干旱胁迫下表达拟南芥DREB1A的转基因甘蔗光合作用增强及水分利用效率提高

摘要

本研究评估了转录因子 Arabidopsis DREB1A 介导的转基因甘蔗抗旱性。在胁迫条件下，观察到光合作用增强、水分利用效率提高以及生物量积累增加。其中，DR-21 株系表现出最高的 DREB1A 表达水平，显著提升了抗旱能力。该研究结果揭示了相关分子机制，为在水资源有限地区培育抗逆性强的甘蔗品种提供了潜在策略。

摘要

干旱胁迫严重限制了甘蔗的生产力，因此需要培育抗逆性强的品种以实现农业的可持续发展。本研究旨在通过导入由胁迫诱导型 rd29A 启动子调控的 Arabidopsis DREB1A 基因，提高甘蔗的抗旱性。通过粒子轰击介导的转化方法获得了转基因甘蔗株系，并在受控条件和干旱胁迫条件下，通过分子、生理及农艺性状评估对其进行了系统分析。

分子分析证实了外源基因的稳定整合，转基因株系中DREB1A的表达量相较于野生型植株最高增加了10倍。生理学评估显示，在60%田间持水量（FC）的干旱胁迫条件下，转基因株系的光合速率（P_N）比非转基因对照高224–270%，气孔导度（g_s）提高84–167%，相对含水量（RWC）提升25–31%。此外，转基因甘蔗叶片表现出更优的渗透调节能力和水分利用效率。农艺性状评价进一步表明，植株生长和生产力显著改善。在干旱胁迫（60% FC）下，转基因株系的茎秆高度增加76–109%，茎秆直径增大71–86%；地上部生物量增加39–87%，根系生物量提高65–103%。

此外，在60%田间持水量（FC）条件下，转基因植株的糖度（Brix值）——反映蔗糖积累的指标——提高了36–55%。这些结果明确了DREB1A基因表达、生理抗逆性增强与干旱条件下农艺性状改善之间的显著相关性。DREB1A表达型转基因甘蔗在干旱胁迫下维持较高光合作用活性、更优的水分利用效率以及更多的生物量积累，凸显了其作为培育抗旱甘蔗品种遗传策略的潜力。本研究为解析干旱耐受性的分子机制提供了新的见解，并为保障水资源匮乏地区甘蔗的可持续种植提供了有前景的途径。

引言

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是巴基斯坦第二大经济作物，主要因其富含蔗糖而被广泛种植。然而，由于周期性缺水，其产量往往难以达到最佳水平^1,2。甘蔗属于禾本科（Poaceae）植物，归类于黍亚科（Panicoideae）中的PACCAD分支³。该分支的植物通常被称为暖季型禾草，具有C₄光合作用系统⁴。甘蔗的主要CO₂固定途径为C₄光合作用，其光呼吸作用极低⁵。与C₃禾草相比，C₄禾草（如甘蔗）能够固定更多的CO₂，产生更高的蔗糖含量，并表现出更优的氮素利用效率（NUE）和水分利用效率（WUE）^6,7,8。然而，甘蔗对土壤水分的需求较高^9,10,11。

由于气候变化和水资源有限，培育高产且耐水分胁迫的甘蔗品种至关重要^12,13,14。植物对水分胁迫的耐受性是一种受胁迫强度、发生时间和持续时间影响的多基因性状。由于巴基斯坦的地理位置（30.3753° N, 69.3451° E），其甘蔗开花率低且花粉活力差，使得常规育种方法难以实施¹⁵。因此，通过传统育种进行品种改良依赖于遗传变异以及对目标农艺性状的后续选择¹⁶。在此背景下，通过基因工程导入与胁迫相关的基因是提高植物抗逆性最具前景的替代策略之一^17,18,19。

植物的非生物胁迫响应受多个转录因子（TF）家族和顺式作用元件的调控，包括WRKY、MYB、bHLH、ERF和NAC。这些转录因子调控渗透调节、活性氧（ROS）清除、气孔调节以及胁迫信号通路的网络^{20,21,22,23,24,25,26}。例如，WRKY转录因子通过依赖ABA的途径调节胁迫信号，而MYB蛋白在干旱胁迫下调控类黄酮生物合成和气孔功能²⁷。类似地，bHLH和ERF因子与乙烯信号通路相互作用，从而增强抗旱能力²⁸。鉴于胁迫响应的复杂性，靶向DREB1A等关键调控因子是提高抗旱性的有效策略。

本研究探讨了转ArabidopsisDREB1A基因甘蔗中DREB1A基因的作用，重点分析其在水分胁迫条件下对光合作用、水分关系及产量性状的影响。此前已有报道指出，DRE结合蛋白（DREB）在调控植物耐旱性方面具有重要作用^27,29,30。例如，Kasuga 等人发现，DREB 能够正向调控拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 DRE 序列的表达³¹。此外，许多研究人员提出，过表达DREB1A的转基因甘蔗能够组成型表达胁迫诱导型基因，并且其糖含量高于野生型甘蔗^17,28,32,33。

方案

生成 rd29A: DREB1A 表达载体（图1)
全长 DREB1A 开放阅读框（ORF，651 bp）从 拟南芥 L. 使用包含基因特异性引物的cDNA BamH我与 EcoRI型限制性位点：正向5^/-GGCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCT-3^/ 和反向 5^/-GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3^/同样地， rd29A 启动子（499 bp）从 拟南芥 使用含引物的基因组 DNA Kpn我与 BamHI位点：正向5^/-GCGGGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3^/ 和反向 5^/-GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTGTTTGATCC-3^/PCR 反应体系为 25 µL，包含 2.5 µL 10x PCR 缓冲液、1.5 mM MgCl₂₂，每种dNTP 0.2 mM，每种引物0.4 µM，Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板1 µL（基因组DNA约100 ng或cDNA约50 ng），用无核酸酶水补足至终体积。两种的扩增条件均为 DREB1A 和 rd29A 启动子片段的扩增程序如下：95 °C 预变性 3 min；35 个循环的 95 °C 变性 30 s、58 °C 退火 30 s、72 °C 延伸 1 min；最后 72 °C 最终延伸 7 min。扩增产物经 0.7% 琼脂糖凝胶电泳分离后，使用 Gel Extraction Kit 按照制造商说明书进行胶回收纯化。

扩增的 DREB1A 和 rd29A 启动子 PCR 产物通过 TA 克隆法插入克隆载体 pTZ57R/T 中，并对产物进行 Sanger 测序以确认序列。DREB1A 序列（登录号：AM992886）已提交至 GenBank（rd29A 启动子被插入至 KpnI 和 BamHI 位点，而 DREB1A 编码序列则被插入至 BamHI 和 EcoRI 位点的下游，从而替换原有的 2x35S 启动子，并使 DREB1A 置于 rd29A 启动子的调控之下。最终的表达盒（rd29A::DREB1A::CamV）通过 KpnI 和 EcoRV 酶切释放，并克隆至双元载体 pGA482 的 T-DNA 区域，构建用于植物转化的载体（图 1）。在完成初始的 Sanger 测序以验证克隆产物后，未再进行进一步的测序验证。

基因序列分析
利用参考的生物信息学工具，通过邻接法对来自13种不同双子叶和单子叶植物的AtDREB1A和DREB1蛋白序列进行了系统发育分析并加以比较。氨基酸序列从Phytozome（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）获取。多序列比对分析使用Clustal Omega在线程序完成。一旦从Phytozome和GenBank获得所需序列，便无需进一步进行序列检索。

外植体准备与愈伤组织诱导枪^20,34
甘蔗品种在费萨拉巴德NIBGE的试验田中种植。6个月后，切取健康蔗茎顶端部分以获取顶端区域，并修剪至顶芽处。在无菌条件下，将叶鞘剥成约5 mm长的圆柱形片段，并用70%乙醇进行表面消毒。从顶端分生组织上方区域，每根蔗茎制备约10–15个顶端圆盘（大小约3 mm）。将这些圆盘接种于愈伤组织诱导培养基（CIM）上，培养方法如前所述^1,20,34。培养4–6周后，将产生的胚性愈伤组织转接至新鲜CIM培养基上以进一步增殖。注意：使用70%乙醇进行表面消毒已足够，无需额外的灭菌步骤。

通过基因枪法将rd29A: DREB1A遗传转化至甘蔗中^20,34
将增殖的胚性愈伤组织置于含CIM的培养皿中央。3天后，使用PDS-1000/He型基因枪，将包被有含rd29A: DREB1A的植物可表达双元载体pGA482的金粉颗粒轰击愈伤组织，具体操作如文献³⁴所述。轰击后，将小块愈伤组织在CIM培养基上继续培养3天，并于26 ± 2 ^oC避光培养。随后，将愈伤组织转移至添加60 mg/L遗传霉素（geneticin）的愈伤组织筛选培养基（CSM）上，每10天继代一次，持续在26 ± 2 ^oC避光条件下培养。

30天后，将健康的愈伤组织接种于含60 mg/L抗生素的再生选择培养基（RSM）上以诱导芽的形成。培养皿置于生长室中，于26 ± 2 °C、16小时光照/8小时黑暗的光周期、500 µmol m^-2 s^-1 光照强度及受控湿度条件下培养4周³⁵。将再生出的健康芽转移到含60 mg/L抗生素的生根选择培养基（RtSM）中，置于玻璃瓶内，并在上述相同条件下继续培养。4至6周后，将可能的转化植株移栽至装有灭菌沙质土壤的小型塑料盆中，并在上述生长室条件下继续培养。愈伤组织选择培养基（CSM）上的继代培养无需超过10天。

转基因甘蔗植株的分子鉴定
如前所述，采用CTAB提取法从疑似转基因甘蔗幼苗的嫩叶中提取基因组DNA³⁶。使用NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。利用表1中列出的基因特异性引物，对筛选标记基因nptII（750 bp）和外源基因DREB1A（651 bp）进行PCR扩增。每个25 µL的PCR反应体系包含1× PCR缓冲液、2.5 mM MgCl₂、每种0.2 mM dNTPs、每种0.4 µM引物、1 U Taq DNA聚合酶、约100 ng基因组DNA，并用去离子水补足体积。PCR反应在热循环仪中进行，程序如下：95 °C预变性3 min；随后进行35个循环，每循环为94 °C变性30 s、58 °C退火30 s、72 °C延伸45 s；最后在72 °C延伸5 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，并在紫外光下观察，以确认扩增结果。PCR检测阳性（T₀）的转基因植株被转移至较大的陶土盆中，在受控的玻璃温室环境中驯化直至成熟。植株成熟后，选取5个随机确定的PCR验证阳性的T₁株系，将其茎段种植于微区地块中繁殖12个月，以获得足够数量的无性系材料用于干旱胁迫实验。注意：一旦确认nptII和DREB1A基因的存在，不再进行额外的PCR扩增。

DREB1A 表达研究
采用实时荧光定量 PCR（qPCR）检测转基因和非转基因甘蔗植株在胁迫条件下叶片中DREB1A的相对表达水平。根据试剂生产商的操作说明，使用提取试剂从约 100 mg 叶片组织中提取总 RNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量，并使用分光光度计进行定量。对于每个样品，取 2 µg RNA，按照供应商说明书使用 oligo(dT) 引物和 cDNA 合成试剂盒进行逆转录反应。

以所得cDNA为模板，利用基因特异性引物扩增188 bp的DREB1A片段：上游引物为5^'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGA-3^'，下游引物为5^'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAG-3^'。每个25 µL的qPCR反应体系包含12.5 µL的2× SYBR Green qPCR主混合液、每种引物各0.4 µM、2 µL稀释后的cDNA（约含100 ng模板）以及无核酸酶水补足至25 µL。反应在热循环仪上进行，每个样本设三个重复，程序如下：95 °C预变性5 min，随后进行40个循环，每循环包括95 °C变性30 s、56 °C退火30 s、72 °C延伸30 s，最后在72 °C延伸10 min。

为确认qPCR反应的效率和线性关系，首先使用含有克隆的DREB1A片段的质粒DNA进行10倍系列稀释，绘制标准曲线。然而，在基因表达分析中，采用2^−ΔΔCt法³⁷进行相对定量。实验以Actin基因为内源性参照基因，将每个转基因株系中DREB1A的表达水平相对于野生型对照进行归一化处理。所有C_t值均采用仪器软件推荐的自动基线和阈值设置获取。仅接受具有单一、尖锐峰的熔解曲线，以确认扩增特异性。高质量且未降解的RNA是实现准确定量的关键。为避免影响cDNA合成及后续基因表达分析的可靠性，纯度不足或已降解的RNA样本均被排除。

甘蔗中由DREB1A介导的变化研究：水分胁迫实验^20,34
种植一年后，将转基因植株和非转基因（野生型）植株的三个重复组，每组五个甘蔗茎段（每段两个节），播种于装有18 kg土壤（EC_e 1.34；SAR 2.72；pH 7.8）的陶土盆中，深度为5 cm。设置三种水分胁迫处理：100%、80%和60%田间持水量（FC）（表2）。在处理12个月后测定甘蔗的光合活性（P_N、E和g_s）以及植株水分关系（Ψ_w、Ψ_s和RWC）。请勿更改已设定的水分处理条件，以免影响处理的一致性。

