纵向显微计算机断层扫描图像分析，用于临界尺寸骨缺损中用户定义的感兴趣区域

Summary

我们提出了一种在纵向 体内 大鼠径向缺陷模型中分析用户定义的感兴趣区域 （ROI） 的方法。该方法能够在以前受显微计算机断层扫描 （μCT） 扫描视野变化、标本方向和支架基线存在限制的不同支架之间进行比较分析。

Abstract

骨体积的显微计算机断层扫描 （μCT） 成像分析是研究纵向 体内 研究中骨再生潜力和结果的必要定量工具。已建立的骨分割方法利用可视化软件对复杂解剖结构进行全骨 μCT 分割和对齐。这些分割协议为分割、对齐和分析提供了一种强大、高精度的方法，但在用户定义的感兴趣区域 （ROI） 分析能力方面受到限制。我们提出了一种协议，扩展了这些方法，以允许围绕临界大小的骨缺损进行用户定义的 ROI 骨体积分析。随着时间的推移，可以分析围绕缺陷的用户定义 ROI，以进行 体内 纵向研究。在此，我们研究了三个独特的大鼠标本的 μCT 图像，每个标本都植入了聚己内酯 （PCL） 对照支架。三个用户（2 名经验丰富的用户和 1 名新手）在 0 周和 6 周的时间点分析模型，以说明在整个纵向研究中测量围绕临界尺寸缺陷的投资回报率的能力。

Introduction

临界大小的骨缺损对骨科治疗管理构成了重大的临床挑战。根据 ASTM F2721，临界尺寸缺损的特征是长度为感兴趣骨骼直径^1.5 至 2 倍的缺损。传统上，这些缺陷的修复是通过使用自体和同种异体移植来实现的，这些移植受手术费用、二次手术的相关风险和所需的骨移植量的限制²。目前的骨再生技术侧重于使用同种异体和异种体支架，旨在通过优化其机械性能、生物相容性、生物活性、血管生成潜力和降解曲线来产生骨传导和骨诱导效应 ^3,4,5。生物材料研究范围广泛，从生物陶瓷和生物聚合物到金属和其他复合材料⁶。这些生物材料的变体在体外和体内都经过测试，以询问它们作为骨再生支架的潜力。

μCT 是非侵入性、高精度成像的金标准，用于评估啮齿动物模型的骨骼形态、结构和微观结构 ^7,8,9。这种成像方式已被描述用于评估骨折愈合模型中骨再生的纵向、体内进展¹⁰。已经开发了标准化 μCT 扫描中皮质骨和小梁骨定量的方法⁹.利用市售的可视化软件开发了半自动分割工作流程，用于具有复杂解剖结构的全骨分割¹¹。这些方法为不同经验水平的用户提供了简化、易用的方法，以产生标准化、可重复的结果。然而，这些方法在研究用户定义的 ROI 的能力方面仍然受到限制。

在这里，我们提出了一种协议，该协议扩展了当前方法，以允许使用可视化软件围绕纵向 体内 大鼠模型的临界大小骨缺损进行用户定义的 ROI 骨体积分析。在纵向研究的几周之间建立一致的比对和 ROI 选择方法对于开发稳健的方案至关重要。初始时间点用作后续几周对齐的基线，以确保实体模型的方向一致。如果这种对齐方式，则可以从叠加的实体模型中选择相应的 μCT 图像切片，包括临界尺寸的缺陷。一致的 ROI 不仅通过切片位置来验证，还通过比较区域内的切片数量来验证。然后，可以从基线模型中选择的 ROI 在随后的几周内复制，以便进行比较、定量分析。

Protocol

本研究的纵向 μCT 图像是在第 0 周和第 6 周从用基于聚己内酯 （PCL） 的支架治疗的成年雌性 Charles River SASCO-SD 大鼠的 3 mm 严重径向缺损中收集的。所有动物使用均按照罗切斯特大学动物资源委员会 （UCAR） 批准的方案进行。使用 Scanco Medical VivaCT 40 进行 μCT 图像采集。

注意：该协议中的主要步骤分为 μCT 图像分割、对齐、ROI 选择和裁剪以及分析和可视化（图 1）。μCT 图像分割协议改编自 Kenney 等人 （2022）¹¹。

图 1：摘要工作流程图。 协议步骤主要分为图像分割、模型对齐、ROI 选择和体积分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

