建立与评估一种 体外 肺纤维化的人源高级模型

摘要

基于成纤维细胞活化蛋白（FAP）开发了一种成像方法，用于评估人源性精准切割肺组织切片中成纤维细胞的活化状态。该方法建立了一个稳健且可重复的平台，可用于分期纤维化进展，推动转化研究 体外 在保持人类组织微环境保真度的同时，为治疗开发提供模型。

摘要

肺纤维化以肺泡结构的不可逆破坏和细胞外基质的过度沉积为特征。尽管动物模型已广泛应用于肺纤维化研究，但目前尚无一种可用模型能够完全模拟特发性肺纤维化（IPF）的进行性病程或其典型的组织学特征，例如成纤维细胞灶。先进 体外 模型，包括精密切割肺片（precision-cut lung slices, PCLS），通常被视为最具生理相关性的肺部测试系统，并已成功用于药物筛选。然而，由于难以区分特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织中纤维化的程度，导致所获得的PCLS存在盲区和不确定性。先前研究表明，成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein, FAP）可评估间质性肺病（ILD）的促纤维化活性，有望助力早期诊断及选择合适的治疗窗口。本研究将利用冲击切片机从健康供体和IPF患者获取600 µm的PCLS，并采用靶向FAP的分子探针进行评估，依据荧光信号强度确定成纤维细胞活性程度。该方法提供了一种先进的 体外 肺纤维化研究的模型与评估技术，有助于深入研究疾病机制并评估治疗干预措施。

引言

肺纤维化（PF）是一种病因未明且预后极差的常见类型，其中位五年生存率仅为25%¹。目前，经气管注射博来霉素的动物模型是临床前研究中最广泛使用的方法²。然而，博来霉素诱导的纤维化是暂时性的，会随着时间推移而自行缓解，这与特发性肺纤维化（IPF）不可逆的特征形成鲜明对比³。此外，无论采用手术或非手术方式经气管给药，博来霉素模型均存在显著挑战，其纤维化严重程度因给药过程中的不均一性而表现出高度异质性。当前动物模型的这些局限性导致针对IPF的临床试验失败率居高不下⁴。

精密切割肺组织片（PCLS）已被用于多种疾病的研究，因其能够忠实地保留疾病特异性的细胞互作网络及微环境^5,6,7。在肺纤维化研究中，来自特发性肺纤维化（IPF）患者肺组织的PCLS保留了天然的组织结构和细胞异质性，使得多种细胞类型及其与细胞外基质的相互作用得以观察^8,9，从而确立了其作为研究肺部病理生理学的代表性ex vi....

方案

本研究经广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准（2021G-29）。特发性肺纤维化（IPF）的诊断依据为体格检查和胸部高分辨率计算机断层扫描（HRCT）结果，符合ATS/ERS/JRS/ALAT（2022）制定的诊断标准。所有IPF患者的标本均来自肺移植或肺活检。健康肺组织样本取自被诊断为脑死亡的器官捐献者10。在样本采集前，已从每位患者或其家属处获得书面的组织采集知情同意书。有关本实验方案中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息，请参见 材料表.

1. 人肺切片的制备

注意：在进行肺移植或活检前，患者需常规筛查HIV、HCV或梅毒等病毒，且必须检测结果为阴性后方可进行后续实验，以确保实验室工作人员的职业安全。

1. 溶液配制
   1. 配制磷酸盐缓冲液（1× PBS），并在 4 °C 预冷。
   2. 配制 2% 琼脂糖溶液。称取 2 g 琼脂糖，转移至锥形瓶中。加入 100 mL PBS，充分混匀后，放入微波炉加热至剧烈沸腾（≥95 °C），直至溶液完全澄清、均匀，无可见颗粒或条纹。加热过程中应不时摇动锥形瓶，防止过度沸腾。将溶液置于 37 °C 水浴中备用。
2. 精密切割肺组织切片
   1. 用 PBS 清洗肺组织外表面，以去除多余的杂质和血液。

结果

人肺组织PCLS的制备流程如图1所示。将人肺组织包埋于琼脂糖中，随后使用剃刀将其修整为约1 cm³大小的组织块。修整并压平的组织被固定在切片平台上，利用切片机切割成600 µm厚的切片（图1A，B）。PCLS被置于12孔板中进行孵育（图1C）。

靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的单链抗体scFv-FAP的制备及其亲和力表征方法如下所示 图2scFv-FAP 通过 293F 表达系统进行纯化。对纯化后蛋白的分子量和纯度进行了评估 通过 SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色。观察到的scFv-FAP分子量约为28 kDa，与单链抗体的预期大小一致图2A，左侧）。如 SDS-PAGE 凝胶所示，使用脱盐柱纯化后，与 ICG 偶联的 scFv-FAP 纯度.......

讨论

通过上述研究方法，制备了来自健康供者和特发性肺纤维化（IPF）患者的肺切片（PCLS）。同时，利用哺乳动物细胞表达FAP的单链可变片段，并验证了其纯度和特异性。采用靶向FAP并标记吲哚菁绿（ICG）的分子探针检测FAP的表达水平，以反映成纤维细胞的活化程度。该方法为肺纤维化的治疗提供了先进的评估手段。

PCLS 在维持组织活性的同时，保留了天然的细胞组成、细胞间相互作用以及细胞-基质关系^5,6,7此外，连续切片的均匀厚度和相似形状有助于提高实验结果的可重复性⁸然而，肺切片（PCLS）制备在技术上仍存在挑战，尤其是在冷冻琼脂糖包埋方案中，琼脂糖聚合前需要实现均匀的组织渗透，这要求进行精细的控制。可能需要对组织块采取额外的外部固定措施，以增强结构刚性，并确保切片过程中的位置稳定性。尽管已有这些改进，肺纤维化的研究仍然面临困难。 体外 使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 % 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15050-057
2× Color SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml 注射器	Winner	V532159
293T 细胞	Beyotime	C6008
502 胶水	卓立德	D-40
低凝胶温度琼脂糖	Sigma Aldrich	A9414-25G
抗胶原蛋白 I 抗体	abcam	ab138492
抗纤维连接蛋白抗体	abcam	ab2413
抗 His 标签单克隆抗体-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
刀片	Gillette	7in83a7Q
Color 逆转录试剂盒（含基因组 DNA 去除剂）	EZBioscience	A0010CGQ
考马斯亮蓝超快染色液	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
锥形瓶	四川顺博	GG-17
FAP 兔单克隆抗体	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
镊子	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	瑞禧生物	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
微量天平	Secura	Secura225D-1CN
微波炉	Mideo	PM2002
多功能活体动物成像系统	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte 流式细胞仪	ACEA Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
通用RNA纯化试剂盒	EZBioscience	EZB-RN4
振动切片机	DOSAKA	DTK-1000N
β-actin 兔多克隆抗体	翊圣生物	30102ES
引物
β-actin 引物-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-actin 引物-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP 引物-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP 引物-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
胶原蛋白-I 引物-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
胶原蛋白-I 引物-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
纤维连接蛋白引物-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
纤维连接蛋白引物-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA