体外人肺纤维化高级模型的建立与评价

Summary

开发了一种基于成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 的人精确切割肺切片中成纤维细胞活化的成像方法。该方法为纤维化进展分期建立了一个强大且可重复的平台，推进用于治疗开发的转化 体外 模型，同时保持人体组织微环境的保真度。

Abstract

肺纤维化的特征是肺泡结构的不可逆破坏和细胞外基质的过度沉积。尽管动物模型已广泛用于肺纤维化研究，但目前可用的模型都没有完全概括 IPF 的进行性性质或其定义的组织学特征，例如成纤维细胞病灶。先进的 体外 模型，包括精确切割肺切片 （PCLS），通常被认为是最具生理相关性的肺部测试系统，并已成功用于药物筛选。然而，无法区分 IPF 肺纤维化的程度导致获得的 PCLS 盲法和不确定性。先前的研究表明，成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 可以评估 ILD 的促纤维化活性，可能有助于早期诊断和选择合适的治疗窗口。在这项研究中，将使用休克切片机从健康供体和 IPF 患者那里获得 600 μm PCLS，并使用靶向 FAP 的分子探针进行评估，以确定基于荧光信号强度的成纤维细胞活性程度。这种方法为肺纤维化研究提供了先进的 体外 模型和评估技术，增强了研究疾病机制和评估治疗干预的能力。

Introduction

肺纤维化 （PF） 是一种常见形式，病因不明，预后特别差，中位五年生存率仅为 25%¹。气管内博来霉素给药模型是目前临床前研究中使用最广泛的动物模型²。然而，博来霉素诱导的纤维化是短暂的，会随着时间的推移而消退，这与 IPF³ 的不可逆性质形成鲜明对比。此外，由于气管内给药（无论是手术还是非手术）导致纤维化的严重程度参差不齐，气管内博来霉素模型带来了重大挑战。当前动物模型的这些局限性导致针对 IPF⁴ 的临床试验的高失败率。

精确切割肺切片 （PCLS） 已被用于多种疾病，因为它们忠实地保留了疾病特异性细胞串扰网络和微环境 ^5,6,7。在肺纤维化中，来自 IPF 肺的 PCLS 保留了天然组织结构和细胞异质性，能够观察各种细胞类型和细胞-细胞外基质相互作用 ^8,9，使其成为研究肺部病理生理学的代表性离体模型。然而，由于肺纤维化的特征是肺部的异质性纤维化病变，因此 PCLS 采样本质上是盲的。无法从视觉上区分获得的切片是代表静止期、活性期还是正常肺组织的纤维化区域。这一局限性强调了视觉评估和筛查工具的必要性。先前的研究发现，成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 在 IPF 患者的肺组织中高度特异性表达，表明 FAP 可以评估 ILD¹⁰ 的促纤维化活性。

在本研究中，用吲哚菁绿 （ICG） 标记抗 FAP 的单链抗体，以开发具有增强组织渗透性的靶向分子成像探针。使用该探针对从健康供体和 IPF 患者获得的 600 μm PCLS 进行成像，并根据荧光信号强度评估成纤维细胞活性。这种成像方式优于传统的纤维化评估技术（蛋白质印迹、qPCR、Masson 三色染色或免疫荧光），作简单，保持细胞结构完整性和活力，同时能够纵向追踪致病进展。更重要的是，它易于作，只需 90 分钟。这为 PCLS 体外 模型提供了先进的筛选工具，促进了肺纤维化研究。

Protocol

该研究获得广州医科大学第一医院伦理委员会 （2021G-29） 批准。IPF 是根据体格检查和胸部高分辨率计算机断层扫描结果诊断的，遵循 ATS/ERS/JRS/ALAT （2022） 制定的诊断标准。所有 IPF 患者标本均来自肺移植或肺活检。健康的肺组织样本是从被诊断为脑死亡的器官捐献者那里获得的10。在收集组织之前，已获得每位患者或患者家属的书面同意书。有关本协议中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息，请参阅 材料表。

