Method Article

体外人肺纤维化高级模型的建立与评价

DOI:

10.3791/67845

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July 22nd, 2025

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1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory

In This Article

Summary

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开发了一种基于成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 的人精确切割肺切片中成纤维细胞活化的成像方法。该方法为纤维化进展分期建立了一个强大且可重复的平台，推进用于治疗开发的转化 体外 模型，同时保持人体组织微环境的保真度。

Abstract

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肺纤维化的特征是肺泡结构的不可逆破坏和细胞外基质的过度沉积。尽管动物模型已广泛用于肺纤维化研究，但目前可用的模型都没有完全概括 IPF 的进行性性质或其定义的组织学特征，例如成纤维细胞病灶。先进的 体外 模型，包括精确切割肺切片 （PCLS），通常被认为是最具生理相关性的肺部测试系统，并已成功用于药物筛选。然而，无法区分 IPF 肺纤维化的程度导致获得的 PCLS 盲法和不确定性。先前的研究表明，成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 可以评估 ILD 的促纤维化活性，可能有助于早期诊断和选择合适的治疗窗口。在这项研究中，将使用休克切片机从健康供体和 IPF 患者那里获得 600 μm PCLS，并使用靶向 FAP 的分子探针进行评估，以确定基于荧光信号强度的成纤维细胞活性程度。这种方法为肺纤维化研究提供了先进的 体外 模型和评估技术，增强了研究疾病机制和评估治疗干预的能力。

Introduction

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肺纤维化 （PF） 是一种常见形式，病因不明，预后特别差，中位五年生存率仅为 25%1。气管内博来霉素给药模型是目前临床前研究中使用最广泛的动物模型2。然而，博来霉素诱导的纤维化是短暂的，会随着时间的推移而消退，这与 IPF3 的不可逆性质形成鲜明对比。此外，由于气管内给药（无论是手术还是非手术）导致纤维化的严重程度参差不齐，气管内博来霉素模型带来了重大挑战。当前动物模型的这些局限性导致针对 IPF4 的临床试验的高失败率。

精确切割肺切片 （PCLS） 已被用于多种疾病，因为它们忠实地保留了疾病特异性细胞串扰网络和微环境 5,6,7。在肺纤维化中，来自 IPF 肺的 PCLS 保留了天然组织结构和细胞异质性，能够观察各种细胞类型和细胞-细胞外基质相互作用 8,9，使其成为研究肺部病理生理学的代表性离体....

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Protocol

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该研究获得广州医科大学第一医院伦理委员会 （2021G-29） 批准。IPF 是根据体格检查和胸部高分辨率计算机断层扫描结果诊断的，遵循 ATS/ERS/JRS/ALAT （2022） 制定的诊断标准。所有 IPF 患者标本均来自肺移植或肺活检。健康的肺组织样本是从被诊断为脑死亡的器官捐献者那里获得的10。在收集组织之前，已获得每位患者或患者家属的书面同意书。有关本协议中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息，请参阅 材料表。

1. 人 PCLS 的制备

注意：在肺移植或活检之前，患者会定期接受 HIV、HCV 或梅毒等病毒筛查，并且在进行后续实验之前必须检测呈阴性，以确保实验室人员的职业安全。

  1. 溶液制备
    1. 制备磷酸盐缓冲溶液 （1× PBS），并在 4 °C 下预冷。
    2. 制备 2% 琼脂糖溶液。称取 2 g 琼脂糖并将其转移到锥形瓶中。加入 100 mL PBS，充分混合，然后在微波炉中加热，直到混合物达到剧烈沸腾 （≥95 °C），变得完全透明、均匀且无可见颗粒或条纹。加热过程中偶尔旋转培养瓶，以防止过度沸腾。将溶液置于 37 °C 的水浴中直至使用。
  2. 精确切割的肺切片
      ....

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Results

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人肺组织 PCLS 的制备程序如图 1 所示。将人肺组织包埋在琼脂糖中，随后使用剃须刀片修剪成约 1 cm3 大小的组织块。将修剪和压平的组织固定在平台上，使用切片机以 600 μm 的厚度进行切片（图 1A，B）。将 PCLS 在 12 孔板中孵育（图 1C）。

scFv-FAP 是一种靶向成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 的单链抗体，其制备和亲和力表征如图 2 所示。使用 293F 表达系统纯化 scFv-FAP。 通过 SDS-PAGE 凝胶的考马斯亮蓝染色评估纯化蛋白质的分子量和纯度。观察到的 scFv-FAP 分子量约为 28 kDa，与单链抗体的预期大小一致（图 2A，左）。随后使用脱盐柱将偶联 ICG 的 scFv-FAP 纯化至纯度超.......

