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改良的最可能数法检测生鸡和即食鸡产品中的沙门氏菌

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DOI：

10.3791/67910

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2025年1月31日

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1Characterization and Interventions for Foodborne Pathogens, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service (ARS), United States Department of Agriculture (USDA)

本文内容

摘要

在低水平下准确量化家禽中的沙门氏菌是当前工业界和监管领域面临的一项挑战。本方案描述了一种MPN检测方法，可用于定量生制及即食家禽产品中的沙门氏菌。该方法快速、灵敏，且符合食品安全检验局（FSIS）的指南要求，有助于提升食品安全并支持公共卫生工作。

摘要

Salmonella 是美国食源性疾病的主要致病原因，尤其常见于禽类产品中。传统的Salmonella检测方法侧重于检出率而非定量分析，这限制了其在评估污染水平和风险方面的作用。本研究介绍了一种新型的最可能数（MPN）检测方法，旨在对即食类禽类产品（如鸡肉可乐饼）中的Salmonella进行定量分析。该方法包括清洗禽类样品，通过离心浓缩洗涤液，并在48孔板中进行系列稀释。MPN检测与环介导等温扩增（LAMP）技术相结合，可在与现有美国食品安全检验署（FSIS）检测方案相同的时间范围内，实现对Salmonella污染的高灵敏度、准确且快速的定量。结果显示，MPN-LAMP测定值与理论接种水平之间具有良好的线性相关性（R² = 0.933）。然而，在较低浓度下存在一定的变异性，表明在这些水平上准确检测Salmonella仍具挑战性，实际检测限估计约为300 CFU/g。为进一步提升该方法的适用性，可能的优化方向包括增加取样量以进一步降低检测限、优化增菌培养基配方，以及扩展分子检测以靶向多种Salmonella血清型。总体而言，本研究为食品行业提供了一种实用工具，可对禽类产品中的Salmonella污染进行可靠定量，有助于提升食品安全和公共健康水平。

引言

作为美国食源性疾病、住院和死亡的主要原因，Salmonella 对公共卫生和经济具有重大影响。仅在2013年，该病原体造成的经济损失估计达36.7亿美元1。尽管近期的监管举措旨在到2030年将沙门菌感染病例减少25%2，但当前检测和防控策略仍存在明显不足，特别是在将加工企业的监测与公共卫生结果相衔接方面3。

即食冷冻禽类产品已牵涉多起沙门氏菌（Salmonella）暴发事件，对公共卫生构成重大关切。为此，美国食品安全检验局（FSIS）已将沙门氏菌（Salmonella）列为这些产品中的污染物。目前，FSIS 微生物学实验室指南（MLG）4.15 仅专注于确定禽类产品中沙门氏菌（Salmonella）的检出率4。根据该指南，采集的样品需增菌培养 18–24 小时，随后使用分子检测系统（MDS）进行筛查，该系统仅能判断沙门氏菌（Salmonella）的存在与否，而无法提供污染水平的相关信息。尽管该方法在病原体检出方面具有重要价值，但未能提供可用于帮助食品加工企业更准确评估污染风险并采取针对性纠正措施的定量数据。

本研究中，我们建立了一种方法，将微生物病原体的检测从定性检出提升至定量分析。该方法旨在无缝整合到现有流程中，用于检测禽类产品中的Salmonella，且对当前FSIS规程的干扰最小。该方法并非直接对整体样品进行增菌，而是首先使用与现行FSIS方法一致的培养基冲洗禽类产品。冲洗液随后被分配至48深孔板的第一列中，再在其余五列中进行系列稀释，并按照MLG 4.15规程在18–24小时的条件下进行培养。培养结束后，对各孔进行Salmonella检测，并利用结果计算最可能数（MPN）5,6。该方法可在与当前FSIS流程相同的时间范围内实现污染程度的定量，因此在工业界和监管领域均具有实际应用价值。图1展示了一个概括改进型MPN检测法的框图。该图包括在特定步骤拍摄的照片、用于稀释和培养重复样本的48孔板，以及用于评估碎鸡肉中Salmonella最可能数的三种基准技术。在本研究的第一阶段，我们使用辐照处理的碎鸡肉，以在将该方案应用于非辐照鸡肉样品之前，最大限度降低背景微生物群落及测量值相对于已知接种量的不确定性影响。