1. μCT 图像分割

1. 在软件中打开图像
   1. 启动 Amira 软件（以下简称可视化软件）并选择 Open Data。在弹出窗口中，导航到所需的文件夹目录以选择文件.dcm初始时间点。按 Ctrl+A 选择所有图像，然后单击 Open Images （打开图像）。
   2. 弹出窗口将显示有关打开的图像数据集的信息;单击 OK 继续。
   3. 将显示有关缩放的警告。单击 Convert to Float （默认选项） 继续。
   4. 数据集图标将显示在 Project View （项目视图 ） 部分中。要更改数据集的名称，请单击数据集图标，然后按 F2;输入所需的名称后，单击 OK。建立命名模式以识别扫描（例如，“Bone Scaffold Material” - “WKX”）。
2. 对 μCT 图像进行过滤和阈值处理
   1. 将图像加载到 Project View 部分后，单击 Ortho Slice 默认 2D 查看器 以查看 2D 方向和切片。2D 可视化将出现在右侧的查看窗口中。
   2. 要在 3D 模式下可视化图像，请右键单击数据集，搜索 Volume Rendering，然后选择。在 Volume Rendering 的 Properties 部分中，将 Colormap 下限阈值调整为 2500，然后按 Enter。
      注意：可以通过分别单击 Ortho Slice 或 Volume Rendering 旁边的蓝色方块来打开和关闭 2D 和 3D。对于右侧的查看窗口，栏顶部提供了多个视图选项。这些工具包括用于移动、旋转或放大/缩小图像的不同工具;用于将图像方向更改为 XY、XZ 和 YZ 视图的工具，以及用于简单测量的工具。
   3. 根据需要，某些数据集可能需要使用 Volume Edit （卷编辑） 删除感兴趣区域之外的伪影或数据。要添加 Volume Edit，请右键单击数据集，搜索 Volume Edit，然后选择。
   4. 单击 Project View 部分中的 Volume Edit。在 Properties 部分中，从 Tool 右侧的第一个下拉窗口中选择 TabBox。
   5. 选择要保留的区域时，通过使用 Interact 光标（查看窗口顶部栏中的尖光标图标）单击并拖动绿色角来调整 TabBox 。调整 TabBox 可能需要使用备用视图（XY、XZ 或 YZ）来标识要删除的区域。
   6. TabBox 包围要保留的区域后，选择 Cut Outside 以删除 TabBox 外部的对象或数据。将在项目视图中生成一个新的、修改后的数据集。
   7. 单击并将 Volume Rendering 字符串从原始数据集拖动到修改后的数据集。这会将查看窗口中显示的图像更改为修改后的数据集。在 Volume Rendering 的 Properties 部分中，将 Colormap 下限阈值调整为 2500，然后按 Enter。
   8. 右键单击修改后的数据，搜索 Median Filter 并选择。在 Median Filter 的 Properties 部分中，选择 3D for Interpretation，然后单击 Apply。这将在 Project View （项目视图 ） 部分中创建一个新的过滤 （.filtered） 数据集。
   9. 右键单击筛选后的数据，搜索 Interactive Thresholding （交互式阈值），然后选择。在 Interactive Thresholding 的 Properties 部分中，为 Preview Type 选择 3D，将 Intensity Range 的下限值调整为 2500，然后单击 Apply。这将在 Project View 部分创建新的阈值 （.thresholded） 数据集。
   10. 单击并拖动 Volume Rendering 字符串，从修改后的数据集到阈值数据集。 关闭 Interactive Thresholding 并 打开 Volume Rending （如果关闭）。
3. 分割 μCT 图像
   1. 单击筛选的数据集，然后单击菜单栏下方的 Segmentation 更改为 Segmentation 选项卡。在 Segmentation 选项卡内，控件类似于 Project 选项卡。
      注意： Segmentation 选项卡中还有一些与查看窗口相关的其他工具。查看窗口的顶角有一个 +/- 缩放 按钮，可用于使图像填充查看窗口。可以使用查看窗口底部的左/右滚动条将图像在查看窗口中居中。在此滚动条上方，存在第二个滚动条，用于在 μCT 数据切片之间移动。
   2. 为确保正确设置 Segmentation 选项卡，在 Segmentation Editor 部分下，将 Image 设置为筛选的数据集，并将 Label 字段设置为阈值数据集。在 材质（Materials ） 部分下，双击名为 Material 的材质，并将其重命名为 Bone。
   3. 单击 New 在 Segmentation Editor 以创建新的标签字段。在弹出窗口中，使用与以前类似的命名约定（例如，“骨骼基架材质”-“WKX”-标记）将其重命名为“标记”，然后单击 “确定”。
   4. 使用备用视图（XY、XZ 或 YZ）调整 2D 查看窗口，以显示图像的矢状面或冠状面视图。
   5. 使用 画笔、套索、魔杖和 阈值 选择 部分来识别感兴趣的区域。对于此协议，请选择画笔工具。调整画笔工具的大小;通常，中等大小的指针效果很好。
   6. 将图像堆栈调整到半径骨骼开始可见的第一个切片。这可能需要多次遍历切片，以确定哪些体积属于桡骨和尺骨以及它们何时开始。
   7. 识别出切片后，使用 画笔光标 通过单击并拖动光标围绕此骨骼段进行绘制。光标绘制的位置将出现一条红线。在骨骼部分内绘制，而不是在骨骼外部绘制;这将有助于可视化软件区分两个骨骼。
   8. 继续在切片中移动并围绕半径绘制。通常，通过图像堆栈的中间部分，可以每 20-30 个图像切片绘制一次。沿着图像堆栈的末端或临界大小的缺损周围，每 5-10 个图像切片绘制一次图，以在骨骼淡入或淡出时协助可视化软件。
   9. 完成半径的整个长度后，单击菜单栏下拉列表中的 Selection （选择）、Fill （填充），然后单击 All Slices （所有切片 ）。这将填充使用画笔工具制作的所有绘图。这些现在将显示为红色阴影，而不是轮廓。
   10. 单击 Selection and Interpolate 在菜单栏下拉列表中。这将根据所做的绘图在所有切片中填充半径骨骼的阴影区域。
       注意：这偶尔会错过骨骼的某些部分。在继续滚动所有切片以确保它已大致识别骨骼之前。如果缺少骨骼的某个部分，请使用画笔工具在缺失部分周围的几个切片上围绕此区域旋转，然后重复上述两个步骤（1.3.9 和 1.3.10）。
   11. 完全确定半径后，在 材质（Materials ） 部分下，双击名为 Inside 的材质，并将其重命名为 半径（Radius）。
   12. 单击 添加 （+） 位于 选择 部分下的符号，将其添加为材质。半径现在在查看窗口中显示。在继续之前，单击 Materials 部分中 Radius 材质的 Lock 图标;这将确保不会对此材料进行任何更改。
   13. 对尺骨完成相同的过程。在 Materials 部分下，单击 Add 以创建新材料。双击新材料并将其重命名为 Ulna。
   14. 对尺骨重复步骤 1.3.6 到 1.3.12。
   15. 完成 Radius 和 Ulna 骨骼的步骤后，单击 Materials 部分中 Radius 材质的 Lock 图标来解锁 Radius。通过单击菜单栏下方的 Project 切换到 Project 选项卡。现在，一个名为 Markers 的数据集应用于 Project View （项目视图） 部分中的筛选数据集。
   16. 右键单击筛选后的数据集，然后搜索 Marker Based Watershed Inside Mark （Image Segmentation） 并选择。在 Properties 部分中，通过单击下拉菜单，将 Data 设置为筛选的数据集，将 Markers 设置为标记数据集，将 二进制掩码 设置为阈值数据集，然后单击 Apply。
   17. 将在 Project View 部分中生成一个 .grown 文件。单击并拖动 Volume Rendering 字符串，将 Volume Rendering 字符串从阈值数据集拖动到 .grown 数据集，以在查看窗口中可视化半径和尺骨的分割。
   18. 要将 .grown 文件转换为 8 位，请单击 .grown 数据集，然后搜索 Convert Image Type 并选择。.grown 文件将从 16 位转换为 8 位。

2. 对齐

1. 电轴对齐和桡骨和尺骨提取
   注意：如果当前模型是初始时间点，则必须完成所有步骤。否则，请从步骤 2.1.4 开始本节。要允许半径的横向切片，初始时间点模型必须垂直于 Ortho Slice 平面对齐;该模型将作为后续几周对齐的基线。
   1. 在 Project View 部分中，打开 Ortho Slice （如果关闭），然后单击 .grown 数据集。在 Properties （属性 ） 部分中，单击 Transform Editor （变换编辑器 ） 图标。使用 Interact 光标，通过单击绿色轴对齐点来调整半径和尺骨的角度，以便 Ortho Slice 创建穿过半径的横向切片。
   2. 调整后，需要创建一个新数据集来保存此转换。右键单击 .grown 数据集，搜索 Resample Transformed Image 并选择。
   3. 单击 Resample Transformed Image，然后在 Properties 部分中，将 Data 设置为 .grown 数据集，将 Interpolation 设置为 Nearest Neighbor，将 Mode 设置为 extended，Preserve to Voxel Size，并将 Padding 值设置为 0。单击 Apply，将创建一个新的 .transformed 数据集。
   4. 要从组合分割模型中提取桡骨和尺骨，请右键单击 .transformed 数据集，搜索 Extract Label 并选择。
   5. 单击 Properties 部分中的 Extract Label，将 Labels 设置为 .transformed 数据集，将 Label ID 设置为 1，并选中 Export to Binary。单击 Apply，将创建一个 Result 数据集。
   6. 单击 Volume Rendering 字符串并将其从 .grown 数据集拖动到 Result 数据集。单击 Result 数据集，然后按 F2 重命名文件（例如，'Bone Scaffold Material' - 'WKX' - Radius）。
   7. 通过将 标签 ID 设置为 2 并重命名尺骨的 Result 文件，对尺骨重复步骤 2.1.4 到 2.1.6。
2. 文件保存和打开纵向图像
   注意：如果当前模型是初始时间点，则必须完成所有步骤。否则，请从步骤 2.2.2 开始本节。
   1. 要保存初始时间点文件，请点击菜单栏下拉菜单中的 File （文件）、Save Project As （将项目另存为） 和 Set File Directory Location （设置文件目录位置 ）。将保存类型设置为 Amira 项目和数据文件 （pack & go） （*.hx） 文件，并将文件命名为主版本（例如，'Bone Scaffold Material'_ 'WKX' MASTER）。
   2. 打开初始时间点主文件（如果尚未打开），然后单击菜单栏下拉列表中的 File、Save Project As 和 Set File Directory Location 保存副本。将保存类型设置为 Amira 项目和数据文件 （pack & go） （*.hx） 文件，并命名文件（例如，“骨骼支架材质”_“WK0”和“WKX”）。此文件将用于将初始时间点与后续几周进行比较，而不会覆盖主文件。
   3. 在新的比较文件中，通过单击“项目视图”部分中的“打开数据”来打开比较时间点的图像。在弹出窗口中，导航到所需的文件夹目录以选择文件.dcm初始时间点。按 Ctrl+A 选择所有图像，然后单击 Open Images （打开图像）。
   4. 弹出窗口将提供有关打开的图像数据集的信息;单击 OK 继续。
   5. 将显示有关缩放的警告。单击 Convert to Float （默认选项） 继续。
   6. 数据集图标将显示在 Project View （项目视图 ） 部分中。要更改数据集的名称，请单击数据集图标，然后按 F2;输入所需的名称后，单击 OK。可以建立命名模式来识别扫描（例如，“骨骼支架材料”-“WKX”）。
3. 模型对齐
   注意： 此过程将讨论半径骨骼分割的对齐方式。根据需要，可以将相同的过程应用于尺骨。不要同时对齐两个骨骼;这将导致正确对齐的问题。
   1. 禁用任何初始时间点 Volume Rendering （体积渲染）。 Viewing Window 中不显示任何内容。
   2. 右键单击比较（后续周）数据集，搜索 Ortho Slice，然后选择。
   3. 重复第 1 部分（从第 1.2 步开始）、第 2 部分（第 2.1 步），然后对提供的步骤编号进行任何其他注释。完成这些部分后，请继续执行步骤 2.3.4。完成这些部分将产生下周数据集的分割并提取桡骨和尺骨。
   4. 右键单击提取的半径骨骼的比较（后续周）数据集，搜索 Image Registration Wizard，然后选择。在 Properties （属性 ） 部分中，将 Data （数据 ） 设置为提取的半径骨骼的比较周数据集，将 Reference （ 参考 ） 作为提取的半径骨骼的初始时间点数据集。
   5. 对于 Image Registration Wizard Actions 部分，单击 Skip 作为第 1 步（共 4 步）。对于第 2 步和第 3 步（共 4 步），使用 Interact 光标将 TabBox 调整到初始时间点和比较周数据集之间的公共区域，单击每个步骤后的 Action 下的 Apply。对于第 4 步（共 4 步），将 Metric 设置为 Correlation，将 Transformation 设置为 Rigid，将 Pre-Alignment 设置为 Align Principal Axes，然后单击 Action 下的 Apply。
   6. 数据集对齐后，右键单击提取的半径骨骼的比较（下周）数据集，然后搜索 Resample Transformed Image 并选择。在 Properties （属性） 部分中，将 Data （数据） 设置为提取的半径骨骼的比较周数据集，将 Interpolation （插值） 设置为 Nearest Neighbor（最近邻），将 Mode （模式） 设置为 Extended（扩展），将 Preserve （保留） 设置为 Voxel Size（体素大小），并将 Padding Value （填充值） 设置为 0，然后单击 Apply。 将为比较数据集创建一个新的 .transformed 数据集。

