本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）通过气管内滴注在病灶侧建立单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型，以定量分析通气区域的实验方案。
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方法文章
利用微型CT进行单侧肺容积分析以加强临床前模型中肺纤维化的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肺纤维化（PF）是一种进行性、不可逆的间质性肺部疾病，预后较差且治疗选择有限。传统的博来霉素气管内滴注诱导小鼠肺纤维化模型可能导致药物分布不均和高死亡率。经过优化的单侧气管内滴注博来霉素给药方法可在小鼠中建立更为均匀和可控的肺纤维化模型，更真实地模拟人类疾病的病理过程。本文介绍了一种利用微型计算机断层扫描（micro-CT）对经气管内滴注在病变侧诱导的单侧博来霉素肺纤维化模型中通气区域进行定量分析的实验方案。该方法可对总体肺容积及通气肺区域进行量化，从而灵敏、准确地评估疾病进展和治疗反应。本研究涉及麻醉、精确给药、micro-CT 扫描以及使用 3D Slicer 软件进行图像后处理分析。博来霉素处理后的单侧肺容积分析显示，与对照组相比，肺容积显著减少。Masson 三色染色证实了博来霉素处理小鼠肺组织中胶原蛋白的存在及其沉积量增加。本研究通过在临床前模型中应用 micro-CT 进行单侧肺容积分析来评估肺纤维化，为研究人员提供了评估 PF 研究中治疗干预效果的一种精确且全面的评价方法。
引言
肺纤维化（PF）是一种破坏性强且不可逆的肺部疾病，目前治疗方法有限。全球肺纤维化的发病率在每10万人中为1至13例，且随着年龄增长，患病率显著上升1。尽管过去几十年已付出大量努力，肺纤维化的治疗手段仍然有限，目前仅有两种抗纤维化药物——尼达尼布（nintedanib）和吡非尼酮（pirfenidone）被批准用于肺纤维化的治疗2。肺纤维化的潜在发病机制极为复杂，涉及分子和细胞生理学的多个方面3。目前，通过不同诱导剂建立的实验性体内动物模型，是研究其致病机制和疾病表型的重要工具。
通过气管内滴注给予博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型，被广泛用于阐明潜在的细胞和分子机制，并用于识别可能的治疗靶点4。然而，气管内滴注博来霉素分布不对称且缺乏选择性，可能导致较高的死亡率，主要原因是纤维化不均和双侧肺损伤5,6。为解决这一问题，我们提出了一种单侧气管内给药方法，以确保实验试剂在左肺内均匀分布，更真实地模拟肺纤维化患者中观察到的病理过程7,8,9。此外，该单侧给药技术还可用于评估需要局部分布的药物，或用于针对特定肺叶的其他实验干预。
在临床前模型中，微型计算机断层扫描（micro-CT）在研究肺部病理方面日益显示出重要价值，已成为纵向研究的有力工具，能够提供定性和定量数据，用于监测疾病进展以及对治疗干预的反应10。micro-CT 已被用于评估总体积、通气区域与非通气区域、支气管形态及组织密度。根据我们先前的研究，我们开发了一种新型成像方法，利用 micro-CT 分析单侧肺体积，并在小鼠肺纤维化模型中评估纤维化水平7,8,9。该方法可对通气肺区域进行量化，从而更准确、更灵敏地反映疾病进展及治疗反应。
本研究介绍了一种源自博来霉素处理小鼠的微计算机断层扫描（micro-CT）的单侧通气肺容积分析方法。该创新方法可对肺纤维化进行更精确和全面的评估，有望改变我们在临床前研究中评价治疗干预效果的方式。本研究在临床前肺纤维化模型分析方面提供了卓越的优化，为评估疾病进展过程中的治疗效应提供了一种强有力的定量分析手段。
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方案
所有动物实验均经广州医科大学动物护理与使用委员会批准。实验采用6至8周龄、体重25至30克的雄性C57BL/6小鼠。小鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下（光照强度：25勒克斯），可自由获取食物和水，并被随机分配至对照组和博来霉素（BLM）组。
1. 单侧肺气管内滴注
- 使用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉6-8周龄、体重25-30 g的C57BL/6雄性小鼠。
- 通过观察呼吸频率和肢体回缩反射来监测麻醉深度。
- 将小鼠仰卧固定在倾斜70°-90°的塑料板上，用门齿和四肢进行固定。
- 使用无菌钝头镊子轻轻牵拉舌头。
- 使用小型动物喉镜观察会厌及口咽部结构，将定制的22 G钝头针插入气管。将塑料板逆时针旋转至-70°，使左主支气管与气管主轴平行。推进针头直至遇到阻力。
注意：应预先使用体型相似的小鼠进行练习，测量导管插入长度，以确保最佳插入深度。 - 迅速将角度旋转至30°，注入40 µL博来霉素溶液（0.02 mg），然后拔出针头。
