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方法文章

上颌第二磨牙尼龙结扎诱导的小鼠重度牙周炎模型

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DOI：

10.3791/67848

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2025年5月30日

 ,  , 
1Undergraduate Program of Dental Surgeon, Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FES-Iztacala), Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Innate Immunity Laboratory, Biomedicine Research Unit (UBIMED), FES-Iztacala, UNAM, 3Doctoral Program in Biological Sciences, UNAM

通讯作者： Miriam Rodriguez-Sosa <rodriguezm@unam.mx>

本文内容

摘要

本研究描述了一种改良的6-0尼龙结扎法，用于在小鼠中诱导牙周炎，该方法具有高度可重复性，为研究人员提供了一种从疾病发生到病理后果全过程研究牙周病的替代方法。

摘要

牙周病（PD）是一种影响牙齿支持组织的炎症性疾病，也是全球最常见的疾病之一。其严重形式牙周炎可导致软组织、牙齿和骨组织的破坏。目前已使用灵长类动物、犬、小型猪和小鼠建立了牙周炎的动物模型。其中，结扎诱导的小鼠模型具有疾病进展迅速、可重复性高、可预测性强以及成本低等优势，同时能有效模拟人类牙周炎的关键特征。使用结扎法的小鼠模型已为牙周组织的微生物学和免疫学微环境提供了重要见解，突显了生物膜在免疫反应中的关键作用及其与全身性疾病的相关性。本研究介绍了一种改良的尼龙结扎法以诱导小鼠牙周炎。该改良方法采用尼龙缝线代替丝线，并将缝线置于邻面接触区下方，而非穿过接触点。该方法在有效诱导牙周炎的同时简化了操作技术。文中以图示方式详细展示了缝线放置的方法，并通过组织学和组织形态测量学分析展示了牙周炎的发展过程。

引言

牙周病（PD）是一种累及牙齿支持组织的炎症性疾病，是全球最常见的疾病之一1；据报道，全球PD的发病率在20%至50%之间2。PD具有不同程度的进展过程；其轻度形式称为牙龈炎，仅影响软组织，而其重度形式称为牙周炎（PT），会影响骨等硬组织3。由于PT是一种炎症性疾病，必须将其视为一种复杂的免疫反应，该反应可受多种风险因素的影响，从而改变疾病进程4，例如糖尿病5、心血管疾病6、激素相互作用（如不良妊娠结局7或子痫前期8）、炎症性疾病9，甚至眼部改变10或痴呆11。

因此，为了理解与胎膜早破（PT）的发生或流行相关的病因，测试新的或更有效的治疗策略，或确定全身性疾病与胎膜早破（PT）或牙周微生物群之间的任何关联，需要使用动物模型12。

选择一种有效的研究方法对于理解牙周炎（PT）的发生发展并充分回答研究问题至关重要13。多年来，已开发出多种用于PT研究的动物模型；然而，灵长类、犬、兔和小型猪等模型使用成本高且操作复杂14,15,16。小鼠PT模型，尤其是结扎诱导的PT模型，具有多种优势，包括疾病发展迅速、可重复性强、可预测性高以及成本低廉17,18,19。

尽管有多种方法可用于诱导牙周炎（PT），例如口服细菌接种、脂多糖注射以及结扎诱导10,20，但每种方法均有其优缺点17，其中通过尼龙结扎诱导的小鼠PT模型因其发病机制与人类相似而被广泛采用20,21,22,23。PT的发生是由于局部微生物群滞留，引发炎症反应，进而导致组织破坏。此外，小鼠可进行遗传修饰，以便研究与PT相关的特定细胞群体或分子。

可使用不同材料进行牙科结扎，例如正畸钢丝、丝线缝合线24,25或尼龙缝合线26。在小鼠中通过结扎诱导牙周炎（PT）最常用的材料是丝线；该方法已被多位作者描述过，例如 Marchesan 等人18、Abe 等人27以及 Chadwick 等人22，各自进行了不同的改良，且这些方法均已被多位研究人员成功应用28。然而，在小鼠上颌磨牙周围放置丝线缝合可能较为复杂。Marchesan 等人建议使用一种"结扎线夹持器"；Abe 等人和 Chadwick 等人则将缝合线穿过邻接点，其中 Chadwick 等人将其环绕在第一和第二磨牙（M1 和 M2）周围。