1. 人 PCLS 的制备

注意：在肺移植或活检之前，患者会定期接受 HIV、HCV 或梅毒等病毒筛查，并且在进行后续实验之前必须检测呈阴性，以确保实验室人员的职业安全。

1. 溶液制备
   1. 制备磷酸盐缓冲溶液 （1× PBS），并在 4 °C 下预冷。
   2. 制备 2% 琼脂糖溶液。称取 2 g 琼脂糖并将其转移到锥形瓶中。加入 100 mL PBS，充分混合，然后在微波炉中加热，直到混合物达到剧烈沸腾 （≥95 °C），变得完全透明、均匀且无可见颗粒或条纹。加热过程中偶尔旋转培养瓶，以防止过度沸腾。将溶液置于 37 °C 的水浴中直至使用。
2. 精确切割的肺切片
   1. 用 PBS 清洗肺组织的外表面，以去除多余的杂质和血液。
   2. 使用 20 mL 注射器（1.2 mm 针头）吸出适当体积的琼脂糖并将其插入气管。将琼脂糖缓慢注射到肺叶中，直到完全充气。遇到明显耐药性时停止注射，以防止琼脂糖渗漏。
      注：每 5 × 2 × 1 cm 组织块大约需要 10 mL 琼脂糖，以避免溢出。对于较小的组织块，使用 5 mL 注射器和包埋模具（例如，硅胶模具、塑料托盘或切割成一定尺寸的离心管）来帮助包埋。将 1-2 mm 厚的琼脂糖基层倒入模具中，使其半固化。轻轻地将肺组织放在半固体琼脂糖上，然后缓慢倒入额外的琼脂糖以完全覆盖组织，避免气泡。让琼脂糖完全凝固。
   3. 将肺放在冰上约 30 分钟，以允许琼脂糖聚合。检查胸膜的硬度和凉爽度，以确认聚合;如有必要，继续冷却。
   4. 使用锋利的刀片将肺组织切成 1-2 厘米的板。
   5. 将冰浴盘放在切割台的中央，并提前装满冰块进行预冷却。
   6. 打开电源开关并按住 UP 按钮，将样品台升高到合适的位置。
   7. 小心地将刀片装入刀架上。
      注意： 小心处理刀片以避免受伤。将用过的刀片丢弃在指定的锐器容器中。
   8. 剪下一条长约 3 厘米、宽约 1 厘米的胶带。将粘性面贴在托盘上，并在不粘性的一面均匀涂上氰基丙烯酸酯胶粘剂。
   9. 用镊子夹起一块肺组织。用吸水纸吸干表面，然后将其放在涂胶胶带上。轻轻按压以确保牢固粘合。
   10. 胶水凝固后，将托盘装入冰浴托盘上。填充预冷的 PBS，直到组织块被淹没。
   11. 将振动频率设置为“10”，将切割速度设置为“2”。按下 FWD 按钮开始切片。在第一片完全切割后，按下 STP 按钮停止，然后按下 RVE 按钮缩回刀片。丢弃第一个切片。
   12. 手动旋转转盘 6 次，将截面厚度设置为 600 μm。按下 FWD 按钮继续切片，切段后按下 STP 按钮。按 RVE 缩回刀并使用镊子取回肺切片。将切片放入含有 1% 青霉素/链霉素 （P/S） 的 PBS 中，并保持在冰上。
   13. 重复上述切片步骤以获得额外的 PCLS，每个 PCLS 的厚度约为 600 μm。
   14. 当当前的组织块几乎用完时，用新的组织块替换它并重复步骤 1.2.4 到 1.2.13。

2. FAP 抗体的纯化

注：生成包含先前描述的 C 端 His 标签的 FAP 特异性单域抗体^11,12。

1. 通过针对固定化或液相靶标重复平移组合文库，进行噬菌体展示，以实现 FAP 特异性抗体片段 （scFv） 的高通量选择。通过严格的洗涤和洗脱回收结合的噬菌体。通过再感染 大肠 杆菌扩增噬菌体，并在 3-4 个循环中富集靶标结合物。使用噬菌体 ELISA 和 DNA 测序验证克隆，以鉴定高亲和力抗体¹².
2. 将编码抗 FAP 单链可变片段的 DNA 序列克隆到与 His 标签融合的 pET-28a（+） 载体中，以便在 大肠杆菌¹³ 中表达。
3. 将重组质粒转化到 大肠杆菌 BL21 （DE3） 细胞中。在 20 °C 下孵育过夜的摇瓶培养物中使用异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导蛋白表达¹⁴。
4. 使用次氮基三乙酸镍 （Ni-NTA） 珠子从上清液中纯化 FAP 抗体。使用 PBS 进行缓冲液置换，用于下游应用。
5. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 评估抗体纯度。预期分子量的单个优势条带表示纯度高。

3. FAP 抗体亲和力的评估

1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养人胚胎肾 293T （HEK 293T） 细胞。
2. 将过表达人成纤维细胞活化蛋白 （hFAP） 的慢病毒以 90% 汇合度添加到 293T 细胞中。孵育 96 小时以产生稳定的 293T-hFAP 细胞系。
3. 用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 293T 和 293T-hFAP 细胞并收集细胞。
4. 用 PBS 洗涤细胞，并与 FAP 抗体一起孵育，然后用 Alexa Fluor 488 偶联的抗 His IgG 孵育。
5. 使用 NovoCyte 流式细胞仪分析荧光强度^15,16。