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方案

注意：本方案相关的所有操作均应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。在适当情况下，应在生物安全柜（BSC）内执行本方案，以维持无菌条件，并最大限度降低样本污染或操作人员暴露于微生物病原体的风险。当需要将样本转移出生物安全柜时，应使用密封容器，以保持样本完整性，并防止意外跌落时发生泄漏。建议在整个操作过程中使用一次性耗材，以减少交叉污染的可能性。在无法使用一次性物品的情况下，应确保所有设备和材料在使用前均处于无菌状态。妥善的废弃物管理至关重要；所有使用过的一次性耗材均应作为生物危害废物丢弃。可重复使用的材料在再次使用前必须经过高压灭菌，以确保充分灭菌并有效封存潜在有害物质。遵守这些预防措施不仅有助于保护样本的完整性，还能最大限度降低操作人员接触微生物病原体的风险。

1. 肉类样品的制备

  1. 肉类样品的获取与处理
    1. 新鲜肉类
      1. 从当地零售商的新鲜肉类部门获取绞鸡肉。将所有样品转移至4 °C条件下储存，并在收到后24小时内进行处理。以无菌操作将肉类分成每份25 g的样品。
      2. 对样品进行真空密封并辐照。本研究中，由德克萨斯农工大学AgriLife电子束研究中心（Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research）对肉类进行约25 kGy剂量的辐照。
        注意：尽管本研究使用辐照作为控制手段以确保消除背景微生物群，但在实际应用中，该步骤并非本方案的必要前提，后续部分所使用的未辐照即食型产品已证明了这一点。在实地检测中，可采用选择性培养基或分子诊断技术的特异性等替代方法，以应对非目标微生物可能造成的干扰。
    2. 即烹型鸡肉制品
      1. 从当地零售商冷冻食品区获取即烹型鸡肉制品。以无菌操作将其分成每份25 g的样品。
      2. 从单个制品的中心部位取样，以确保包含所有成分（例如裹粉和奶酪）。
  2. 培养基制备
    1. 通过将25 g缓冲蛋白胨水（BPW）粉末溶解于1 L纳米纯水（nanopure H2O）中来制备缓冲蛋白胨水（BPW）。
    2. 制备脑心浸出液（BHI）平板。将37 g BHI粉末溶解于1 L纳米纯水（nanopure H2O）中，并向BHI溶液中加入15 g琼脂。将所有培养基在121 °C条件下高压灭菌15分钟。将20至25 mL培养基倒入带透明盖的培养皿（100 mm × 15 mm）中。
      注意：最好在生物安全柜内倾注平板，以维持无菌条件。

2. 细胞培养

  1. 通过将伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）血清型鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 划线接种于 BHI 琼脂平板上，于 37 °C 培养过夜，制备初始培养物。
  2. 取一新鲜培养的沙门氏菌（Salmonella）单菌落，接种于 25 mL BHI 液体培养基中，于 37 °C、100 rpm 振荡条件下有氧培养过夜，制备过夜培养物。

