方法文章

使用 micro-CT 进行单侧肺容量分析以增强临床前模型中肺纤维化的评估

DOI：

10.3791/67837

⸱

2025年6月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里，我们提出了一种方案，利用显微计算机断层扫描 （micro-CT） 通过在病灶侧气管内滴注来量化单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型中的通气区域。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺纤维化 （PF） 是一种进行性且不可逆的间质性肺病，其特征是预后不良和治疗选择有限。由博来霉素气管内滴注诱导的传统肺纤维化小鼠模型可导致药物分布不均匀和高死亡率。用于小鼠博来霉素给药的精细单侧气管内滴注方法可以创建更均匀和受控的肺纤维化模型，从而更好地模拟人类疾病。在这里，我们提出了一种方案，利用显微计算机断层扫描 （micro-CT） 通过在病灶侧进行气管内滴注来量化单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型中的通气区域。这种方法允许量化总肺体积和通气肺区域，提供对疾病进展和治疗反应的灵敏和准确的测量。本研究涉及麻醉、精确给药、显微 CT 扫描以及使用 3D Slicer 软件进行图像分析的后处理。博来霉素治疗后的单侧肺容积分析显示，与对照组相比，肺容积显着减少。Masson 的三色染色证实了 BLM 处理的小鼠中存在胶原蛋白并增加沉积。在此，我们通过使用显微 CT 进行单侧肺体积分析来评估临床前模型中的肺纤维化，为研究人员提供了一种精确和彻底的评估方法，用于评估 PF 研究中的治疗干预。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺纤维化 （PF） 是一种具有破坏性且不可逆的肺部疾病，治疗方法有限。PF 的全球发病率为每 100,000 人 1 至 13 人，随着年龄的增长，患病率显着增加1。尽管在过去几十年中做出了巨大努力，但 PF 的治疗前景仍然有限，目前只有两种抗纤维化药物尼达尼布和吡非尼酮被批准用于治疗 PF2。肺纤维化的潜在发病机制非常复杂，包括分子和细胞生理学的各个方面3。由各种药物诱导的实验 性体内 动物模型是目前研究致病机制和疾病表型的重要工具。

博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型通过气管内滴注给药，在阐明潜在的细胞和分子机制以及确定潜在治疗靶点方面得到广泛认可4。然而，气管内滴注的博来霉素的不对称和非选择性分布可导致高死亡率，这主要是由于不均匀的纤维化和双侧肺损伤 5,6。为了解决这个问题，我们提出了一种单侧气管内给药方法，以确保实验药物在左肺内均匀输送，并更好地模拟在 PF 患者中观察到的病理过程 7,8,9。此外，单侧给药技术还可用于评估需要局部分布的药物或针对特定肺的其他实验性干预。

在临床前模型中，显微计算机断层扫描 （micro-CT） 在研究肺部病理学方面变得越来越有价值，并已被证明是纵向研究的有力工具，能够提供定性和定量数据来监测疾病进展以及对治疗干预的反应10。Micro-CT 已用于评估总体积、通气和非通气区域、支气管形态和组织密度。基于我们以前的研究，我们开发了一种新的成像方法，其中使用 micro-CT 来分析单侧肺体积并评估肺纤维化小鼠模型中的纤维化水平 7,8,9。该方法允许量化充气的肺区域，提供更准确和灵敏的疾病进展和对治疗反应的测量。

本研究介绍了一种单侧通气肺容积分析方法，该方法源自博来霉素治疗小鼠的显微 CT 扫描。这种创新方法提供了对肺纤维化的更精确和全面的评估，可能会改变我们在临床前研究中评估治疗干预疗效的方式。本研究为临床前肺纤维化模型的分析做出了极好的改进，为评估治疗效果和疾病进展提供了强大的定量分析方法。

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方案

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所有动物实验均经广州医科大学动物护理与使用委员会批准。实验在 6-8 周龄、25-30 g 雄性 C57BL/6 小鼠身上进行。将小鼠饲养在 12 小时的光照/黑暗周期 （光照：25 lux） 下，随意获取食物和水，并随机分配到对照组和 BLM 组。

1. 单侧肺气管内滴注

  1. 通过腹膜内注射 1% 戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 麻醉 C57BL/6 雄性小鼠 （6-8 周龄，25-30 g）。
  2. 通过观察呼吸频率和肢体撤退反射来监测麻醉水平。
  3. 将鼠标仰卧固定在 70°-90° 倾斜的塑料板上，用门牙和四肢约束。
  4. 使用无菌钝头镊子轻轻缩回舌头。
  5. 使用小动物喉镜将定制的 22 G 钝针插入气管，以观察会厌和口咽结构。将板逆时针旋转至 -70°，使左主支气管与主支气管平行对齐。推进针头，直到感觉到阻力。
    注意：使用相似大小的练习鼠标预先测量导管长度，以确保最佳插入长度。
  6. 迅速旋转至 30° 角并注入 40 μL 博来霉素溶液 （0.02 mg）。取出针头。
  7. 将鼠标保持在原位至少 30 秒，以确保药物分布正确。
  8. 让鼠标俯卧在温暖的毯子上恢复。

