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方法文章

利用表面等离子共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂

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DOI：

10.3791/67859

⸱

2025年5月2日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Rhode Island

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用表面等离子共振技术检测PD-1/PD-L1抑制剂的阻断实验。该方法采用两步固定策略和定制的缓冲体系，精确测量响应单位，从而便于评估化合物或生物制剂的阻断率。此外，该方法还支持对PD-1/PD-L1抑制剂进行高通量筛选。

摘要

阻断PD-1/PD-L1相互作用是癌症免疫治疗的一种有前景的策略。可靠的筛选平台对于评估PD-1/PD-L1抑制剂的效力至关重要。此前建立的一种利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术的人源PD-1/PD-L1阻断检测方法（第一代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其结果与均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）和基于细胞的检测方法相当，并具备大规模筛选的潜力。本文介绍该检测方法的优化版本（第二代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其采用双步偶联工艺，结合胺偶联与生物素-链霉亲和素偶联，以增强PD-1在芯片上的取向控制，并减少PD-1蛋白的消耗。该更新后的平台使用PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1166进行了成功验证，显示出与先前基于SPR的方法以及其他成熟技术（如ELISA）相当的阻断效果。这些结果证实了该方法的可靠性。该优化的SPR筛选平台为发现新型PD-1/PD-L1抑制剂提供了高通量且可靠的工具，有助于推动癌症免疫治疗研究，并凸显了SPR技术在免疫检查点抑制剂筛选中的潜力。

引言

免疫检查点阻断疗法，特别是靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）的疗法，处于癌症免疫治疗策略的前沿。抗PD-1/PD-L1疗法已获批准用于多种癌症类型，包括血液系统、皮肤、肺、肝、膀胱和肾癌1。PD-1是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，其特征是N端具有一个免疫球蛋白可变区（IgV）样结构域，其后是由约20个氨基酸组成的茎区，将IgV结构域与质膜分隔开，接着是跨膜结构域，以及含有基于酪氨酸的信号基序的胞质尾部2。PD-L1被确认为PD-1的配体之一，是一种I型跨膜蛋白，包含一个跨膜区、两个胞外结构域——免疫球蛋白恒定区（IgC）和IgV结构域——以及一个相对较短的胞质结构域，可触发细胞内信号通路3。PD-1/PD-L1抑制性通路作为关键的免疫检查点，调控T细胞活化和自身免疫反应4。PD-1在T细胞上表达，与PD-L1结合后可抑制T细胞受体信号传导，并阻断抗原呈递细胞和T细胞上CD28与CD80分子的共刺激作用5。在免疫逃逸阶段，肿瘤组织通过过度表达PD-L1来利用这一生理机制，从而形成免疫抑制微环境，促进肿瘤生长和进展6。PD-1和PD-L1抑制剂可阻断这一相互作用，使免疫系统能够摆脱肿瘤诱导的抑制状态，重新启动T细胞介导的肿瘤细胞死亡过程7。

在免疫检查点阻断疗法奠定的重要基础上，PD-1/PD-L1抑制剂的开发标志着癌症免疫治疗领域的重大进展。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了九种专门靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。其中包括六种PD-1抑制剂——帕博利珠单抗（pembrolizumab）、多塔利单抗（dostarlimab）、纳武利尤单抗（nivolumab）、西米普利单抗（cemiplimab）、奥瑞帕利单抗（oripalimab）和替雷利珠单抗（tislelizumab），以及三种PD-L1抑制剂——阿替利珠单抗（atezolizumab）、阿维鲁单抗（avelumab）和度伐利尤单抗（durvalumab）8,9。这些疗法已被有效用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、宫颈癌、胃癌或胃食管交界处癌以及其他实体瘤10。尽管疗效显著，基于单克隆抗体的治疗仍面临诸多局限性，例如应答率低、成本高昂、半衰期长、严重的免疫相关不良事件，以及仅限于静脉或皮下给药方式11,12,13。因此，研究日益聚焦于开发靶向PD-1/PD-L1轴的小分子抑制剂。这类小分子具有独特优势，如更好的细胞穿透能力、可调节多种生物学靶点、更高的口服生物利用度以及更低的成本，旨在实现与现有疗法相当的治疗效果，同时减少不良反应14。然而，靶向PD-1/PD-L1相互作用的小分子抑制剂仍处于早期研发阶段，主要原因是缺乏可靠的高通量筛选平台。此类平台对于快速评估大量小分子化合物库并识别出可用于进一步验证和优化的先导化合物至关重要。克服这一挑战对于推动癌症免疫治疗的发展具有关键意义。

