本研究描述了一种改良的6-0尼龙结扎法，用于在小鼠中诱导牙周炎，该方法具有高度可重复性，为研究人员提供了一种从疾病发生到病理后果全过程研究牙周病的替代方法。
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本文内容
摘要
摘要
牙周病（PD）是一种影响牙齿支持组织的炎症性疾病，也是全球最常见的疾病之一。其严重形式牙周炎可导致软组织、牙齿和骨组织的破坏。目前已使用灵长类动物、犬、小型猪和小鼠建立了牙周炎的动物模型。其中，结扎诱导的小鼠模型具有疾病进展迅速、可重复性高、可预测性强以及成本低等优势，同时能有效模拟人类牙周炎的关键特征。使用结扎法的小鼠模型已为牙周组织的微生物学和免疫学微环境提供了重要见解，突显了生物膜在免疫反应中的关键作用及其与全身性疾病的相关性。本研究介绍了一种改良的尼龙结扎法以诱导小鼠牙周炎。该改良方法采用尼龙缝线代替丝线，并将缝线置于邻面接触区下方，而非穿过接触点。该方法在有效诱导牙周炎的同时简化了操作技术。文中以图示方式详细展示了缝线放置的方法，并通过组织学和组织形态测量学分析展示了牙周炎的发展过程。
引言
牙周病（PD）是一种累及牙齿支持组织的炎症性疾病，是全球最常见的疾病之一1；据报道，全球PD的发病率在20%至50%之间2。PD具有不同程度的进展过程；其轻度形式称为牙龈炎，仅影响软组织，而其重度形式称为牙周炎（PT），会影响骨等硬组织3。由于PT是一种炎症性疾病，必须将其视为一种复杂的免疫反应，该反应可受多种风险因素的影响，从而改变疾病进程4，例如糖尿病5、心血管疾病6、激素相互作用（如不良妊娠结局7或子痫前期8）、炎症性疾病9，甚至眼部改变10或痴呆11。
因此，为了理解与胎膜早破（PT）的发生或流行相关的病因，测试新的或更有效的治疗策略，或确定全身性疾病与胎膜早破（PT）或牙周微生物群之间的任何关联，需要使用动物模型12。
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方案
所有涉及实验动物的操作均严格遵循《实验动物生物医学研究伦理框架》，并符合墨西哥官方标准NOM-062-ZOO-1999。本研究已获得墨西哥国立自治大学伊斯塔卡拉分校（FES-Iztacala）伦理委员会批准，批准编号为CE/FESI/072024/1765。小鼠饲养于FES-Iztacala动物实验设施内的动物房中，环境无特定病原体，可自由获取食物和水。本实验方案是在Abe等人先前描述的方法基础上进行的改进。276至8周龄雌性BALB/c小鼠（体重16 g）被分为对照组（CTL）和牙周炎组（PT）。通过在第0天放置6-0尼龙缝线以促进细菌持续黏附，诱导严重且慢性的牙周炎进展。30天后，所有小鼠均按照机构批准的方案实施安乐死，通过组织形态学分析评估组织损伤和附着丧失（AL）。图1）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 麻醉准备
- 用注射用水配制赛拉嗪和氯胺酮的稀释液（1:10，作为储备液）。4 °C 保存，4 周内使用完毕。
- 识别并称量每只小鼠。根据体重配制赛拉嗪（1 mg/kg）和氯胺酮（2 mg/kg）的剂量，使用胰岛素注射器进行肌肉注射。
- 将麻醉液总剂量的 50% 注射至一侧后肢肌肉。在对侧重复该操作。
- ....
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结果
该方法可使小鼠从第二周开始诱导产生牙周炎（PT）。每周对小鼠进行监测，以确认结扎线的存在。在第30天实施安乐死。评估了所有组别的临床特征。对照组随时间推移保持正常的特征，如牙龈边缘的颜色和结构。与CTL组相比，PT组组织出现炎症、出血及牙周袋形成，这些变化在诱导小鼠的牙龈边缘处可见（图5）。
通过组织学和组织形态计量学分析两组M2牙周组织的附着水平（AL），证实了疾病的发展过程。对照组（CTL）呈现类似健康组织的组织学特征：边缘龈和龈沟上皮、牙龈纤维（图6A，CTL组蓝色箭头）、结合上皮以及牙槽嵴（图6A，CTL组绿色箭头）结构完整；结缔组织纤维位置和高度正常；沙比纤维（Sharpey's fibers）在牙槽骨和牙骨质处的插入点保持完整；根周厚度对称（图6A，CTL组橙色箭头），尤其在颊侧和腭侧附着区域表现明显。在牙周膜（PDL）纤维、结缔组织.......