3. 禽类样本的接种

  1. 培养物稀释与涂布
    1. 将过夜培养物用BPW进行一系列10倍梯度稀释，使最终浓度约为1 × 108 至 1 × 101 CFU/mL。假设沙门氏菌（Salmonella）过夜培养物的浓度为1 × 109 CFU/mL。
    2. 将0.5 mL过夜培养物转移至4.5 mL BPW中，混匀，然后从该稀释液中取0.5 mL再转移至4.5 mL BPW中，以完成后续每一步的稀释。
      1. 取1 × 103 CFU/mL稀释液各10 µL，分别涂布于BHI琼脂平板上，每个样品设三个重复，用于菌落计数以确定过夜培养物的实际浓度。
  2. 肉样接种
    1. 无菌操作下，将25 g辐照灭菌的绞鸡肉分别放入两个无菌均质袋中。袋子尺寸为7.5 × 12英寸，标示容量为1.63 L。袋内设有滤膜隔层，孔径为330 µm，每平方厘米分布285个孔。
    2. 向每个样品中加入1 mL目标浓度的菌液稀释液。例如，加入1 mL来自1 × 10³ CFU/mL稀释度的菌液，以达到约1,000个细胞/25 g鸡肉的污染水平。使用无菌涂布棒将接种液轻轻均匀涂布于鸡肉样品表面，随后在4 °C静置1小时。
    3. 通过加入1 mL无菌BPW制备阴性对照样品。

4. 样品处理

  1. 向每个样品中加入 225 mL BPW。该体积与培养基的比例选择依据为 FSIS MLG 4.154。
  2. 使用 Stomacher7 以正常速度均质样品，持续时间为 120 秒。
  3. 离心与重悬
    1. 使用 50 mL 移液管小心从滤膜袋的过滤侧取出液体，并将液体分装至两个无菌离心管中。
    2. 用无菌 BPW 平衡离心管，确保重量相等。在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。用无菌刮勺将菌体沉淀重悬于 3 mL BPW 肉汤中。
    3. 再加入 27 mL BPW 肉汤，用刮勺充分搅拌混匀。将两个离心管中的内容物合并至同一个离心管中，每个样品保留一个离心管。

5. MPN 板块设置

注意：表1展示了48孔板中稀释方案的示意图。

  1. 将重悬的样品各 3 mL 加入 48 孔板第 1 列的每个孔中（8 个重复）。
  2. 使用八通道移液器在板内第 1 至第 6 列进行连续 10 倍梯度稀释。
  3. 取 0.3 mL 样品加入 2.7 mL BPW 中，用移液器混匀。每种稀释度均重复此操作。将板在 37 °C、约 100 rpm 振荡条件下孵育过夜（约 18 小时）。

6. 涂布与计数

  1. 改良滴板计数法
    1. 使用多通道移液器，在琼脂平板上以 4 × 6 网格形式，每点接种 7 µL 过夜培养的各稀释度样品（图 2）。相较于常见的 6 × 6 液滴网格，采用两个平板上的 4 × 6 网格更有利于容纳 8 个样品8。
    2. 接种后将平板静置晾干 10 分钟，随后于 37 °C 培养过夜（约 18–24 小时）。培养结束后，统计每块平板上的菌落数量。

7. qPCR检测 沙门氏菌

  1. 使用商业试剂盒提取DNA
    1. 通过反复吹打将48孔板中的培养物混匀。将每种培养物200 µL转移至96孔PCR板中。
    2. 密封后以6,600 × g 离心10分钟。弃去上清液，在沉淀中加入20 µL试剂盒试剂。
    3. 通过吹打重悬沉淀。密封后在99 °C加热10分钟，随后冷却至20 °C。
    4. 再次以6,600 × g 离心10分钟。取2 µL上清液用于qPCR分析。
  2. 板式设置
    1. 按照既定方案9配制qPCR反应体系：10 µL 2× Master Mix；每种引物和探针各0.4 µL（10 µM工作液）：invA正向引物：5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3'，invA反向引物：5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'，invA探针：5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3'，标记Cal Fluor Orange 560荧光染料；0.2 µL内参扩增对照（IAC）模板（6 × 104 拷贝/µL）9；每种IAC引物和探针各0.4 µL（10 µM）：IAC正向引物：5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'，IAC反向引物：5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'，IAC探针：5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3'，标记TAMRA染料。用ddH2O调整总体积至20 µL。
    2. 进行实时PCR扩增，循环条件如下9：95 °C 10分钟（DNA初始变性及热启动聚合酶激活），随后进行40个循环：95 °C 15秒，60 °C 1分钟；使用默认Ct值设置导出结果用于分析。