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术被广泛用于检测多种生物分子，包括抗体抗原、酶、核酸和药物，在小分子药物筛选中尤为有效15,16。与其他生物物理技术相比，SPR具有无需标记、可提供实时动力学数据以及检测范围广等优势。相比之下，等温滴定 calorimetry（ITC）缺乏实时动力学信息，且需要较大的样品体积，限制了通量；微尺度热泳（Microscale Thermophoresis, MST）易受缓冲液干扰，且无法提供动力学数据；生物层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）则因分子大小和性质不同而存在应用局限性；均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）需要标记，且易受荧光干扰。我们承认HTRF也是探索PD-1/PD-L1抑制剂的合适技术之一，但与SPR相比，HTRF存在固有局限性，例如分子内激发过程可能因外部相互作用（如电子转移、FRET和漂白）导致荧光猝灭，且由于信号窗口较窄，在药物筛选过程中灵敏度较低，并易受荧光文库化合物或生物蛋白的干扰17。这些特点使SPR成为药物发现中的更优工具。我们先前的研究已证明，SPR能够测定小分子对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效应，相较于其他需要高标记技术要求、多步骤操作、特异性差且成本高的技术，SPR在药物发现过程中具有明显优势18。

本研究介绍了一种经过优化的基于表面等离子体共振（SPR）的检测平台，该平台整合了双步偶联过程，结合使用胺偶联和生物素-链霉亲和素偶联，以增强PD-1在芯片上的定向固定，同时最大限度减少蛋白用量。该改进方法已使用PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1166作为阳性对照结合物成功验证，结果显示其阻断效果与我们先前的SPR方法以及其他成熟技术（如ELISA19,20）相当。这不仅证实了本实验方案的可靠性与可重复性，也展示了改进后平台在高通量筛选PD-1/PD-L1抑制剂方面的有效性。通过引入生物素-链霉亲和素捕获步骤，实现了蛋白质的定点固定而非随机取向，从而降低了PD-1的使用浓度（40 µg/mL vs. 10 µg/mL），并通过允许终端用户将链霉亲和素（SA）固定于CM5芯片上，节省了成本——这是一种比商业化预固定SA芯片更经济的替代方案。因此，该方法适用于对化合物/多肽文库进行大规模、低成本的筛选。尽管仍需借助in silico、in vitro和in vivo等其他表征手段来评估PD-1/PD-L1抑制剂在抗癌方面的临床潜力，但本优化的基于SPR的筛选平台仍是开展PD-1/PD-L1抑制剂大规模筛选的高效工具。

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方案

试剂和设备列在材料表中。

1. 在CM5芯片上固定链霉亲和素（SA）蛋白

  1. 在 SPR 仪器上设置固定化方法： 新建向导 模板，选择 固定化，将芯片类型设置为 CM5，以及每个循环的流路细胞数 1检查 固定流通池1和流通池2.
    1. 设置 胺 采用固定化方法。设定固定化水平目标及配体浓度： 40 µg/mL 链霉亲和素, 目标水平： 2000 RU，洗涤液： 50 mM NaOH接下来，运行前请检查进样系统。
  2. 准备以下试管：R2 B1 和 R2 C1 - 40 µg/mL 链霉亲和素；R2 B2 和 R2 C2：50 mM NaOH；R2 B3 和 R2 C3：EDC；R2 B4 和 R2 C4：NHS；R2 B5 和 R2 C5：空；R2 B6 和 R2 C6：乙醇胺。
    注意：EDC 和 NHS 可激活 CM5 芯片上的羧基，从而与配体上的氨基发生共价偶联。乙醇胺用作封闭缓冲液，以防止固定化过程中发生非特异性结合。
  3. 将 20 mL HBS-EP+ 缓冲液稀释 10 倍× 在180 mL去离子水（DI水）中配制200 mL的1× HBS-EP+ 运行缓冲液溶液
  4. 向1 mg链霉亲和素中加入1 mL无DNase的水，在室温下孵育30分钟。随后将链霉亲和素溶液稀释至40 µg/mL 的乙酸盐缓冲液（pH 4.5）中。根据生产商说明书配制胺偶联试剂盒的试剂，并按照步骤 1.2 所示放置所有相关试剂的位置。
  5. 将维护用传感器芯片更换为CM5芯片，然后将A管放入已准备好的1× HBS-EP+ 缓冲液，重新打开固定化方法，并按照步骤 1.2 的布局插入管子。 运行 该方法并保存结果文件。
  6. 运行后维护：将CM5芯片更换为维护用传感器芯片，将A管放入盛有去离子水的瓶子中，运行引液程序。取出CM5芯片后，用数滴去离子水清洗芯片表面，并自然晾干。将芯片置于50 mL离心管中，于4 °C保存。 °C.
    注意：固定的SA使CM5芯片具备SA芯片的功能。

