单侧输尿管梗阻模型用于研究肾间质纤维化

摘要

本方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管梗阻（UUO）的方法，用于研究梗阻性肾病中组织纤维化的进展。内容包括手术操作、术后护理以及纤维化评估方法。

摘要

肾纤维化是慢性肾脏病（CKD）进展的最终病理结局。单侧输尿管结扎（UUO）模型被广泛用于阐明肾间质纤维化的分子和细胞机制，并识别潜在的治疗靶点。该模型通过在小鼠中手术结扎单侧输尿管建立，操作相对简单且易于实施。然而，UUO小鼠模型存在显著的变异性与不一致性，受小鼠品系、年龄、性别、麻醉类型、手术持续时间、术中体温、操作者的手术技能、饲养条件以及小鼠整体健康状况等多种因素影响。手术技术、缝合位置和梗阻持续时间的差异均会导致结果的不一致。此外，对梗阻侧肾脏取材的不统一进一步增加了肾纤维化评估中的变异性。本研究概述了构建UUO小鼠模型及评估间质纤维化的过程，讨论了导致模型不可预测性的技术挑战，并提出了可能的解决方案。这些见解旨在建立一种更为标准化且具有广泛适用性的肾纤维化研究方法。

引言

慢性肾脏病（CKD）影响着全球超过10%的人口，且其患病率呈上升趋势¹。多种泌尿系统疾病，包括先天性解剖异常、肾结石、前列腺增生和膀胱肿瘤，均可导致输尿管梗阻²。因此，单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型是识别肾脏间质纤维化新机制、理解疾病进展以及评估潜在治疗策略的重要工具。该模型已被广泛用于研究肌成纤维细胞的来源、（肌）成纤维细胞亚群、肾小管细胞代谢、细胞周期阻滞、部分上皮-间质转化及其他相关过程^3,4,5,6,7,8。

除了UUO诱导的肾间质纤维化外，其他常用的啮齿类动物肾间质纤维化模型还包括毒素诱导模型（如使用马兜铃酸、叶酸和腺嘌呤的模型）以及手术诱导模型（如5/6肾切除术和缺血-再灌注损伤（IRI）模型）。与其它肾纤维化模型相比，UUO模型具有多项优势。例如，毒素诱导的肾纤维化建模周期相对较长（约1–2个月），且其对其他器官的毒性副作用可能干扰纤维化机制的研究^9,10,11。而手术诱导模型（如5/6肾切除术）可能导致明显的肾脏出血和感染，增加术后死亡风险。此外，所诱导的间质纤维化程度与切除的肾组织体积直接相关，因此难以在每只小鼠中稳定地复制出相同程度的纤维化¹²。

肾缺血-再灌注损伤（IRI）模型是诱导急性肾损伤向慢性肾病（CKD）进展的主要方法，具有重要的临床相关性。通过调节缺血时间和体温可调控纤维化的严重程度；然而，与单侧输尿管结扎（UUO）模型相比，该模型手术操作更为复杂，且诱导间质性纤维化所需时间更长¹³。与这些模型相比，UUO模型具有多项优势，包括建模周期短、个体差异小、可重复性强以及手术过程相对简单。UUO小鼠模型不涉及毒素使用，通过结扎一侧输尿管即可在两周内引发梗阻性肾病，导致肾积水、肾小管扩张和间质纤维化，其病理过程与人类高度相似¹⁴。通过调整实验持续时间，可控制纤维化的严重程度——轻度、中度或重度。

尽管UUO小鼠模型在研究慢性肾脏病（CKD）时比其他损伤诱导模型更易于操作，但多种因素会显著影响其稳定性，包括小鼠品系、年龄、性别、麻醉类型、手术持续时间、术中体温、操作者的手术技能，以及小鼠的饲养条件和健康状况^15,16。

在麻醉条件下以稳定有序的方式进行手术操作，同时尽量减少手术应激和感染，是建立可重复性UUO小鼠模型的关键。此外，操作者经验不足可能影响对慢性肾脏病（CKD）机制及潜在治疗靶点的研究，导致小鼠死亡率升高和模型异质性增加。为应对这些挑战，本文详细阐述了手术过程的关键技术要点——包括术前、术中和术后各阶段——并强调了需要特别注意的关键问题。同时，还提供了UUO小鼠模型的评估方法，以期为研究人员提供一种一致且可靠的评价体系。