光合活性的测定
在持续180天的水分胁迫后，使用便携式手持光合作用测定系统，对转基因和野生型甘蔗植株的气体交换参数——光合速率（P_N）、蒸腾速率（E）和气孔导度（g_s）——进行测定。测量在上午09:00至11:00之间进行，选取每株植物顶部第三片完全展开的叶片。将选定叶片轻轻插入内置的透明叶室（夹持面积为3 cm²），确保叶片与叶室完全接触，无褶皱或遮挡。系统实时记录环境条件，光照强度在自然日光下维持在约1,000 µmol m^-2 s^-1。仪器平衡30–60秒，直至CO₂同化和水蒸气交换读数达到稳定状态。仪器内置传感器自动记录叶片温度、相对湿度和环境CO₂浓度。对每种基因型和处理条件，至少在三个生物学独立的植株上进行重复测量，数据由仪器内部存储，随后导出用于分析。实验过程中注意保持各重复间环境条件的一致性，以确保数据的可靠性。

叶片水势和渗透势的测定
采用 Scholander 型压力室测定植株顶部第三片完全展开叶的水势（Ψ_w）。将叶片采集后置于 1.5 mL 离心管中，在 -20 ^oC 下冷冻，随后从冻存叶片中提取细胞汁液，利用渗透压仪测定其渗透势（Ψ_s）。

叶片相对含水量的测定
详细检测了转基因植株和野生型植株叶片的含水量。测定叶片的鲜重后，将叶片浸入蒸馏水中过夜。随后记录叶片的饱和重，而干重则通过在70 °C下孵育叶片72 h后测定。叶片相对含水量（RWC）按以下公式计算：

注意：为使用渗透压计准确分析渗透势，必须在测定水势后将叶片于 -20 °C 冷冻。

产量性状
在收获阶段测定甘蔗的产量性状，如茎秆高度（cm）、直径、有效茎数、锤度（%），以及地上部和根系生物量。

统计分析
田间试验（通过围栏进行控制）采用随机完全区组设计，每种处理设置三个重复（每个重复五株植物；n = 15）。采用双因素方差分析，在显著性水平 P ≤ 0.05下分析不同农艺和生理性状的变化。

结果

甘蔗转基因株系的分子表征
构建了 rd29A:DREB1A 表达盒，并将其克隆至可在植物中表达的双元载体 pGA482 中（图1），随后利用基因枪介导的转化技术将该载体导入甘蔗基因组，成功获得了转基因甘蔗幼苗（如图2所述）。通过扩增分别特异于nptII标记基因和DREB1A基因的750 bp和651 bp片段，确认了外源基因在甘蔗株系中的存在。在野生型甘蔗植株中未检测到这些片段（图3A、B）。经PCR确认的转基因甘蔗植株（T₀代）与野生型植株一同在温室中培养至成熟。选取5个转基因株系（Dr-2、Dr-4、Dr-7、Dr-20和Dr-21）进行水分胁迫处理，并比较转基因植株与野生型植株在水分胁迫条件下DREB1A基因的相对表达模式。所有转基因株系的DREB1A相对表达水平均显著...

讨论

由于全球干旱易发地区的持续扩大，培育植物的水分胁迫耐受性至关重要。作为一种潜在可行的生物技术途径，我们研究了DREB1A在转基因甘蔗品系中对水分胁迫耐受性的作用。已有研究报道，DREB1A转录因子能够诱导多个赋予非生物胁迫耐受性的基因表达^{28,38,39,40,41}。在此基础上，我们进一步探究了拟南芥DREB1A基因在转基因甘蔗品系中赋予干旱耐受性的作用。

在不同水分胁迫水平下生长时，表达DREB1A的甘蔗植株比野生型植株具有更高的生长速率。所有遭受水分胁迫的转基因植株表型正常，与野生型植株相似。与我们的研究结果类似，许多报道表明，在rd29A启动子驱动下，DRE...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
克隆载体 pTZ57R/T	Fermentas, 立陶宛维尔纽斯
红外气体交换分析仪	Bio-Rad, 美国加利福尼亚州
渗透压仪	Bio-Rad, 美国加利福尼亚州
PCR 仪	Bio-Rad, 美国加利福尼亚州
PDS-1000/He 基因枪	ThermoFisher Scientific Inc, 美国
实时荧光定量 PCR 仪	ThermoFisher Scientific Inc, 美国
RevertAid cDNA 合成试剂盒	CI-340, CID Bio-Science, Inc., 美国
Scholander 型压力室	Skye Instruments, 英国伯明翰兰德林多威尔斯
TRIzol 试剂	Wescor-5500, 美国犹他州洛根