2. 在SA芯片上固定PD-1蛋白

  1. 在 SPR 仪器上设置固定化方法：打开/新建向导模板，选择固定化，将芯片类型设为SA，每循环流路细胞数设为1。勾选固定化流路细胞 1 和细胞 2。
    1. 将方法设为SA-生物素捕获。细胞 1 设置为空白固定化，细胞 2 设置目标固定化水平，配体为10 µg/mL PD-1，目标水平：4000 RU，然后勾选运行前预润洗。
      注意：准备以下试管 — R2 B1 和 R2 C1：1 M NaCl，50 mM NaOH；R2 B2 和 R2 C2：50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl；R2 C3：10 µg/mL PD-1。
  2. 将 58.44 mg NaCl 溶解于 1 mL 50 mM NaOH 中，配制 1 M NaCl 和 50 mM NaOH 溶液。将 58.44 mg NaCl 和 4.0 mg NaOH 溶解于 500 µL 水中，然后加入 500 µL 异丙醇，配制 50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl 溶液。
  3. 配制 PD-1 溶液：向 100 µg 生物素化人 PD-1（Fc 和 Avitag 标记）中加入 200 µL 无 DNase 水，室温稳定 30 分钟，然后用乙酸盐缓冲液（pH 5.0）稀释至 10 µg/mL。
  4. 按照步骤 2.1 所述放置所有试剂布局。将 A 管放入 1× HBS-EP+ 运行缓冲液中，弹出维护用传感器芯片并插入 SA 芯片（即步骤 1 中由链霉亲和素蛋白包被的 CM5 芯片）。重新打开固定化方法，插入试剂架 2，并核对位置，然后运行该方法，运行时间按预估时间执行。
  5. 重复步骤 1.6。

3. PD-1 与 PD-L1 的再生条件筛选

  1. 设置再生筛选方法：打开/新建向导模板，选择再生筛选，设置流路：2-1, 4-3，芯片类型为SA，勾选运行前平衡循环，记录溶液为 HBS-EP+，接触时间为30 s，注射次数为3，溶液为PD-L1，接触时间：30 s，流速：30 µL/min。
    1. 对于再生参数，流速为30 µL/min，稳定时间为300 s。在实验设计中，设置条件数量为4，每种条件的循环次数为2。设置条件为4种，再生溶液：甘氨酸 1.5, 2.0, 2.5, 3.0，接触时间：30 s，然后在运行前勾选预冲洗。
  2. 将每种 PD-L1 浓度设置为 96 孔微孔板布局中的独立样品孔位置：R1 A1 至 R1 A9：1 µM PD-L1；R1 A10 至 R1 A12：HBS-EP+ 缓冲液；R1 B1：甘氨酸 1.5；R1 B2：甘氨酸 2；R1 B3：甘氨酸 2.5；R1 B4：甘氨酸 3。
    注意：使用不同 pH 的甘氨酸缓冲液作为再生缓冲液。
  3. 配制 PD-L1 溶液：向 100 µg 人 PD-L1 Fc 标签蛋白（9.42 µM）中加入 200 µL 无 DNase 水，然后用 HBS-EP+ 缓冲液稀释至 1 µM。
  4. 按照步骤 3.2 所述，将所有相关试剂放置在指定位置。将 A 管放入 1× HBS-EP+ 缓冲液中，然后将维护用传感器芯片更换为 SA 芯片。重新打开再生筛选方法，根据步骤 3.2 的管路位置插入试剂架，然后运行该方法，运行时间按预估时间执行。
  5. 重复步骤 1.6。

