本方案描述了一种利用表面等离子共振技术检测PD-1/PD-L1抑制剂的阻断实验。该方法采用两步固定策略和定制的缓冲体系，精确测量响应单位，从而便于评估化合物或生物制剂的阻断率。此外，该方法还支持对PD-1/PD-L1抑制剂进行高通量筛选。
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摘要
摘要
阻断PD-1/PD-L1相互作用是癌症免疫治疗的一种有前景的策略。可靠的筛选平台对于评估PD-1/PD-L1抑制剂的效力至关重要。此前建立的一种利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术的人源PD-1/PD-L1阻断检测方法（第一代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其结果与均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）和基于细胞的检测方法相当，并具备大规模筛选的潜力。本文介绍该检测方法的优化版本（第二代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其采用双步偶联工艺，结合胺偶联与生物素-链霉亲和素偶联，以增强PD-1在芯片上的取向控制，并减少PD-1蛋白的消耗。该更新后的平台使用PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1166进行了成功验证，显示出与先前基于SPR的方法以及其他成熟技术（如ELISA）相当的阻断效果。这些结果证实了该方法的可靠性。该优化的SPR筛选平台为发现新型PD-1/PD-L1抑制剂提供了高通量且可靠的工具，有助于推动癌症免疫治疗研究，并凸显了SPR技术在免疫检查点抑制剂筛选中的潜力。
引言
免疫检查点阻断疗法，特别是靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）的疗法，处于癌症免疫治疗策略的前沿。抗PD-1/PD-L1疗法已获批准用于多种癌症类型，包括血液系统、皮肤、肺、肝、膀胱和肾癌1。PD-1是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，其特征是N端具有一个免疫球蛋白可变区（IgV）样结构域，其后是由约20个氨基酸组成的茎区，将IgV结构域与质膜分隔开，接着是跨膜结构域，以及含有基于酪氨酸的信号基序的胞质尾部2。PD-L1被确认为PD-1的配体之一，是一种I型跨膜蛋白，包含一个跨膜区、两个胞外结构域——免疫球蛋白恒定区（IgC）和IgV结构域——以及一个相对较短的胞质结构域，可触发细胞内信号通路3。PD-1/PD-L1抑制性通路作为关键的免疫检查点，调控T细胞活化和自身免疫反应4。PD-1在T细胞上表达，与PD-L1结合后可抑制T细胞受体信号传导，并阻断抗原呈递细胞和T细胞上CD28与CD80分子的共刺激作用5。在免疫逃逸阶段，肿瘤组织通过过度表达PD-L1来利用这一生理机制，从而形成免疫抑制微环境，促进肿瘤生长和进展6。PD-1和PD-L1抑制剂可阻断这一相互作用，使免疫系统能够摆脱肿瘤诱导的抑制状态，重....
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方案
试剂和设备列在材料表中。
1. 在CM5芯片上固定链霉亲和素（SA）蛋白
- 在 SPR 仪器上设置固定化方法： 新建向导 模板，选择 固定化，将芯片类型设置为 CM5，以及每个循环的流路细胞数 1检查 固定流通池1和流通池2.
- 设置 胺 采用固定化方法。设定固定化水平目标及配体浓度： 40 µg/mL 链霉亲和素, 目标水平： 2000 RU，洗涤液： 50 mM NaOH接下来，运行前请检查进样系统。
- 准备以下试管：R2 B1 和 R2 C1 - 40 µg/mL 链霉亲和素；R2 B2 和 R2 C2：50 mM NaOH；R2 B3 和 R2 C3：EDC；R2 B4 和 R2 C4：NHS；R2 B5 和 R2 C5：空；R2 B6 和 R2 C6：乙醇胺。
注意：EDC 和 NHS 可激活 CM5 芯片上的羧基，从而与配体上的氨基发生共价偶联。乙醇胺用作封闭缓冲液，以防止固....