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Discussion

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通过上述研究方法，制备了来自健康供体和 IPF 患者的 PCLS。同时，使用哺乳动物细胞表达 FAP 的单链可变片段，并验证其纯度和特异性。采用靶向 FAP 并用 ICG 标记的分子探针检测 FAP 表达水平，反映成纤维细胞活化的程度。这种方法为肺纤维化治疗提供了一种先进的评估方法。

PCLS 保留了天然细胞组成、细胞间相互作用和细胞-基质关系，同时保持了组织活力 5,6,7。此外，连续切片的均匀厚度和相似形状增强了实验结果的可重复性8。然而，PCLS 制备存在技术挑战，尤其是在冷冻琼脂糖包埋方案中，其中琼脂糖聚合前的均一浸润需要精细控制。可能需要对组织块进行补充外固定，以增强结构刚度并确保切片过程中的位置稳定性。尽管取得了这些进展，但使用培养的 PCLS 在体外研.......

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Disclosures

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作者没有需要披露的利益冲突。

Acknowledgements

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我们很感激这项工作得到了中国国家自然科学基金 （82470061）、广州实验室青年科学家计划 （QNPG23-15） 和呼吸疾病国家重点实验室独立项目 （SKLRD-Z-202305） 的资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25%胰蛋白酶-EDTA，Gibco15050-057,2
&次;颜色 SYBR 绿色 qPCR 预混液 （ROX2）EZBioscienceA0012-R2
20 ml 注射器WinnerV532159
293T 细胞BeyotimeC6008
502 胶水卓利德D-40
琼脂糖，低胶凝温度Sigma AldrichA9414-25G
抗胶原蛋白 I 抗体abcamab138492
抗纤连蛋白抗体abcamab2413
抗 His 标签 mAb-Alexa Fluor 488MBLD291-A48
BL21BeyotimeD1009S
BladeGillette7in83a7Q
彩色逆转录试剂盒（含 gDNA 去除剂）EZBioscienceA0010CGQ
考马斯蓝超快染色液BeyotimeP0017F
DMEMGibco12800017
锥形瓶四川顺博GG-17
FAP 兔单克隆抗体CST66562
FBSGibco10099-141
镊子RobozRS-5135
ICG-NHSRuixibioR-TE-157
IPTGMCE367-93-1
微量天平SecuraSecura225D-1CN
微波MideoPM2002
多模式体内动物成像系统BioLightAniView600
Ni-NTA金斯瑞L00250
NovoCyte 流式细胞仪ACEA 生物科学Novocyte
PBSGibco10010023
青霉素-链霉素Gibco15140122
SDS-PAGEBeyotimeP00528
通用 RNA 纯化EZBioscienceEZB-RN4
振动切片剂DOSAKADTK-1000N
β-肌动蛋白兔 pAbYeasen30102ES
引物
-肌动蛋白引物-FiGenebook BiotechCATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-肌动蛋白引物-RiGenebook BiotechCTCCTTAATGTCACGACGAT
FAP 引物-FiGenebook BiotechTTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP 引物-RiGenebook BiotechGCTGTGCTCGTGGATTTGT
胶原蛋白-I 引物-FiGenebook BiotechGAGGGCCAAGACGAAGACATC
胶原蛋白 I 引物-RiGenebook BiotechCAGATCACGTCATCGCACAAC
纤连蛋白引物-FiGenebook BiotechCGGTGGCTGTCAGTCAAG
纤连蛋白引物-RiGenebook BiotechAAACCTCGGCTTCCTCCATAA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raghu, G., et al. An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement: Idiopathic pulmonary fibrosis: Evidence-based guidelines for diagnosis and management. Am J Respir Crit Care Med. 183 (6), 788-824 (2011).
  2. Jenkins, R. G., et al.

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Pulmonary FibrosisIn Vitro ModelPrecision Cut Lung SlicesFibroblast Activation ProteinExtracellular MatrixFibroblastic FociDrug ScreeningMolecular ProbesFluorescent SignalFibroblast Activity
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