- 保持小鼠体位至少30秒，以确保药物充分分布。
- 让小鼠俯卧于加热毯上恢复。
2. 微型计算机断层扫描（micro-CT）扫描
注意：小鼠按照制造商的说明使用微型CT系统进行扫描。
- 在博来霉素滴注后3周内对小鼠进行显微CT扫描。
- 向小动物气体麻醉机的蒸发器中加入适量异氟烷，打开蒸发器，调节诱导浓度至3%，将小鼠放入诱导箱中，直至其失去翻正反射并出现缓慢而深长的呼吸。
- 将小鼠从诱导箱中取出，仰卧置于扫描台上，使其四肢伸展，身体沿中线对齐。
- 将扫描台中的异氟烷维持浓度设置为1%。
- 设置显微CT扫描参数：横断面视野43 mm，分辨率2K × 2K，像素大小0.042 mm，层厚0.042 mm。
- 扫描完成后，将小鼠放置于加热毯上直至苏醒。
3. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）后处理：单侧选择性肺部分割与体积分析
注意：图像处理和定量分析使用免费的开源软件 3D Slicer（http://www.slicer.org）进行，操作遵循制造商的说明。采用临床肺窗的 Hounsfield 单位（HU）范围对 HU 图像进行标准化，将肺实质分割为正常通气区域（[-1000, -350] HU），如先前报道8,9,11。图像处理步骤概述如下：
- 打开 3D Slicer。操作界面如图1所示。
- 点击加载以导入 DICOM 格式的影像数据。轴向、冠状和矢状图像将在主界面中显示（图2）。
- 根据图3所示调整与矢状面相关的参数（可选）。(1：显示隐藏选项；2：选择重命名当前体积；3：输入新名称)。
- 在分割编辑器模块中，点击添加以创建用于选择性肺部分析（右肺）的分割（图4）(1：体积；2：分割编辑器；3：添加分割；4：设置阈值；5：调整阈值范围；6：用于掩膜；7：设置球形画笔)。
- 将阈值范围调整为 [-1000, -350] HU，并启用用于掩膜选项。
- 使用带有球形画笔的绘制工具对目标肺区进行分割。
- 选择岛状区域工具，并选择保留选定岛状区域。高亮右肺后，点击显示3D以在可视化面板中显示三维模型（图5）(1：编辑岛状区域（连通成分）；2：选择“保留选定岛状区域”；3：显示三维模型)。
- 在术语面板中，将三维模型颜色更改为蓝色（可选）。
- 对左肺重复步骤 3.4–3.6。逐层处理轴向胸部 CT 图像，以计算通气左肺体积并创建三维模型（图6）。
- 将三维左肺模型颜色更改为黄色（可选）。
- 将右肺分割的不透明度设置为 0.2。
- 按需导出三维模型（图7）。
- 截取三维视图或切片图像的屏幕截图并保存（图8）(1：注释截图；2：选择图像格式；3：修改保存路径)。
- 使用分割统计模块计算每个分割的肺体积（mm3），并对正常通气区域进行定量分析（图9）。
图1：3D Slicer软件的界面。该图展示了3D Slicer软件的主要操作界面。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：小鼠单侧气管内滴注诱导肺纤维化的CT图像。 气管内滴注博来霉素后，显示轴向、冠状和矢状视图以及三维肺重建图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：矢状面视图参数调整。该图展示了参数的调整过程，可实现精确的可视化与分析。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：分割编辑与参数调整。 本图展示了分割编辑过程及相应的参数调整方法。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：右肺的三维分割。 该过程包含三个连续步骤：首先编辑连通区域以实现肺部分割（步骤1），然后选择保留选定区域以分离右肺（步骤2），最后点击显示3D在可视化面板中渲染模型（步骤3）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：基于显微CT分析的左肺三维重建。对胸部轴向CT图像进行逐层处理，以分割通气区域、量化通气容积，并重建三维模型。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：基于单侧肺纤维化模型中通气肺容积的显微CT分析进行的肺部三维重建。 重建模型已导出为指定格式并保存至预设目录。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：保存图像操作指南。 该图展示了保存图像的逐步操作流程，从通过注释截图菜单启动保存功能，到选择文件格式并定义存储路径。 请点击此处查看此图的放大版本。
图9：基于微计算机断层扫描（micro-CT）在单侧肺纤维化模型中的统计分析。 数据来源于正常通气区域的定量分析结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 马松三色染色
- 将肺组织样本用4%多聚甲醛在室温（RT）下固定过夜，经梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋。使用旋转式切片机制备厚度为5 µm的切片。
- 对切片进行Masson三色染色，步骤如下：
- 将脱蜡并复水的切片用蒸馏水冲洗，随后在预热至56–60 °C的Bouin液中媒染1小时，或在室温下过夜。
- 洗涤后，用Weigert铁苏木精溶液染色10分钟，再用流动的温自来水冲洗10分钟，接着浸入Biebrich猩红-酸性品红溶液中染色10–15分钟。
- 使用磷钼酸-磷钨酸溶液分化10–15分钟，并观察至富含胶原的区域由红色变为透明。
- 然后直接将切片转移至苯胺蓝溶液中染色5–10分钟，用蒸馏水冲洗后，再在1%醋酸溶液中分化2–5分钟。
- 依次经梯度乙醇（95%至无水乙醇）脱水，并用二甲苯透明，最后用树脂封片剂封片。
5. 马松三色染色的机器学习分析
- 使用马松三色染色法对对照组和博来霉素处理组肺组织中的胶原成分进行组织病理学评估。
- 为减少观察者依赖性偏差，使用全片图像扫描仪获取染色肺组织切片的高分辨率数字图像。
- 随后使用自动化软件 orbit image analysis8,9,12 对胶原区域进行定量分析。训练过程简述如下：
- 为每种组织类别（例如胶原、正常组织和纤维化组织）手动勾画若干代表性注释区域。利用标注训练区域中提取的像素级特征构建支持向量机（SVM）的训练集。
- 对于马松染色切片，将组织分类定义为三类：胶原、正常组织和背景。
注意：机器学习模型通过对全切片图像（WSIs）进行反复注释与优化，实现迭代训练，直至经病理学家验证的评估确认组织分类准确无误。当分类准确率达到满意水平后，该过程即实现完全自动化：从感兴趣区域（ROIs）内每个有效像素中提取特征，随后由SVM高精度预测其对应的组织类别。
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结果
图10A-D 显示了肺容积变化和染色分析的结果。
为了评估博来霉素（BLM）对肺组织的影响，我们采用三维成像技术，对生理盐水处理组（Ctrl）与BLM处理组的肺体积进行了比较分析。与对照组相比，BLM组的左肺体积显著减小。左肺体积（mm3）的定量分析显示，BLM组明显降低（图10A，C）。
采用马松三色染色法评估肺组织中胶原沉积的程度，这是纤维化的特征性标志。定量结果显示，博来霉素（BLM）组马松阳性染色显著增加，表明该组分泌了大量细胞外基质，如胶原蛋白（图10B、D）。
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讨论
肺纤维化是一种破坏性疾病，其特征是肺组织进行性瘢痕化，导致肺功能下降，并最终引发呼吸衰竭1。通过不同药理学试剂和给药方法建立的肺纤维化小鼠模型，是研究疾病进展和评估潜在治疗药物疗效的重要工具，尤其是在博来霉素经气管滴注模型中应用广泛13。然而，博来霉素气管内滴注模型存在局限性，包括博来霉素在肺内分布不均，以及由于滴注过程缺乏选择性而导致的高死亡率风险。在本研究中，我们描述了一种单侧气管内给药方法。该方法相较于传统的双侧气管内给药具有两个明显优势。首先，该方法可实现选择性单侧给药，通常靶向小鼠左肺，而小鼠左肺仅包含一个肺叶。结合给予小鼠震荡操作，这一解剖学特点有助于提高药物分布的均一性。此外，单侧肺疾病模型使得对侧健康肺可作为内部对照，从而实现治疗肺与未治疗肺之间的比较分析。
显微计算机断层扫描（micro-CT）可提供可视化和定量的形态计量学数据，已被广泛应用于多种人类疾病动物模型中，用于监测疾病进展及候选药物的疗效14,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得国家自然科学基金（82300092）、呼吸疾病国家重点实验室自主研究项目（SKLRD-Z-202302）以及创新能力资助项目的资助。 广东省建设项目 研究机构（KD032024001）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | Hopebio | HBPP008-100 | |
| 22G 钝针 | BD | 383922 | |
| 3D Slicer 图像计算平台 | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | |
| 博来霉素 | MCE | HY-17565 | |
| 异氟烷 | RWD | R510-22 | |
| Masson 染色试剂盒 | Yeasen | 60532ES58 | |
| Micro-CT | Pinseng | SNC-100 | |
| Orbit | Orbit 图像分析 | https://www.orbit.bio/ | |
| 戊巴比妥钠 | Sigma | P3761 | |
| 小动物喉镜 | 玉研仪器 | CG-02M | |
| SPSS | IBM | Version 19.0 | |
| 加热垫 | Lab Anim Tech | LAT-16-0323 |
参考文献
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