4. PD-1/PD-L1 相互作用的验证

注意：验证实验参照先前已发表的文献18，并进行了少量调整。

  1. 使用与已发表报告相同的参数 常规设置，实验步骤，以及 循环类型，将接触时间设置为 60 秒解离时间 60 秒，以及流速 30 µL/min. 在 方法变量，评估变量 以及 命令，使用相同的设置，但以甘氨酸 2.0 取代 再生，设置流速为 30 µL/min，依次流经通道1、2、3、4。
    1. 然后设置 运行，并选择流路： 2-1, 4-3. 输入浓度从 0 开始的 PD-L1 µM, 0.037 µM, 0.111 µM, 0.333 µM，分子量为51,300 Da。运行前请核对所有检测步骤并选择进样。
    2. 然后在试剂架2布局中将每种PD-L1浓度设置为独立的样品孔位：R2 B1：PD-L1 0 µM；R2 B2：PD-L1 0.037 µM；R2 B3：PD-L1 0.111 µM；R2 B4：PD-L1 0.333 µM；R2 A1：以甘氨酸 2.0 作为再生缓冲液；R2 A2：以 HBS-EP+ 作为启动缓冲液。
  2. 准备 200 mL 的 1× HBS-EP+ 运行缓冲液溶液。配制 PD-L1 浓度：将 PD-L1 蛋白稀释至 9.42 µM 到 0.333 µM, 0.111 µM，以及 0.037 µM 的 HBS-EP+ 缓冲液中，然后按照步骤 4.1.2 所述将所有相关试剂放入布局中。
    1. 将试管 A 插入 1× HBS-EP+ 运行缓冲液溶液，弹出维护传感器芯片，插入 SA 芯片。重新打开 再生 scouting 方法，按照步骤 4.1 的管路定位，插入试剂架 2，并 运行 估算持续时间的方法。
  3. 重复步骤 1.6。

5. 使用小分子抑制剂 BMS-1166 的 PD-1/PD-L1 阻断实验

注意：阻断实验参照先前发表的文献18，并进行了少量调整。

  1. 使用与已发表报告相同的参数 常规设置，实验步骤，以及 循环类型，将接触时间设置为 60 秒解离时间至 60 秒，流速为30 µ升/分钟。在 方法变量，评估变量 和 命令 也使用相同的设置，但以甘氨酸 2.0 取代 再生，设置流速为 30 µL/min，依次流经通道1、2、3、4。
    1. 然后设置运行，并选择流路： 2-1, 4-3. 加入样品溶液：PD-L1（0.111 µM，分子量为 51,300 Da）与 BMS-1166 在 0 µM, 0.125 µM, 0.625 µM, 3.125 µM. 检查所有检测步骤以进行验证，并在运行前选择清洗。
    2. 然后在试剂架2布局中将每种PD-L1浓度设置为独立的样品孔位：R2 B1：PD-L1（0.111 µM) + BMS-1166 0 µM R2 B2：PD-L1（0.111 µM) + BMS-1166 0.125 µM；R2 B3：PD-L1（0.111 µM) + BMS-1166 0.625 µM；R2 B4：PD-L1（0.111 µM) + BMS-1166 3.125 µM；R2 A1：再生用甘氨酸 2.0。
  2. 准备 200 mL 的 1× HBS-EP+ 流动缓冲液溶液。配制 BMS-1166/PD-L1 混合物：将 5 mg BMS-1166 溶于 77.99 µL 二甲基亚砜（DMSO）配制 100 mM 储备液。用 PD-L1 蛋白（0.11 µM）稀释至 BMS-1166 的目标浓度 0 µM, 0.125 µM, 0.625 µM 和 3.125 µM in HBS-EP+。按照步骤5.1.2所述放置所有相关试剂。
    1. 将试管 A 放入 1× HBS-EP+ 运行缓冲液溶液，然后弹出维护用传感器芯片并插入 SA 芯片。重新打开 再生 scouting 方法，按照5.1中的管位，插入试剂架2，然后 运行 估算运行时间的方法。
  3. 重复步骤 1.6。