2. 显微计算机断层扫描 （micro-CT） 扫描

注意：按照制造商的说明使用显微 CT 系统扫描小鼠。

  1. 博来霉素滴注后 3 周对小鼠进行显微 CT 扫描。
  2. 在小动物气体麻醉机的蒸发器中加入适量的异氟醚，打开蒸发器，将诱导浓度调至3%，将小鼠放入诱导箱中，直至失去人字拖反射，表现出缓慢的深呼吸。
  3. 从感应盒中取出小鼠，将它们仰卧在扫描台上，使小鼠的四肢伸展，身体沿中线对齐。
  4. 将扫描表中的异氟醚维持浓度设置为 1%。
  5. 设置 Micro-CT 扫描模式：横向视野 43 毫米，分辨率 2K x 2K，像素尺寸 0.042 毫米，切片厚度 0.042 毫米。
  6. 扫描后，将小鼠放在温暖的毯子上，直到它们醒来。

3. 显微 CT 后处理：单侧选择性肺分割和体积分析

注：按照制造商的说明，使用免费的开源软件 3D Slicer （http://www.slicer.org） 进行图像处理和定量分析。肺窗的临床 Hounsfield 单位 （胡） 范围用于标准化 胡 图像，将肺实质分割成正常充气区域 （[-1000， -350] 胡），如先前报道的 8,9,11。图像处理程序概述如下：

  1. 打开 3D 切片器。作界面如图 1 所示。
  2. 单击 Load 以 DICOM 格式导入成像数据。轴向、冠状和矢状图像将显示在主界面中（图 2）。
  3. 调整与矢状视图相关的参数，如图 3 所示（可选）。（1：显示隐藏的选项;2：选择 重命名当前卷;3：输入 新名称）。
  4. 在 “分段编辑器 ”模块中，单击 “添加 ”以创建用于选择性肺分析（右肺）的分段（图 4）（1：体积;2：分段编辑器;3：添加分段;4：设置阈值;5：调整阈值范围;6：用于遮罩;7：设置球形画笔）。
  5. 将阈值范围调整为 [-1000， -350] 胡 并启用 用于蒙版 选项。
  6. 将 Paint 工具与球形画笔结合使用，以分割所需的肺部区域。
  7. 选择 Island（孤岛 ）工具，然后选择 Keep Selected Island（保留所选孤岛）。突出显示右肺，然后单击 “显示 3D” 以在可视化面板中显示 3D 模型（图 5）（1：编辑孤岛（连接的组件）;2：选择“保留所选孤岛”;3：显示 3D 模型）。
  8. 在 Terminology （术语 ） 面板中，将 3D 模型的颜色更改为蓝色 （可选）。
  9. 对左肺重复步骤 3.4-3.6。逐层处理轴向胸部 CT 图像，以计算通气左肺容积并创建 3D 模型（图6）。
  10. 将 3D 左肺模型的颜色更改为黄色（可选）。
  11. 将右肺分割的不透明度设置为 0.2。
  12. 根据需要导出 3D 模型（图 7）。
  13. 捕获 3D 视图或切片图像的屏幕截图并保存它们（图 8）（1：注释屏幕截图;2：选择图像格式;3：修改保存路径）。
  14. 使用 节段统计 模块计算每个节段的肺体积 （mm3），并对正常充气区域进行定量分析（图 9）。

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图 1：3D Slicer 软件的界面。 该图显示了 3D Slicer 软件的主作界面。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-2
图 2：小鼠单侧气管内滴注诱导肺纤维化的 CT 图像。 轴向、冠状面和矢状面，以及博来霉素滴注后的 3D 肺重建。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-3
图 3：矢状视图参数调整。 该图说明了参数的调整，从而实现了精确的可视化和分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-4
图 4：分割编辑和参数调整。 该图演示了分段编辑的过程和相应的参数调整。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-5
图 5：右肺的 3D 分割。 该过程包括三个连续的步骤：编辑用于肺分割的连接组件（步骤 1），选择 保留所选岛 以隔离右肺（步骤 2），然后单击 显示 3D 以在可视化面板中渲染模型（步骤 3）。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-6
图 6：基于 micro-CT 分析的左肺 3D 重建。 轴向胸部 CT 图像经过逐层处理，以分割充气区域，量化通气量，并重建 3D 模型。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-7
图 7：基于单侧肺纤维化模型中通气肺容积的 micro-CT 分析的 3D 肺重建。 重建的模型以指定格式导出到预定义的目录。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-8
图 8：保存图像的指南。 该图概述了保存图像的顺序步骤，从通过 Annotation Screenshot 菜单启动保存功能开始，到选择格式和定义存储路径。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-protocol-9
图 9：单侧肺纤维化模型中基于 micro-CT 的统计分析。 分析了来自常态通气区域的定量数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

4. Masson 毛状体染色

  1. 在室温 （RT） 下用 4% 多聚甲醛固定肺样品过夜，使用分级乙醇系列脱水，并包埋在石蜡中。用轮转切片机制备厚度为 5 μm 的切片。
  2. 按如下方式对切片进行 Masson 三色染色。
    1. 用蒸馏水冲洗脱蜡和再水化的部分，然后在预热的 Bouin 流体中于 56-60 °C 进行媒染剂处理 1 小时或在室温下过夜。
    2. 洗涤后，用 Weigert 苏木精铁溶液染色切片 10 分钟，用流动的温自来水冲洗 10 分钟，然后浸入 Biebrich 猩红酸品红溶液中 10-15 分钟。
    3. 使用磷钼 - 磷钨酸溶液实现分化 10-15 分钟，并监测直到富含胶原蛋白的区域从红色转变为透明。
    4. 然后，将玻片直接转移到苯胺蓝溶液中 5-10 分钟，用蒸馏水冲洗，并在 1% 乙酸溶液中分化 2-5 分钟。
    5. 通过分级乙醇（95% 至无水酒精）和二甲苯透明化脱水后，用树脂介质封片。

5. Masson 的三色染色机器学习分析

  1. 使用 Masson 三色染色对对照和博来霉素处理的肺中的胶原蛋白组成进行组织病理学评估。
  2. 为了减少观察者依赖性偏差，使用全玻片图像扫描仪获取染色肺切片的高分辨率数字图像。
  3. 然后，使用自动软件轨道图像分析定量分析胶原蛋白区域 8,9,12。训练过程简要介绍如下。
    1. 为每个组织类别（例如，胶原蛋白、正常组织和纤维化组织）手动描述几个具有代表性的注释。使用从带注释的训练区域中提取的像素级特征为支持向量机 （SVM） 构建训练集。
    2. 对于 Masson 染色切片，将组织分类分为三类：胶原蛋白、正常组织和背景。
      注意：机器学习模型通过重复注释和改进对全玻片图像 （WSI） 进行迭代训练，直到病理学家验证的评估确认准确的组织分类。一旦达到令人满意的分类精度，该过程就变得完全自动化：从有效感兴趣区域 （ROI） 内的每个像素中提取特征，然后 SVM 以高精度预测相应的组织类别。

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结果

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图 10A-D 显示了肺体积变化和染色分析的结果。

为了评估博来霉素 （BLM） 对肺组织的影响，我们使用 3D 成像技术对盐水处理组 （Ctrl） 和 BLM 处理组之间的肺体积进行了比较分析。与 Ctrl 相比，BLM 组的左肺体积显着减少。左肺体积 （mm3） 的定量显示 BLM 组显着减少（图 10A，C）。

Masson 的三色染色用于评估肺组织中胶原蛋白沉积的程度，这是纤维化的标志。定量结果显示 BLM 组 Masson 阳性染色显着增加，表明 BLM 组分泌了大量的细胞外基质，如胶原蛋白（图 10B，D）。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺纤维化是一种破坏性疾病，其特征是肺组织进行性瘢痕形成，导致肺功能下降，最终导致呼吸衰竭1。由各种药物和给药方法诱导的肺纤维化小鼠模型是了解疾病进展和评估潜在治疗药物疗效的重要工具，尤其是在博来霉素气管内滴注中13。然而，博来霉素气管内滴注模型存在局限性，包括博来霉素在整个肺部的分布不均匀，以及由于滴注的非选择性性质而可能导致高死亡率。在这项研究中，我们描述了药物的单侧气管内给药。与传统的双侧气管内给药方法相比，这种方法具有两个明显的优势。首先，这种方法允许选择性单侧给药，通常是左肺给药，左肺由小鼠的单个肺叶组成。这种解剖学特征以及摇动小鼠，促进了药物分布的均匀性。此外，单侧肺病模型允许对侧健康肺作为对照，从而能够对治疗和未治疗的肺进行比较分析。

Micro-CT 提供视觉和定量形态测量数据，已广泛用于各种人类疾病动物模型，以监测疾病进展和候选药物的疗效 14,15,16。...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国国家自然科学基金 （82300092） 和呼吸疾病国家重点实验室独立研究 （SKLRD-Z-202302） 和广东省科研院所创新能力建设项目资助 （KD032024001） 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 生理盐水希望生物HBPP008-100
22G钝针屋宇 署383922
3D切片机 图像计算平台3D切片机 https://www.slicer.org/
博莱 霉 素MCE的海-17565
异氟醚后轮驱动R510-22
Masson 染色套件耶森60532ES58型
显微CT品参SNC-100型
轨道轨道图像分析https://www.orbit.bio/
戊巴比妥钠西格马第 3761 页
小动物喉镜玉燕仪器CG-02M
SPSS的IBM版本 19.0 
温暖毯子实验室动画技术纬度-16-0323

参考文献

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标签

CT 3D Slicer

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