不同粗细的尼龙缝线已用于多种动物模型的PT（假性囊肿）模型构建29,30,31。Lima 等人31使用了5-0尼龙缝线；在先前的研究中，我们使用6-0尼龙缝线获得了类似的结果28。

与多股缝合线相比，尼龙缝合线为不可吸收的单股合成材料，引起的组织炎症反应较低32；此外，尼龙缝合线也容易导致微生物积聚33,34，已有证据表明具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和中间普氏菌（Porphyromona intermedia）35,36以及兼性厌氧菌可在尼龙缝合线上黏附定植12,14,17,19,24,27,35,37（表1）。

这些特性可能使炎症反应主要集中于细菌积聚，而非材料积聚。此外，尼龙的力学性能优于丝线，例如具有更高的抗拉强度38。

因此，在本研究中，将6-0尼龙缝线置于小鼠M2牙邻接点下方的牙周区域，可诱导产生晚期牙周炎。该方法可使用常规组织镊子进行结扎，结果具有一致性。30天后，可通过组织形态计量学和组织学分析确认牙周炎（PT）的发生。

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方案

所有涉及实验动物的操作均严格遵循《实验动物生物医学研究伦理框架》，并符合墨西哥官方标准NOM-062-ZOO-1999。本研究已获得墨西哥国立自治大学伊斯塔卡拉分校（FES-Iztacala）伦理委员会批准，批准编号为CE/FESI/072024/1765。小鼠饲养于FES-Iztacala动物实验设施内的动物房中，环境无特定病原体，可自由获取食物和水。本实验方案是在Abe等人先前描述的方法基础上进行的改进。276至8周龄雌性BALB/c小鼠（体重16 g）被分为对照组（CTL）和牙周炎组（PT）。通过在第0天放置6-0尼龙缝线以促进细菌持续黏附，诱导严重且慢性的牙周炎进展。30天后，所有小鼠均按照机构批准的方案实施安乐死，通过组织形态学分析评估组织损伤和附着丧失（AL）。图1）。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 麻醉准备

  1. 用注射用水配制赛拉嗪和氯胺酮的稀释液（1:10，作为储备液）。4 °C 保存，4 周内使用完毕。
  2. 识别并称量每只小鼠。根据体重配制赛拉嗪（1 mg/kg）和氯胺酮（2 mg/kg）的剂量，使用胰岛素注射器进行肌肉注射。
  3. 将麻醉液总剂量的 50% 注射至一侧后肢肌肉。在对侧重复该操作。
  4. 将小鼠放入一个较深的盒子（10 cm³）中，使其自然入睡，通常需要约 3–5 分钟。
  5. 为防止麻醉导致的眼睛干涩和角膜损伤，每 15 分钟向每只眼睛滴加一次羟丙甲纤维素滴眼液，直至小鼠完全清醒并能正常眨眼。
    注意：必须持续观察小鼠约 45 分钟，此为麻醉的持续时间。若小鼠在操作完成前苏醒，应暂停操作，并更换小鼠。

2. 动物体位

  1. 当小鼠进入睡眠状态后，将其仰面放置于工作台上，头部朝向操作者。轻轻拉直每条腿，但不要施加张力，并用微孔胶带固定四肢，以防止突然的不自主运动。用毯子或纱布覆盖小鼠，以维持其体温。
  2. 为保持口腔张开，将一根正畸弹性带的一端绕过上切牙，另一端无张力地固定在上方固定装置上。再将第二根正畸弹性带绕过下切牙，并通过橡皮筋将其固定在下方固定装置上。
  3. 放置颊部牵开器，并小心将舌头移向一侧，以获得更好的视野。
  4. 调整显微镜位置，确保能够清晰观察上颌磨牙，初始使用最低倍物镜。找到目标区域后，调节放大倍数，以确保操作者获得最佳的观察舒适度和聚焦效果。