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结果

SA在CM5芯片上的固定
数据被分析 通过 SPR 仪器及其相关分析软件的输出结果，表明在流通池 1 和流通池 2 上成功实现了目标响应单位（2000 RU）的链霉亲和素（SA）蛋白固定。流通池 1 和 2 已固定 SA（40 μg/mL) 在CM5芯片表面，1号流路的最终响应值为1902.3 RU图1A）以及 1900.7 RU 在 2 号流通池（图1B).

PD-1 在 SA 芯片上的固定
基于 SPR 仪器及其配套软件输出结果的数据分析显示，1 号流通池的空白对照组响应单位（RU）较低，2 号流通池中的 PD-1 配体成功达到目标 RU 值（4000 RU）。1 号流通池作为空白固定，最终响应值为 -161.0 RU（图 2A）；2 号流通池则固定了包被在 SA 芯片上的生物素化 PD-1 蛋白（1...

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讨论

近几十年来，包括癌症疫苗、免疫检查点抑制剂和CAR T细胞疗法在内的多种免疫治疗策略已显著推动了癌症治疗的发展21。免疫检查点在防止病原体反应过程中免疫细胞介导的附带损伤以及抑制自身免疫方面发挥着关键作用。其中一个典型例子是PD-L1与PD-1之间的相互作用，该作用构成主要的免疫检查点通路，使癌细胞能够逃避免疫监视。针对PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体在临床肿瘤学中已取得显著疗效。然而，由于单克隆抗体疗法存在诸多局限性，且免疫相关不良事件的发生率不断上升，目前人们越来越关注开发靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂9,22。

目前针对小分子PD-1/PD-L1抑制剂的筛选策略主要集中在生物测定技术，如ELISA、基于细胞的报告基因检测和T细胞检测。表面等离子共振（SPR）和生物膜干涉技术（BLI）等生物物理技术虽广泛用于结合亲和力的表征，但其作为筛选工具的潜力仍被低估23

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢罗德岛大学RI-INBRE核心设施的支持，该设施由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家研究资源中心（NCRR）资助（资助号：P20GM103430）。本研究得到了罗德岛大学药学院试点资助奖、罗德岛生命科学中心（RILSH）小型资助奖以及罗德岛基金会资助的支持，上述资助均授予刘畅博士（Chang Liu, Ph.D.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mM NaOHCytiva Life Sciences100358
50 mM NaOHFisher Scientific905376
96孔聚苯乙烯微孔板Cytiva Life SciencesBR100503
胺偶联试剂盒Cytiva Life Sciences35120
Biacore T200 SPR 系统及 Evaluation Software 3.2Cytiva Life Sciences28975001
生物素化人 PD-1 Fc Avitag 蛋白Acro BiosystemsPD1-H82F1
BMS1166MedChemExpressHY-102011
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich276855
无DNase水Fisher Scientific188506
甘氨酸 1.5Cytiva Life SciencesBR100354
甘氨酸 2.0Cytiva Life SciencesBR100355
甘氨酸 2.5Cytiva Life SciencesBR100356
甘氨酸 3.0Cytiva Life SciencesBR100357
HBS-EP+ 缓冲液Cytiva Life SciencesBR100669
人 PD-L1 Fc 标签蛋白Acro BiosystemsPD-1-H5258
异丙醇Fisher ScientificBP2618-1
96孔微孔板封口箔 Cytiva Life Sciences28975816
NaClSigma-Aldrich746398
7 mm 塑料小瓶Cytiva Life SciencesBR100212
橡胶盖，3型Cytiva Life SciencesBR100502
Series S CM5 传感器芯片Cytiva Life Sciences29149603
醋酸钠 4.5Cytiva Life Sciences100350
醋酸钠 5.0Cytiva Life Sciences100351
链霉亲和素Sigma-AldrichS4762

参考文献

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