方案

所有动物实验均按照机构指南进行，并经南京医科大学 Institutional Animal Ethics Committee 批准。为消除性别和品系差异并确保结果的可比性，仅使用 8-10 周龄、体重为 22-25 g 的雄性 CD1 小鼠。本研究中所用试剂和设备的详细信息见《材料表》。

1. 动物和仪器准备

1. 手术前对所有外科器械进行高压灭菌。
2. 称重并麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。正确连接吸入麻醉装置，将小鼠置于诱导室中，使用含1-2 L/min氧气的2%异氟烷进行麻醉诱导。确认麻醉成功（例如，翻正反射消失）后，将小鼠鼻部置于鼻罩中，持续供给麻醉气体。通过皮下注射给予丁丙诺啡（50 µg/kg）作为术前镇痛。
   注意：定期检查小鼠呼吸频率，并通过足底反射评估麻醉深度，根据需要调整异氟烷浓度。
3. 将小鼠仰卧位放置于外部 加热装置 上，头部和颈部伸展以保持气道通畅。使用低粘性胶带固定四肢。
4. 使用温度计监测环境温度，并维持在37-38 °C。插入直肠探头，在手术过程中保持小鼠核心体温在约36.5-37 °C。
5. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥损伤。
6. 使用脱毛膏或电推剪去除手术区域的毛发，并用聚维酮碘溶液和75%乙醇交替消毒三次。

2. 手术步骤

注意：当体温稳定在设定值且脚趾夹捏反射消失后，开始以下手术操作。

1. 使用手术刀从膀胱至左下肋缘做一条长约 1–1.5 厘米的纵向切口，以暴露腹腔。
2. 用无菌生理盐水润湿的棉签将肠道移至腹腔右侧，以暴露位于脾脏后下方且紧邻脊柱的左肾。
3. 使用弯头虹膜镊清除左输尿管周围脂肪及结缔组织。轻柔分离后，使用 4/0 手术缝线在靠近左肾下极处结扎左输尿管；在第一次结扎线与膀胱之间对左输尿管进行第二次结扎。
   注意：为尽量减少小鼠间的个体差异，应确保所有实验动物的结扎位置保持一致。用左手持镊将缝线送入右手持镊的尖端，并将缝线从输尿管下方滑回。避免在结扎时包含过多脂肪和结缔组织，以免导致肾脏梗阻不完全。可通过干燥棉签轻轻擦拭输尿管实现此目的¹⁷。
4. 小心地将肠道复位至腹膜腔内。使用 4/0 手术缝线分别缝合肌肉层和皮肤层。
   注意：若将皮肤层与肌肉层一并缝合，可能导致缝合伤口裂开及腹腔脏器损伤。
5. 在对多只小鼠进行操作时，每完成一只小鼠后，须在进行下一只小鼠手术前更换一套新的经高压灭菌的手术器械 。

3. 术后护理与监测

1. 腹腔注射 0.5 mL 温热的生理盐水，以防止脱水。
2. 将小鼠放回清洁的笼子中，直至其完全恢复意识。
3. 术后 3 天内每 8 小时皮下注射一次布托啡诺（50 µg/kg）。每天监测小鼠是否有缺乏理毛、进食减少和姿势异常等表现。