8. 使用 3M MDS 检测法进行检测

  1. 按照沙门氏菌（Salmonella）分子检测试剂盒说明书操作。用移液器反复吹打数次，混匀48孔板中的培养物。向试剂盒提供的裂解管中加入每个样本20 µL。
  2. 将样本在100 °C加热15分钟，溶液颜色由粉红色变为黄色。室温孵育10分钟，溶液颜色由黄色变回粉红色。
  3. 将20 µL裂解液转移至试剂管中，并将试剂管放入支架内。
  4. 将支架放入MDS仪器中，并设置软件以传输试剂盒和样本的相关信息。仪器要求每个孔位均标注检测所用试剂盒的批号及样本名称。运行MDS软件并导出报告。

9. 数据分析

  1. 阳性与阴性结果的判定。
    1. 对于 4 × 6 点种培养，若琼脂平板上的点样位置出现至少 1 个菌落，则判为阳性；若无任何生长，则判为阴性。
    2. 对于定量 PCR（qPCR），扩增曲线的 Ct 值小于或等于 30 的反应孔判为阳性，Ct 值大于 30 的反应孔判为阴性。
    3. 对于微液滴系统（MDS），依据 MDS 系统报告的结果，直接判定为阳性或阴性。
  2. 最可能数（MPN）计算
    1. 采用先前描述的简单最大概率解析法（SMPR）6 或其他经过验证的 MPN 计算工具10，对标注的阳性与阴性结果进行分析。

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结果

辐照肉类
在回归分析中，斜率为1表示自变量（x轴）每增加一个单位，因变量（y轴）恰好增加一个单位。这表明两个变量之间存在比例关系，即因变量的变化与自变量的变化相等。截距为0意味着当自变量为0时，因变量也为0。这表明两个变量之间的关系不存在固定的偏移或偏差。斜率为1且截距为0共同表明变量之间具有一致性11,12。这种理想情况表明不存在系统误差或偏差，在测量值与预测值完全吻合的良好校准系统中，预期会出现此结果。

图3A展示了MPN-LAMP检测结果（y轴）与步骤3.1.1注释中所述涂布平板分析验证的理论接种量（x轴）之间的关系。回归直线方程为 y = -72.36 + 0.161x，R²值为0.978，表明MPN-LAMP结果与接种细菌水平之间具有较强的线性相关性。较高的R²值说明MPN-LAMP检测在细菌污染的定量预测方面具有很高的可靠性。然而，斜率0.161与理想斜...

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讨论

该实验方案的意义
沙门氏菌仍是食品安全领域的主要关注点，尤其是在禽类产品中，这类产品常与食源性疾病暴发相关13,14。作为美国细菌性食源性疾病的首要致病原因，建立可靠的检测方法以在新鲜及即食禽类产品中检测沙门氏菌，对保障食品安全至关重要15。能够在低浓度水平下定量检测沙门氏菌，对于发现可能被忽视的污染具有重要意义。方法的灵敏度在法规合规和公共卫生方面尤为关键，因为即使少量沙门氏菌也可能导致疾病，特别是在易感人群中。

MPN-LAMP 检测利用 MDS 系统（目前 FSIS 在 MLG 4.15 中使用该系统）来确定污染的流行情况4。本文介绍的检测方法扩展了当前 FSIS 方法，能够对存活的 Salmonella 进行定量，即使在低水平时也...