4. scFv-FAP-ICG 分子探针标记

1. 使用 PBS 将 FAP-scFv 的浓度调节至 2 mg/mL。
2. 添加吲哚菁绿 NHS 酯 （ICG-NHS） 以达到 5：1 的摩尔比 （ICG-NHS：FAP-scFv）。
3. 涡旋和摇晃充分混合。
4. 在室温下避光孵育反应物 2 小时。
5. 使用脱盐柱去除未结合的染料。将最终的偶联产物在 4 °C 下避光储存。

5. scFv-FAP-ICG 分子探针用于评估 PCLS 中成纤维细胞活性的程度

1. 切割 PCLS 后，将每孔一部分放入 12 孔板中。用 1 mL PBS 冲洗每个孔两次，以去除残留的血液和碎屑。
2. 将 PCLS 浸入不含 FBS 的 1 mL DMEM 中。添加终浓度为 5 μg/mL 的 scFv-FAP-ICG。在室温下在摇床上孵育 1 小时，轻轻摇动，避光。
3. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。
4. 使用以下设置的 体内 动物成像系统获取 PCLS 的 ICG 荧光图像：785 nm 的激发波长和 810 nm 的发射波长。
5. 根据荧光强度评估 PCLS 的纤维化活性。使用兼容软件定义感兴趣区域 （ROI），荧光辐射度表示为光子/s/cm²/sr。
   1. 点击 Select ROI 按钮以允许软件自动勾勒出伪彩色区域。如果 ROI 投放不准确，请手动调整。单击 Calculate 以确定区域内的信号强度。如果选择了多个子区域，则对所有子区域的值求和。

Results

人肺组织 PCLS 的制备程序如图 1 所示。将人肺组织包埋在琼脂糖中，随后使用剃须刀片修剪成约 1 cm³ 大小的组织块。将修剪和压平的组织固定在平台上，使用切片机以 600 μm 的厚度进行切片（图 1A，B）。将 PCLS 在 12 孔板中孵育（图 1C）。

scFv-FAP 是一种靶向成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 的单链抗体，其制备和亲和力表征如图 2 所示。使用 293F 表达系统纯化 scFv-FAP。 通过 SDS-PAGE 凝胶的考马斯亮蓝染色评估纯化蛋白质的分子量和纯度。观察到的 scFv-FAP 分子量约为 28 kDa，与单链抗体的预期大小一致（图 2A，左）。随后使用脱盐柱将偶联 ICG 的 scFv-FAP 纯化至纯度超...

Discussion

通过上述研究方法，制备了来自健康供体和 IPF 患者的 PCLS。同时，使用哺乳动物细胞表达 FAP 的单链可变片段，并验证其纯度和特异性。采用靶向 FAP 并用 ICG 标记的分子探针检测 FAP 表达水平，反映成纤维细胞活化的程度。这种方法为肺纤维化治疗提供了一种先进的评估方法。

PCLS 保留了天然细胞组成、细胞间相互作用和细胞-基质关系，同时保持了组织活力 ^5,6,7。此外，连续切片的均匀厚度和相似形状增强了实验结果的可重复性⁸。然而，PCLS 制备存在技术挑战，尤其是在冷冻琼脂糖包埋方案中，其中琼脂糖聚合前的均一浸润需要精细控制。可能需要对组织块进行补充外固定，以增强结构刚度并确保切片过程中的位置稳定性。尽管取得了这些进展，但使用培养的 PCLS 在体外研...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%胰蛋白酶-	EDTA，Gibco	15050-057,2
&次;颜色 SYBR 绿色 qPCR 预混液 （ROX2）	EZBioscience	A0012-R2
20 ml 注射器	Winner	V532159
293T 细胞	Beyotime	C6008
502 胶水	卓利德	D-40
琼脂糖，低胶凝温度	Sigma Aldrich	A9414-25G
抗胶原蛋白 I 抗体	abcam	ab138492
抗纤连蛋白抗体	abcam	ab2413
抗 His 标签 mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
彩色逆转录试剂盒（含 gDNA 去除剂）	EZBioscience	A0010CGQ
考马斯蓝超快染色液	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
锥形瓶	四川顺博	GG-17
FAP 兔单克隆抗体	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
镊子	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
微量天平	Secura	Secura225D-1CN
微波	Mideo	PM2002
多模式体内动物成像系统	BioLight	AniView600
Ni-NTA	金斯瑞	L00250
NovoCyte 流式细胞仪	ACEA 生物科学	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
通用 RNA 纯化	EZBioscience	EZB-RN4
振动切片剂	DOSAKA	DTK-1000N
β-肌动蛋白兔 pAb	Yeasen	30102ES
引物
-肌动蛋白引物-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-肌动蛋白引物-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGACGAT
FAP 引物-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP 引物-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
胶原蛋白-I 引物-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
胶原蛋白 I 引物-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
纤连蛋白引物-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAG
纤连蛋白引物-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA