本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）通过气管内滴注在病灶侧建立单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型，以定量分析通气区域的实验方案。
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方法文章
利用微型CT进行单侧肺容积分析以加强临床前模型中肺纤维化的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肺纤维化（PF）是一种进行性、不可逆的间质性肺部疾病，预后较差且治疗选择有限。传统的博来霉素气管内滴注诱导小鼠肺纤维化模型可能导致药物分布不均和高死亡率。经过优化的单侧气管内滴注博来霉素给药方法可在小鼠中建立更为均匀和可控的肺纤维化模型，更真实地模拟人类疾病的病理过程。本文介绍了一种利用微型计算机断层扫描（micro-CT）对经气管内滴注在病变侧诱导的单侧博来霉素肺纤维化模型中通气区域进行定量分析的实验方案。该方法可对总体肺容积及通气肺区域进行量化，从而灵敏、准确地评估疾病进展和治疗反应。本研究涉及麻醉、精确给药、micro-CT 扫描以及使用 3D Slicer 软件进行图像后处理分析。博来霉素处理后的单侧肺容积分析显示，与对照组相比，肺容积显著减少。Masson 三色染色证实了博来霉素处理小鼠肺组织中胶原蛋白的存在及其沉积量增加。本研究通过在临床前模型中应用 micro-CT 进行单侧肺容积分析来评估肺纤维化，为研究人员提供了评估 PF 研究中治疗干预效果的一种精确且全面的评价方法。
引言
肺纤维化（PF）是一种破坏性强且不可逆的肺部疾病，目前治疗方法有限。全球肺纤维化的发病率在每10万人中为1至13例，且随着年龄增长，患病率显著上升1。尽管过去几十年已付出大量努力，肺纤维化的治疗手段仍然有限，目前仅有两种抗纤维化药物——尼达尼布（nintedanib）和吡非尼酮（pirfenidone）被批准用于肺纤维化的治疗2。肺纤维化的潜在发病机制极为复杂，涉及分子和细胞生理学的多个方面3。目前，通过不同诱导剂建立的实验性体内动物模型，是研究其致病机制和疾病表型的重要工具。
通过气管内滴注给予博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，被广泛用于阐明潜在的细胞和分子机制，并用于识别可能的治疗靶点4。然而，气管内滴注博来霉素分布不对称且缺乏选择性，可能导致较高的死亡率，主要原因是纤维化不均和双侧肺损伤5,6。为解决这一问题，我们提出了一种单侧气管内给药方法，以确保实验试剂在左肺内均匀分布，更真实地模拟肺纤维化患者中观察到的病理过程7,8,....
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方案
所有动物实验均经广州医科大学动物护理与使用委员会批准。实验采用6至8周龄、体重25至30克的雄性C57BL/6小鼠。小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下（光照强度：25勒克斯），可自由获取食物和水，并被随机分配至对照组和博来霉素（BLM）组。
1. 单侧肺气管内滴注
- 使用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉6-8周龄、体重25-30 g的C57BL/6雄性小鼠。
- 通过观察呼吸频率和肢体回缩反射来监测麻醉深度。
- 将小鼠仰卧固定在倾斜70°-90°的塑料板上，用门齿和四肢进行固定。
- 使用无菌钝头镊子轻轻牵拉舌头。
- 使用小型动物喉镜观察会厌及口咽部结构，将定制的22 G钝头针插入气管。将塑料板逆时针旋转至-70°，使左主支气管与气管主轴平行。推进针头直至遇到阻力。
注意：应预先使用体型相似的小鼠进行练习，测量导管插入长度，以确保最佳插入深度。 - 迅速将角度旋转至30°，注入40 µL博来霉素溶液（0.02 mg），然后拔出针头。
- 保持小鼠体位至少30秒，以确保药物充分分布。
- 让小鼠俯卧于加热毯上恢复。
2. 微型计算机断层扫描（micro-CT）扫描
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结果
图10A-D 显示了肺容积变化和染色分析的结果。
为了评估博来霉素（BLM）对肺组织的影响，我们采用三维成像技术，对生理盐水处理组（Ctrl）与BLM处理组的肺体积进行了比较分析。与对照组相比，BLM组的左肺体积显著减小。左肺体积（mm3）的定量分析显示，BLM组明显降低（图10A，C）。
采用马松三色染色法评估肺组织中胶原沉积的程度，这是纤维化的特征性标志。定量结果显示，博来霉素（BLM）组马松阳性染色显著增加，表明该组分泌了大量细胞外基质，如胶原蛋白（图10B、D）。
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讨论
肺纤维化是一种破坏性疾病，其特征是肺组织进行性瘢痕化，导致肺功能下降，并最终引发呼吸衰竭1。通过不同药理学试剂和给药方法建立的肺纤维化小鼠模型，是研究疾病进展和评估潜在治疗药物疗效的重要工具，尤其是在博来霉素经气管滴注模型中应用广泛13。然而，博来霉素气管内滴注模型存在局限性，包括博来霉素在肺内分布不均，以及由于滴注过程缺乏选择性而导致的高死亡率风险。在本研究中，我们描述了一种单侧气管内给药方法。该方法相较于传统的双侧气管内给药具有两个明显优势。首先，该方法可实现选择性单侧给药，通常靶向小鼠左肺，而小鼠左肺仅包含一个肺叶。结合给予小鼠震荡操作，这一解剖学特点有助于提高药物分布的均一性。此外，单侧肺疾病模型使得对侧健康肺可作为内部对照，从而实现治疗肺与未治疗肺之间的比较分析。
显微计算机断层扫描（micro-CT）可提供可视化和定量的形态计量学数据，已被广泛应用于多种人类疾病动物模型中，用于监测疾病进展及候选药物的疗效14,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得国家自然科学基金（82300092）、呼吸疾病国家重点实验室自主研究项目（SKLRD-Z-202302）以及创新能力资助项目的资助。 广东省建设项目 研究机构（KD032024001）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | Hopebio | HBPP008-100 | |
| 22G 钝针 | BD | 383922 | |
| 3D Slicer 图像计算平台 | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | |
| 博来霉素 | MCE | HY-17565 | |
| 异氟烷 | RWD | R510-22 | |
| Masson 染色试剂盒 | Yeasen | 60532ES58 | |
| Micro-CT | Pinseng | SNC-100 | |
| Orbit | Orbit 图像分析 | https://www.orbit.bio/ | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | |
| 小动物喉镜 | 玉研仪器 | CG-02M | |
| SPSS | IBM | Version 19.0 | |
| 加热垫 | Lab Anim Tech | LAT-16-0323 |
参考文献
- Podolanczuk, A. J., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: state of the art for 2023. Eur Respir J. 61 (4), 2200957(2023).
- Raghu, G., Selman, M. Nintedanib and pirfenidone: new antifibrotic treatments ind....
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