本方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管梗阻（UUO）的方法，用于研究梗阻性肾病中组织纤维化的进展。内容包括手术操作、术后护理以及纤维化评估方法。
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本文内容
摘要
摘要
肾纤维化是慢性肾脏病（CKD）进展的最终病理结局。单侧输尿管结扎（UUO）模型被广泛用于阐明肾间质纤维化的分子和细胞机制，并识别潜在的治疗靶点。该模型通过在小鼠中手术结扎单侧输尿管建立，操作相对简单且易于实施。然而，UUO小鼠模型存在显著的变异性与不一致性，受小鼠品系、年龄、性别、麻醉类型、手术持续时间、术中体温、操作者的手术技能、饲养条件以及小鼠整体健康状况等多种因素影响。手术技术、缝合位置和梗阻持续时间的差异均会导致结果的不一致。此外，对梗阻侧肾脏取材的不统一进一步增加了肾纤维化评估中的变异性。本研究概述了构建UUO小鼠模型及评估间质纤维化的过程，讨论了导致模型不可预测性的技术挑战，并提出了可能的解决方案。这些见解旨在建立一种更为标准化且具有广泛适用性的肾纤维化研究方法。
引言
慢性肾脏病（CKD）影响着全球超过10%的人口，且其患病率呈上升趋势1。多种泌尿系统疾病，包括先天性解剖异常、肾结石、前列腺增生和膀胱肿瘤，均可导致输尿管梗阻²。因此，单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型是识别肾脏间质纤维化新机制、理解疾病进展以及评估潜在治疗策略的重要工具。该模型已被广泛用于研究肌成纤维细胞的来源、（肌）成纤维细胞亚群、肾小管细胞代谢、细胞周期阻滞、部分上皮-间质转化及其他相关过程3,4,5,6,7,8。
除了UUO诱导的肾间质纤维化外，其他常用的啮齿类动物肾间质纤维化模型还包括毒素诱导模型（如使用马兜铃酸、叶酸和腺嘌呤的模型）以及手术诱导模型（如5/6肾切除术和缺血-再灌注损伤（IRI）模型）。与其它肾纤维化模型相比，UUO模型具有多项优势。例如，毒素诱导的肾纤维化建模周期相对较长（约1–2个月），且其对其他器官的毒性副作用可能干扰纤维化机制的研究9,<....
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方案
所有动物实验均按照机构指南进行，并经南京医科大学 Institutional Animal Ethics Committee 批准。为消除性别和品系差异并确保结果的可比性，仅使用 8-10 周龄、体重为 22-25 g 的雄性 CD1 小鼠。本研究中所用试剂和设备的详细信息见《材料表》。
1. 动物和仪器准备
- 手术前对所有外科器械进行高压灭菌。
- 称重并麻醉小鼠（遵循机构批准的方案）。正确连接吸入麻醉装置，将小鼠置于诱导室中，使用含1-2 L/min氧气的2%异氟烷进行麻醉诱导。确认麻醉成功（例如，翻正反射消失）后，将小鼠鼻部置于鼻罩中，持续供给麻醉气体。通过皮下注射给予丁丙诺啡（50 µg/kg）作为术前镇痛。
注意：定期检查小鼠呼吸频率，并通过足底反射评估麻醉深度，根据需要调整异氟烷浓度。 - 将小鼠仰卧位放置于外部 加热装置 上，头部和颈部伸展以保持气道通畅。使用低粘性胶带固定四肢。
- 使用温度计监测环境温度，并维持在37-38 °C。插入直肠探头，在手术过程中保持小鼠核心体温在约36.5-37 °C。
- 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥损伤。
- 使用脱毛膏或电推剪去除手术区域的毛发，并用聚维酮碘溶液和75%乙醇交替消毒三次。
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结果
组织学
过碘酸-希夫（PAS）染色显示肾小管扩张、刷状缘丢失、管型形成以及肾小管上皮细胞肿胀。与假手术组可见的结构紧密、管腔清晰的正常肾小管相比，输尿管梗阻（UUO）后Masson三色染色和天狼星红染色均显示出间质纤维化。肾间质纤维化的程度在Masson三色染色中表现为蓝色区域，在天狼星红染色中表现为红色区域，且随时间呈依赖性增加（图1A）。
蛋白质印迹
纤维连接蛋白（FN）、I型胶原（Col-1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是常用于评估肾纤维化的标志物。与假手术组相比，UUO后这些纤维化相关蛋白的表达水平显著升高，并且与梗阻持续时间呈正相关（图1B）。
实时 PCR
与假手术组相比，单侧输尿管梗阻（UUO）组中纤维化标志物（FN、Col-1a1、α-SMA 和转化生长因子-β1.......
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讨论
提供了一种建立UUO模型的全面操作流程，该模型是研究肾脏间质纤维化的一种广泛应用的方法。此外，还演示了该模型的鉴定与评估方法，包括肾功能和组织学改变的评价。讨论了导致模型异质性的变量以及可调节的技术因素。
对UUO的易感性显著依赖于年龄、性别和小鼠品系。与C57BL/6小鼠相比，BALB/c小鼠对UUO的易感性较低，甚至具有抗性20。在涉及雄性和雌性C57BL/6小鼠的研究中，雄性小鼠在UUO后表现出更强的Masson三色染色和评分，以及更高的IV型胶原表达23。此外，UUO中性别差异对肾纤维化的影响在不同的转基因和基因敲除小鼠模型中有所不同24。年龄是影响UUO结果的另一个关键因素；老年小鼠（50周）比年轻小鼠（16周）表现出更严重的肾小管间质萎缩21。在Sprague-Dawley大鼠UUO模型中也观察到类似的年龄相关效应25。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金（82370686/2024YFA1107704）、江苏省特聘教授计划、南京市科技创业项目、江苏省人民医院高层次人才培养计划（第一期）（CZ0121002010037）、江苏省自然科学基金（BK20240055）以及江苏省医学创新团队（JR）的资助；同时获得江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）临床能力提升项目（JSPH-MA-2023-4）、江苏高校优势学科建设工程（中国）和国家自然科学基金（81970639/82151320）（HM）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | Mingankang | / | |
| 4/0 外科缝线 | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75% 乙醇 | Lircon | 6303060031 | |
| 麻醉空气泵 | RWD Life Science | R510-29 | |
| 麻醉诱导舱 | RWD Life Science | V102-V | |
| 动物毛发剪 | Jinke | / | |
| 聚维酮碘溶液 | Lircon | 6303030036 | |
| 丁丙诺啡（镇痛剂） | RWD Life Science | / | |
| 弯头虹膜镊 | jinke | / | |
| 电子加热垫 | Reptizoo | AHM23 | |
| 细直镊 | Jinke | / | |
| 气体过滤罐 | RWD Life Science | R510-31-6 | |
| 纱布垫 | Winner Medical | 601-026576 | |
| 虹膜剪 | Jinke | / | |
| 异氟烷（麻醉剂） | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| 多输出动物麻醉机 | RWD Life Science | R550IE | |
| 持针器 | jinke | / | |
| 眼科软膏 | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| 无菌棉签 | Winner Medical | 601-015213 | |
| 无菌生理盐水 | Shimen | H20066533 |
参考文献
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
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