3. ROI 选择和裁剪

注意：首先完成 ROI 裁剪，以确定临界大小裂缝周围的切片编号。一旦确定了这些切片编号，就可以根据需要在尺骨的同一时间点使用这些切片编号。对于此过程，裁剪一旦应用于模型，就无法撤消。

1. 感兴趣区域作物
   1. 单击并启用初始时间点的 Ortho Slice，并将 Data 设置为提取半径 的初始时间点数据集 。设置 Orientation （方向 ），以便平面产生穿过半径骨骼的横向切割。
   2. 使用 Properties 部分中的 Slice Number 滑动条，更改切片编号以确定临界大小缺陷周围的近端和远端切片位置。对于这两个切片，确定骨折与桡骨骨干相接处的最远端和最近端的切片。记录切片编号;此数字因型号而异。
   3. 单击并打开比较周的 Ortho Slice，并将 Data 设置为提取半径 的初始时间点数据集 。设置 Orientation （方向），以便平面通过半径骨骼产生横向切割。
   4. 使用 Properties 部分中的 Slice Number 滑动条，并在初始时间点数据集显示远端正交切片的情况下，更改比较周切片编号，使其与初始时间点的远端切片对齐。可视化软件允许对准进行目视检查;当切片重叠时，它们将在查看窗口中显示为单个切片。
   5. 请注意比较周数据集的远端切片的切片编号。对近端切片重复步骤 3.1.4。
      注意：作为附加检查，确定初始和比较周数据集的近端和远端切片之间的差异。这些值必须相等，以说明一致的 ROI。
   6. 单击提取半径的初始时间点。在 Properties 部分，单击 Crop Editor 工具。
   7. 在 Crop Editor 弹出窗口中，将最小值和最大值输入到相应的 X、Y 或 Z 字段中（ Viewing Window 将在输入这些值时更改 ROI）。输入值后，单击 OK。数据集将被裁剪为输入 ROI。
   8. 对比较周数据集重复步骤 3.1.7。

