移植模型对灌注技术的开发和优化至关重要。由于猪肾在解剖学、免疫学和病理生理学方面与人类肾脏具有高度相似性6,7,8，因此猪肾可更便捷地应用于临床试验与实践。

猪肾获取模型可用于多种临床前实验。在活体供体模型中，可获取并保存单个肾脏，随后进行自体移植并切除对侧肾脏18,19。在尸体供体模型中，可获取双侧肾脏，用于保存研究、机械灌注研究或同种异体移植。第4节中所述的采血操作对于使用含全血或血液制品灌注液的机械灌注研究至关重要，尤其适用于需要更换灌注液的延长机械灌注研究20,21,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨向约翰斯·霍普金斯大学医学院的众多兽医技术人员致以诚挚谢意，感谢他们提供的技术支持。我们还要感谢杰西卡·伊齐博士、阿曼达·麦克斯韦尔博士，以及包括马洛里·布朗博士、杰西卡·普伦卡德博士和亚历克西斯·罗奇博士在内的众多兽医住院医师，感谢他们为实验动物提供了出色的临床护理和兽医监督。最后，我们谨向约翰斯·霍普金斯医学院血管化复合组织异体移植（VCA）实验室的全体成员表示感谢，他们在本实验室开展的肾脏获取或其他器官获取操作中，以各种方式提供了协助。本研究工作得到了美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）R44DK136396 项目基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 乙醇溶液Fisher Scientific04-355-122
Adson 组织镊，4.75"，1 × 2 齿Wexler SurgicalFL0081.1
Bair Hugger 动物健康用全身保温毯3M53777
Bair Hugger 加温系统主机3M77500
Balfour 腹部拉钩（带固定侧叶片），4" 深，最大张开 10"MPM 医疗用品公司124-7017
聚维酮碘溶液（5%）MWI 动物健康公司NDC-67618-155-01
注射用头孢唑林钠，USPMWI 动物健康公司NDC-63323-237-10
氯己定溶液MWI 动物健康公司NDC-30798-624-31
Custodial HTK 器官保存液Essential Pharmaceuticals25767073545
DeBakey 组织镊，7.75"，2 mm 尖端Wexler SurgicalFL0789.1
EUTHASOL（戊巴比妥钠和苯妥英钠）VirbacNDC-051311-050-01
肝素钠注射液，USPMWI 动物健康公司NDC-71288-402-10
Hot Dog 温度管理控制器Augustine Surgical Inc.WC71V
Hot Dog 兽用体下加温垫Augustine Surgical Inc.V106
Invisishield 隔离袋，20" × 20"MedlineDYNJSD1003
Jacobson 微型持针器，直颚，圆柄，7.25"Wexler SurgicalNL0729.11
盐酸氯胺酮注射液NexGen PharmaceuticalsNC-0256
纱布垫，18" × 18"MedlineMDS231318LF
Metzenbaum 解剖剪，7" 弯头Wexler SurgicalSL5011.1S
非导电吸引管（带扇形接头），1/4" × 10'MedlineDYND50251
注射用泮托拉唑钠MWI 动物健康公司NDC-55150-202-00
灌注导管，自由流动式，3 mm 钝头MED Alliance SolutionsPER-3003S
刚性球头 Yankauer 吸引管MedlineDYND50130
Satinsky 血管钳，30 mm 角形 DeBakey 无创颚，弯柄，10"Wexler SurgicalAL2150.1
3 号手术刀柄World Precision Instruments500236
Servator B UW（威斯康星大学）保存液Global Transplant SolutionsJFISERB10A r2
单单位预充式 CPDA-1 采血袋，450 mLJorgensen LaboratoriesJO520
Sofsilk 缝线结扎线，2-0，黑色，18"CovidienS-195
10 号手术刀片World Precision Instruments500239
Surgipro II 缝线，6-0，蓝色，30"，双针，CV-22 针CovidienVP-733-X
四分之三手术铺巾MedlineDYNJP2414
Valleylab 电外科笔（带不锈钢电极）CovidienCVNE2516H
Valleylab Force FXc 电外科发生器CovidienMFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab Polyhesive 成人患者回路电极CovidienE7507-SD
盐酸赛拉嗪注射液NexGen PharmaceuticalsNC-0334

参考文献

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