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讨论
已采用多种牙周炎动物模型来评估不同方面，例如微生物学和免疫应答，并且这些模型在某些方面与人类疾病具有相似性43。这些发现为牙周病的机制框架提供了证据，例如生物膜的作用、免疫应答以及与全身状况的相互作用44,45。
牙周炎的动物模型具有不同的复杂性和相似性；例如，非人灵长类动物、狗或小型猪与人类牙周病最为相似19，但其饲养和维护成本高昂且要求较高，使得这些模型难以广泛应用。此外，小鼠牙周炎模型成本较低且易于操作。同时，小鼠可通过基因改造以生成特定的分子或目标细胞46，且相关技术已十分成熟47。
尽管小鼠不会自然发生牙周炎（PT），但可通过不同方法诱导产生；其中最常用的是结扎诱导模型，该模型具有高度可重复性
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披露
作者声明，本文发表不存在利益冲突。
致谢
本工作部分由墨西哥州科学技术委员会（COMECYT）资助项目 [FICDTEM-2021-072] 以及墨西哥国立自治大学研究与技术创新支持计划（PAPIIT）-UNAM 资助项目 [IN-217021] 提供经费支持。我们感谢墨西哥国立自治大学伊斯塔卡拉校区牙周内科学专科培训项目为本视频制作提供的设施支持，并感谢牙科医生 Rosalba Yañez Ortiz 在本视频制作过程中给予的支持。部分插图使用 BioRender 程序绘制（协议编号 ME282NWCI1）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl 溶液 | PiSA | 冲洗上颌骨 | |
| 6-0 尼龙缝线 | Atramat, Internacional Farmacéutica | PE1946-N | 结扎放置 |
| Amscope 数码相机程序 3.7 | Amscope | x64, 4.11.21973.20230107 | 数据采集 |
| EDTA 溶液 | Sigma–Aldrich | E5134 | 脱钙 |
| 精细剪刀 | 通用 | 用于剪断 6-0 尼龙缝线 | |
| 精细组织镊 | 通用 | 操作 6-0 尼龙缝线 | |
| 纱布垫 | 通用 | 维持体温 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Prism | 版本 8.3.0 | 数据分析 |
| 羟丙基甲基纤维素 | 通用 | 眼部润滑剂 | |
| 注射用水 | Pisa | 麻醉溶液稀释 | |
| 氯胺酮 | Anesket, Pisa | 麻醉剂 | |
| 微量离心管 | Cellpro | 801501 | 脱钙过程中盛放组织 |
| 美皮护胶带 | 3M | 1533 | 固定小鼠 |
| 显微镜数码相机 | Amscope | MU1603 | 组织学 |
| 微量管 | Axygen | MCT-150-C | 储存麻醉稀释液 |
| 光学显微镜 | UNICO | 系列 G380 | 组织学 |
| 正畸弹性带 | TP Orthodintics, Inc | 蓝色 | 保持鼻部开放 |
| 多聚甲醛溶液 | Sigma–Aldrich | 158127 | 组织固定 |
| Paraplast | Leica | 39601006 | 组织学 |
| 手术显微镜 | Carl Zeiss GmbH Berlin | 6-0 尼龙缝线 | |
| 超细胰岛素注射器 6mm U-100, 0.3 mL | BD | 326385 | 注射麻醉溶液 |
| 通用橡胶带 | 通用 | 保持鼻部开放 | |
| 操作台 | 通用 | 用于支撑小鼠的木质底座 | |
| 赛拉嗪 | Porcin, Pisa | 麻醉前用药 |
参考文献
- Nazir, M., et al. Global prevalence of periodontal disease and lack of its surveillance. Sci World J. 2020 (1), 2146160(2020).
- Tonetti, M. S., Jepsen, S., Jin, L., Otomo-Corgel, J. Impact of the global burde....
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