4. 分析和可视化

1. 体积分析
   1. 要确定初始时间点数据集的体积，请右键单击提取半径的转换后的初始时间点数据集，搜索 Material Statistics，然后选择。在 属性 部分中 ，将数据设置为 为提取半径转换的初始时间点，然后设置为 选择 作为 材料 ，然后单击 应用。新的 .将为初始时间点数据集创建 MaterialStatistics 数据集。
   2. 单击 .MaterialStatistics 数据集，然后在 Properties 窗口中，单击 Spreadsheet Show。单击 Properties 窗口上方的 Tables 选项卡。在此选项卡中，显示了提取半径的裁剪初始时间点数据集的体积。
   3. 对提取半径的比较周数据集重复步骤 4.1.1 和 4.1.2。在 Table （表格 ） 选项卡中，初始时间点和比较周将具有单独的选项卡，可以单击进入。
2. 数据集的可视化
   1. 要可视化骨骼体积的变化， 请右键单击 提取半径的比较周转换数据集，搜索 Arithmetic，然后选择。单击 算 术 并在 属性 窗口中，将 输入 A 设置为提取半径的比较周转换数据集，将 输入 B 设置为提取半径的初始时间点数据集，将 输入 C 设置为 NO SOURCE，将 结果类型 设置为 输入 A，保持 选项 未选中，将 结果通道 设置为与 输入 A 类似， 并将 Expression （表达式） 设置为 A-B。
   2. 单击 Result 数据集，然后按 F2 重命名文件（例如，'Bone Scaffold Material' - 'WKX' - Bone Change）。右键单击此结果数据集，搜索 Generate Surface，然后选择。单击 Generate Surface ，然后在 Properties 窗口中单击 Apply，然后在弹出窗口中单击 Continue。将创建一个新的 .surf 数据集。
   3. 右键单击 .surf 数据集，搜索 Surface View， 然后选择。算术结果的 Surface View 将显示在 Viewing 窗口中。
   4. 要更改 Surface View 的颜色，请单击 Project View 窗口中的 Surface 视图，然后在 Properties 窗口中，单击 Colors 的下拉列表并选择 Constant。单击 Colormap 并分配首选颜色。
   5. 要查看初始周数据集上的骨骼体积变化，请右键单击 .transformed 数据集，搜索 Extract Label （提取标签），然后选择。单击 Extract Label，然后在 Properties 部分中，将 Labels 设置为 .transformed 数据集 ，将 Label ID 设置为 1，并选中 Export to Binary。单击 Apply，将创建一个 Result 数据集。单击 Result 数据集，然后按 F2 重命名文件（例如，'Bone Scaffold Material' - 'WKX' - Full - Radius）。
   6. 右键单击此结果数据集，搜索 Generate Surface，然后选择。单击 Generate Surface，然后在 Properties 窗口中单击 Apply ，然后在弹出窗口中单击 Continue。将创建一个新的 .surf 数据集。
   7. 右键单击 .surf 数据集，搜索 Surface View，然后选择。算术结果的 Surface View 将显示在 Viewing 窗口中。
   8. 要更改 Surface View 的颜色，请单击 Project View 窗口中的 Surface 视图，然后在 Properties 窗口中，单击 Colors 的下拉列表并选择 Constant。单击 Colormap 并分配首选颜色。
   9. 要继续其他周数，请返回步骤 2.2.2。

Results

研究了三种独特大鼠模型的 μCT 图像，每种模型都用聚己内酯 （PCL） 支架处理，以说明阳性结果。跨时间点的纵向研究分析需要在选择和裁剪为 ROI 之前对齐收集的实体模型。为了在多周内说明这种能力，在第 0 周和第 6 周收集的实体模型使用公共区域对齐（图 2）。

图 2：每周实体模型的对齐。 使用图像配准向导在周之间使用第 0 周作为基线方向的代表性实体模型对齐。此套准过程是半自动化的，在两个模型之间应用用户定义的公共区域（虚线）以帮助自动对齐实体模型。

Discussion

量化骨体积变化对于研究纵向 体内 研究中的骨再生潜力和结果至关重要。该协议建立在已建立的 μCT 图像分割方法¹¹ 的基础上，提供了一种指定用户定义的感兴趣区域 （ROI） 的系统方法。该技术在 体内大鼠研究 的骨支架植入物有效性分析中至关重要。通过扩展已建立的协议¹¹，该方法确保了图像分割的稳健性和可重复性，是对齐和裁剪技术的基础。使用 Tukey 的多重比较检验分析的双向方差分析显示，仅在 PCL2 支架上，有经验的用户和新手用户之间存在显著差异。此外，尽管在有经验的用户和新手用户之间观察到显著性，但这主要是由从新手用户那里获得的一个结果驱动的。虽然这些结果表明软件熟悉度对结果准确性的贡献，但这些结果也可能受到标本特异性形态的影响。PCL5 表明，有经验的用户 1 和 2 与新手用户之间的结果关联要紧密得多（p 值分别为 >0.9999 和 0.8658）。尽管在 PCL2 组中注意到了一些局限性，但为了进一步说明该过程的可靠性，我们进...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
阿米拉 3D	FEI SAS，赛默飞世尔科技旗下公司	2024.1 版	用于分割 microCT 图像的程序。
图形板棱镜	GraphPad 软件有限责任公司	v10.0.3 （217）	用于图开发的程序。
R 统计软件	统计计算的 R 基础	v4.4.0 （2024-04-24）	用于执行 ICC 分析的程序。
Scanco 医疗 VivaCT 40	斯堪科医疗	那	用于收集 microCT 图像的 microCT 扫描仪。