3. 结扎线放置

  1. 当图像清晰后，辨认出三颗上颌磨牙：最大且位于近中的磨牙（M1）、中间的磨牙（M2）以及最小且位于远中的磨牙（M3）。使用6-0尼龙缝线，因其直径便于结扎操作，并比更粗的缝线对组织造成的机械损伤更小。
    1. 定位M2的远中侧，用组织镊夹住6-0尼龙缝线的线尖，从腭侧将线尖置于牙乳头基部。通过邻间隙腭侧基底部向颊侧表面施加轻柔压力（图2A）。
    2. 当6-0尼龙缝线穿过邻间隙后，将其从邻间隙中向颊侧拉出（图2B）。
  2. 从颊侧将6-0尼龙缝线的线尖置于M2近中面邻接区的基部。轻柔推动缝线尖端，使其穿过邻间隙下方，并从颊侧穿回至腭侧（图2C）。
  3. 轻柔牵拉6-0尼龙缝线，用组织镊夹住线尖，将其围绕M2调整到位，并以三个简单结扎结固定缝线。
  4. 用精细剪刀剪断6-0尼龙缝线（图2D）。

4. 动物恢复

  1. 释放小鼠时，首先取下下门齿周围的弹性固定带，然后移除颊部分隔器，取下腿部的微孔胶带，最后取下上门齿周围的弹性固定带。
    1. 将小鼠从工作台取下，用纱布或布包裹，并使其仰面放置。保持舌头偏向一侧，以维持气道通畅，防止阻塞。
  2. 保持动物温暖，用布或纱布覆盖，并在完全清醒前持续观察。随后将其放回常规饲养笼中。
  3. 在小鼠能够正常眨眼之前，每隔一段时间向每只眼睛滴加一滴羟丙基甲基纤维素（hypromellose）。
  4. 将动物置于标准饲养条件下饲养。

5. 结扎检查

  1. 每周检查一次尼龙结扎线的牢固性（图3A，B）。
  2. 取小鼠，牢固固定其头部和身体，用组织镊打开口腔，在灯光下观察M2牙周围的6-0尼龙缝线。
  3. 根据生物膜的积聚和机械刺激情况，确定牙周病的发生发展，并通过组织学分析加以验证。
    注意：根据对牙周炎发展过程中疼痛程度的理解，无需使用镇痛剂。

6. 组织学

  1. 30天后，将小鼠置于CO₂环境中实施安乐死2 腔室（遵循机构批准的方案）。按照先前报道的方法收获上颌骨39用0.9% NaCl溶液清洗收获的组织，并将其放入新的、标记好的微量离心管中。
  2. 在4%多聚甲醛溶液中固定样品，振荡孵育2小时。
  3. 用自来水冲洗样品 2 h。
  4. 为了去除骨组织中的矿物质并制备高质量的石蜡切片，将样品置于微量离心管中，用20倍体积的4% EDTA（pH 7.3）溶液脱钙20天，并定期更换 每4天更换一次EDTA40.
  5. 将样本包埋于石蜡中。切取M2区域5-µm厚的切片，并用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色&E)41.

7. 数据分析

  1. 在光学显微镜下观察染色的组织切片，对沟槽上皮、牙龈纤维、牙周纤维的构型变化、高度以及牙槽骨嵴完整性进行描述性分析。
  2. 通过测量釉牙骨质界（CEJ）与骨嵴最高点之间的距离来确定附着丧失（AL）。使用数字编辑程序在这两点之间绘制一条连线。根据Semenoff等人42所述的方法，在颊侧和腭侧表面进行组织形态测量分析（图4）。

8. 统计分析

  1. 使用 Mann-Whitney U 检验分析来自 CTL 和 PT 组的数据。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。使用统计学和绘图软件进行分析。

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结果

该方法可使小鼠从第二周开始诱导产生牙周炎（PT）。每周对小鼠进行监测，以确认结扎线的存在。在第30天实施安乐死。评估了所有组别的临床特征。对照组随时间推移保持正常的特征，如牙龈边缘的颜色和结构。与CTL组相比，PT组组织出现炎症、出血及牙周袋形成，这些变化在诱导小鼠的牙龈边缘处可见（图5）。