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结果
SA在CM5芯片上的固定
数据被分析 通过 SPR 仪器及其相关分析软件的输出结果，表明在流通池 1 和流通池 2 上成功实现了目标响应单位（2000 RU）的链霉亲和素（SA）蛋白固定。流通池 1 和 2 已固定 SA（40 μg/mL) 在CM5芯片表面，1号流路的最终响应值为1902.3 RU图1A）以及 1900.7 RU 在 2 号流通池（图1B).
PD-1 在 SA 芯片上的固定
基于 SPR 仪器及其配套软件输出结果的数据分析显示，1 号流通池的空白对照组响应单位（RU）较低，2 号流通池中的 PD-1 配体成功达到目标 RU 值（4000 RU）。1 号流通池作为空白固定，最终响应值为 -161.0 RU（图 2A）；2 号流通池则固定了包被在 SA 芯片上的生物素化 PD-1 蛋白（1.......
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讨论
近几十年来，包括癌症疫苗、免疫检查点抑制剂和CAR T细胞疗法在内的多种免疫治疗策略已显著推动了癌症治疗的发展21。免疫检查点在防止病原体反应过程中免疫细胞介导的附带损伤以及抑制自身免疫方面发挥着关键作用。其中一个典型例子是PD-L1与PD-1之间的相互作用，该作用构成主要的免疫检查点通路，使癌细胞能够逃避免疫监视。针对PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体在临床肿瘤学中已取得显著疗效。然而，由于单克隆抗体疗法存在诸多局限性，且免疫相关不良事件的发生率不断上升，目前人们越来越关注开发靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂9,22。
目前针对小分子PD-1/PD-L1抑制剂的筛选策略主要集中在生物测定技术，如ELISA、基于细胞的报告基因检测和T细胞检测。表面等离子共振（SPR）和生物膜干涉技术（BLI）等生物物理技术虽广泛用于结合亲和力的表征，但其作为筛选工具的潜力仍被低估23
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢罗德岛大学RI-INBRE核心设施的支持，该设施由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家研究资源中心（NCRR）资助（资助号：P20GM103430）。本研究得到了罗德岛大学药学院试点资助奖、罗德岛生命科学中心（RILSH）小型资助奖以及罗德岛基金会资助的支持，上述资助均授予刘畅博士（Chang Liu, Ph.D.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mM NaOH | Cytiva Life Sciences | 100358 | |
| 50 mM NaOH | Fisher Scientific | 905376 | |
| 96孔聚苯乙烯微孔板 | Cytiva Life Sciences | BR100503 | |
| 胺偶联试剂盒 | Cytiva Life Sciences | 35120 | |
| Biacore T200 SPR 系统及 Evaluation Software 3.2 | Cytiva Life Sciences | 28975001 | |
| 生物素化人 PD-1 Fc Avitag 蛋白 | Acro Biosystems | PD1-H82F1 | |
| BMS1166 | MedChemExpress | HY-102011 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 无DNase水 | Fisher Scientific | 188506 | |
| 甘氨酸 1.5 | Cytiva Life Sciences | BR100354 | |
| 甘氨酸 2.0 | Cytiva Life Sciences | BR100355 | |
| 甘氨酸 2.5 | Cytiva Life Sciences | BR100356 | |
| 甘氨酸 3.0 | Cytiva Life Sciences | BR100357 | |
| HBS-EP+ 缓冲液 | Cytiva Life Sciences | BR100669 | |
| 人 PD-L1 Fc 标签蛋白 | Acro Biosystems | PD-1-H5258 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| 96孔微孔板封口箔 | Cytiva Life Sciences | 28975816 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 7 mm 塑料小瓶 | Cytiva Life Sciences | BR100212 | |
| 橡胶盖，3型 | Cytiva Life Sciences | BR100502 | |
| Series S CM5 传感器芯片 | Cytiva Life Sciences | 29149603 | |
| 醋酸钠 4.5 | Cytiva Life Sciences | 100350 | |
| 醋酸钠 5.0 | Cytiva Life Sciences | 100351 | |
| 链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | S4762 |
参考文献
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Zhang, X., et al. Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1. Immunity. 20 (3), 337-347 (2004).
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重印与许可