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披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由美国农业部农业研究局（USDA-ARS）国家项目108资助，项目编号分别为8072-42000-093-000-D和8072-42000-094-000-D。本文中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
48孔深孔板 4.6 mlFisher Scientific International, IncNC1964628
琼脂 - 凝固剂（Difco）Becton, Dickinson and Company (BD)281230
分析天平Mettler ToledoJL602-G/L设备 
分析天平Mettler ToledoAB54-S仪器设备 
高压灭菌器 - Amsco Lab250，实验室蒸汽灭菌器Steris plcLV-250设备 
生物安全柜，A2型，Purifier Logic+Labconco Corporation302411101设备 
脑心浸液（BHI）肉汤Becton, Dickinson and Company (BD)237500
缓冲蛋白胨水伯乐生命科学公司3564684
细胞涂布棒 - L型VWR76208-438
离心机 微型离心机 5424Eppendorf5424仪器设备
Avanti J-25 离心机Beckman Coulter, Inc. 设备
DNA提取——PreMan Ultra样品制备试剂 Thermo Fisher Scientific Inc. 4318930
碎鸡肉 当地零售商
IAC 正向引物  引物：5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'Integrated DNA Technologies 
IAC探针：5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC
5' TAMRA/3' BHQ-2 标记的 CACCA-3'		Biosearch Technologies
IAC 反向引物：5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'Integrated DNA Technologies 
孵育摇床 - Inova 4230 孵育摇床新不伦瑞克科学公司4230设备 
接种环 - Combi Loop  10µL 和 1µL Fisher Scientific International, Inc22-363-602
invA 正向引物：5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG
G-3'		Integrated DNA Technologies 
invA 探针：5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC
5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1 标记的 CTTCCTC-3'		Biosearch Technologies
invA 反向引物：5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'Integrated DNA Technologies 
辐照处理德克萨斯A&M 农业生命研究中心国家电子束研究中心服务
Luria Bertani (LB) 肉汤Becton, Dickinson and Company (BD)244620
手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+Mettler Toledo17014382设备
手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-100XLS+Mettler Toledo17014384仪器设备
手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+Mettler Toledo17014388设备
手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+Mettler Toledo17014391设备
手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+Mettler Toledo17014392仪器设备
手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+Mettler Toledo17013805设备
手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-20XLS+Mettler Toledo17013803设备
培养基储存瓶 - PYREX 1 L 方形玻璃瓶  带GL45螺口盖的瓶子康宁公司1396-1L设备
PYREX 2L 圆形广口瓶，GLS80 螺口盖，用于培养基储存康宁公司1397-2L仪器设备
96孔微孔板，平底，聚苯乙烯，0.34 cm²，无菌，108块/箱MilliporeSigmaZ707902
混匀器 - Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236仪器设备
分子检测试剂盒 2-沙门氏菌套件NeogenMDA2SAL96
分子检测仪器 NeogenMDS100仪器 
电动移液器控制器，PIPETBOY2INTEGRA Biosciences Corp.155019仪器设备
PCR预混液2× TaqMan 基因表达 Thermo Fisher Scientific Inc. 4369542
培养皿旋转器 -  bioWORLD 接种转盘Fisher Scientific International, Inc3489E20仪器
带透明盖培养皿（100 mm × 15 mm）Fisher Scientific International, IncFB0875713
移液器吸头 GP LTS 1000µL S 768A/8Mettler Toledo 30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10Mettler Toledo30389270
移液器吸头 GP LTS 200µL F 960A/10Mettler Toledo30389276
即食鸡肉产品当地零售商
试剂储液槽，25 mL无菌储液槽，用于多通道移液器Thermo Fisher Scientific Inc. 8093-11
实时荧光定量PCR - 7500 实时荧光定量PCR系统 （Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）2750036476仪器设备
血清移液管，Nunc 血清移液管（10 mL）赛默飞世尔科技公司 170356N
血清移液管，Nunc 血清移液管（2 mL）Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
血清移液管，Nunc 血清移液管（25 mL）赛默飞世尔科技公司 170357N
血清移液管，Nunc 血清移液管（50 mL）Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
涂布棒 - Fisherbrand L型细胞涂布棒Fisher Scientific International, Inc14-665-230
Stomacher 均质袋，Nasco Whirl-Pak 可书写均质搅拌滤袋Thermo Fisher Scientific Inc. 01-812
Stomacher 80 Biomaster 实验室均质器Seward30010019设备
热循环仪（GeneAmp PCR system 9700）Applied Biosystems535028293仪器设备
水过滤 - Elga Veolia Purelab Flex Elga LabWaterPF2XXXXM1-US设备
Whirlpak 1.63L 袋 VWR11216-777

参考文献

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DNA PCR

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