4. 术后评估

1. 组织学
   1. 使用过量异氟烷对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。安乐死后，采集梗阻侧及对侧未梗阻的肾脏¹⁸。
   2. 选取肾脏切片中最大横截面积用于组织学检查。
   3. 将肾脏组织用4%多聚甲醛固定，并将所得样品切成4 µm厚的切片。
   4. 采用过碘酸-雪夫染色（PAS）、马松三色染色（MTS）或天狼星红染色对肾脏切片进行染色，以检测肾小管损伤和肾脏纤维化。
   5. 在光学显微镜下以200×放大倍数随机选取十个肾脏切片视野。
   6. 使用ImageJ软件计算胶原阳性蓝色区域的比例。
2. 蛋白质印迹（Western blot）
   1. 使用放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）从单侧输尿管梗阻（UUO）肾脏的相同极部提取约20 mg肾脏组织¹⁸。
   2. 采用二辛可宁酸法（bicinchoninic acid assay）测定蛋白浓度¹⁹。
   3. 将等量的蛋白样品上样至4%-10% Bis-Tris凝胶中进行电泳，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
   4. 用含5%脱脂奶粉的Tris-缓冲盐溶液吐温（TBST）封闭PVDF膜，并在4 °C下与一抗孵育过夜。
   5. 用TBST洗涤PVDF膜后，在室温下与二抗孵育1小时。
   6. 采用增强化学发光法（ECL）检测蛋白水平，并使用ImageJ软件进行分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为上样内参。
3. 肾功能
   1. 使用吸入式异氟烷对小鼠进行麻醉（参见步骤1.2）。
   2. 麻醉后经眶后静脉丛采集0.2–0.3 mL血液。
   3. 在室温下以3,000 x g离心15分钟。
   4. 使用全自动干化学分析仪测定血清肌酐和血尿素氮（BUN），以监测肾功能。

结果

组织学
过碘酸-希夫（PAS）染色显示肾小管扩张、刷状缘丢失、管型形成以及肾小管上皮细胞肿胀。与假手术组可见的结构紧密、管腔清晰的正常肾小管相比，输尿管梗阻（UUO）后Masson三色染色和天狼星红染色均显示出间质纤维化。肾间质纤维化的程度在Masson三色染色中表现为蓝色区域，在天狼星红染色中表现为红色区域，且随时间呈依赖性增加（图1A）。

蛋白质印迹
纤维连接蛋白（FN）、I型胶原（Col-1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是常用于评估肾纤维化的标志物。与假手术组相比，UUO后这些纤维化相关蛋白的表达水平显著升高，并且与梗阻持续时间呈正相关（图1B）。

实时 PCR
与假手术组相比，单侧输尿管梗阻（UUO）组中纤维化标志物（FN、Col-1a1、α-SMA 和转化生长因子-β1...

讨论

提供了一种建立UUO模型的全面操作流程，该模型是研究肾脏间质纤维化的一种广泛应用的方法。此外，还演示了该模型的鉴定与评估方法，包括肾功能和组织学改变的评价。讨论了导致模型异质性的变量以及可调节的技术因素。

对UUO的易感性显著依赖于年龄、性别和小鼠品系。与C57BL/6小鼠相比，BALB/c小鼠对UUO的易感性较低，甚至具有抗性²⁰。在涉及雄性和雌性C57BL/6小鼠的研究中，雄性小鼠在UUO后表现出更强的Masson三色染色和评分，以及更高的IV型胶原表达²³。此外，UUO中性别差异对肾纤维化的影响在不同的转基因和基因敲除小鼠模型中有所不同²⁴。年龄是影响UUO结果的另一个关键因素；老年小鼠（50周）比年轻小鼠（16周）表现出更严重的肾小管间质萎缩²¹。在Sprague-Dawley大鼠UUO模型中也观察到类似的年龄相关效应²⁵。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器	Mingankang	/
4/0 外科缝线	Jinhuan Medical	F401
75% 乙醇	Lircon	6303060031
麻醉空气泵	RWD Life Science	R510-29
麻醉诱导舱	RWD Life Science	V102-V
动物毛发剪	Jinke	/
聚维酮碘溶液	Lircon	6303030036
丁丙诺啡（镇痛剂）	RWD Life Science	/
弯头虹膜镊	jinke	/
电子加热垫	Reptizoo	AHM23
细直镊	Jinke	/
气体过滤罐	RWD Life Science	R510-31-6
纱布垫	Winner Medical	601-026576
虹膜剪	Jinke	/
异氟烷（麻醉剂）	RWD Life Science	R510-22-10
多输出动物麻醉机	RWD Life Science	R550IE
持针器	jinke	/
眼科软膏	Dechra NDC	17033-211-38
无菌棉签	Winner Medical	601-015213
无菌生理盐水	Shimen	H20066533