通过组织学和组织形态计量学分析两组M2牙周组织的附着水平（AL），证实了疾病的发展过程。对照组（CTL）呈现类似健康组织的组织学特征：边缘龈和龈沟上皮、牙龈纤维（图6A，CTL组蓝色箭头）、结合上皮以及牙槽嵴（图6A，CTL组绿色箭头）结构完整；结缔组织纤维位置和高度正常；沙比纤维（Sharpey's fibers）在牙槽骨和牙骨质处的插入点保持完整；根周厚度对称（图6A，CTL组橙色箭头），尤其在颊侧和腭侧附着区域表现明显。在牙周膜（PDL）纤维、结缔组织...

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讨论

已采用多种牙周炎动物模型来评估不同方面，例如微生物学和免疫应答，并且这些模型在某些方面与人类疾病具有相似性43。这些发现为牙周病的机制框架提供了证据，例如生物膜的作用、免疫应答以及与全身状况的相互作用44,45。

牙周炎的动物模型具有不同的复杂性和相似性；例如，非人灵长类动物、狗或小型猪与人类牙周病最为相似19，但其饲养和维护成本高昂且要求较高，使得这些模型难以广泛应用。此外，小鼠牙周炎模型成本较低且易于操作。同时，小鼠可通过基因改造以生成特定的分子或目标细胞46，且相关技术已十分成熟47。

尽管小鼠不会自然发生牙周炎（PT），但可通过不同方法诱导产生；其中最常用的是结扎诱导模型，该模型具有高度可重复性

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披露

作者声明，本文发表不存在利益冲突。

致谢

本工作部分由墨西哥州科学技术委员会（COMECYT）资助项目 [FICDTEM-2021-072] 以及墨西哥国立自治大学研究与技术创新支持计划（PAPIIT）-UNAM 资助项目 [IN-217021] 提供经费支持。我们感谢墨西哥国立自治大学伊斯塔卡拉校区牙周内科学专科培训项目为本视频制作提供的设施支持，并感谢牙科医生 Rosalba Yañez Ortiz 在本视频制作过程中给予的支持。部分插图使用 BioRender 程序绘制（协议编号 ME282NWCI1）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% NaCl 溶液 PiSA冲洗上颌骨 
6-0 尼龙缝线Atramat, Internacional FarmacéuticaPE1946-N结扎放置
Amscope 数码相机程序 3.7Amscope x64, 4.11.21973.20230107数据采集
EDTA 溶液 Sigma–AldrichE5134脱钙 
精细剪刀通用用于剪断 6-0 尼龙缝线
精细组织镊通用操作 6-0 尼龙缝线
纱布垫通用维持体温 
GraphPad Prism GraphPad Prism 版本 8.3.0数据分析 
羟丙基甲基纤维素通用 眼部润滑剂
注射用水Pisa麻醉溶液稀释
氯胺酮Anesket, Pisa麻醉剂
微量离心管 Cellpro801501脱钙过程中盛放组织 
美皮护胶带3M 1533固定小鼠
显微镜数码相机Amscope MU1603组织学 
微量管AxygenMCT-150-C储存麻醉稀释液
光学显微镜 UNICO系列 G380组织学 
正畸弹性带TP Orthodintics, Inc 蓝色保持鼻部开放 
多聚甲醛溶液Sigma–Aldrich158127组织固定 
Paraplast Leica39601006组织学 
手术显微镜 Carl Zeiss GmbH Berlin6-0 尼龙缝线
超细胰岛素注射器 6mm U-100, 0.3 mLBD326385注射麻醉溶液 
通用橡胶带 通用保持鼻部开放 
操作台通用 用于支撑小鼠的木质底座 
赛拉嗪Porcin, Pisa麻醉前用药

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小鼠牙周炎模型牙周病结扎诱导性牙周炎生物膜形成组织学分析附着丧失牙槽骨吸收炎症反应小鼠口腔手术
上颌第二磨牙尼龙结扎诱导的小鼠重度牙周炎模型
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