在低水平下准确量化家禽中的沙门氏菌是当前工业界和监管领域面临的一项挑战。本方案描述了一种MPN检测方法，可用于定量生制及即食家禽产品中的沙门氏菌。该方法快速、灵敏，且符合食品安全检验局（FSIS）的指南要求，有助于提升食品安全并支持公共卫生工作。
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摘要
摘要
Salmonella 是美国食源性疾病的主要致病原因，尤其常见于禽类产品中。传统的Salmonella检测方法侧重于检出率而非定量分析，这限制了其在评估污染水平和风险方面的作用。本研究介绍了一种新型的最可能数（MPN）检测方法，旨在对即食类禽类产品（如鸡肉可乐饼）中的Salmonella进行定量分析。该方法包括清洗禽类样品，通过离心浓缩洗涤液，并在48孔板中进行系列稀释。MPN检测与环介导等温扩增（LAMP）技术相结合，可在与现有美国食品安全检验署（FSIS）检测方案相同的时间范围内，实现对Salmonella污染的高灵敏度、准确且快速的定量。结果显示，MPN-LAMP测定值与理论接种水平之间具有良好的线性相关性（R² = 0.933）。然而，在较低浓度下存在一定的变异性，表明在这些水平上准确检测Salmonella仍具挑战性，实际检测限估计约为300 CFU/g。为进一步提升该方法的适用性，可能的优化方向包括增加取样量以进一步降低检测限、优化增菌培养基配方，以及扩展分子检测以靶向多种Salmonella血清型。总体而言，本研究为食品行业提供了一种实用工具，可对禽类产品中的Salmonella污染进行可靠定量，有助于提升食品安全和公共健康水平。
引言
作为美国食源性疾病、住院和死亡的主要原因，Salmonella 对公共卫生和经济具有重大影响。仅在2013年，该病原体造成的经济损失估计达36.7亿美元1。尽管近期的监管举措旨在到2030年将沙门菌感染病例减少25%2，但当前检测和防控策略仍存在明显不足，特别是在将加工企业的监测与公共卫生结果相衔接方面3。
即食冷冻禽类产品已牵涉多起沙门氏菌（Salmonella）暴发事件，对公共卫生构成重大关切。为此，美国食品安全检验局（FSIS）已将沙门氏菌（Salmonella）列为这些产品中的污染物。目前，FSIS 微生物学实验室指南（MLG）4.15 仅专注于确定禽类产品中沙门氏菌（Salmonella）的检出率4。根据该指南，采集的样品需增菌培养 18–24 小时，随后使用分子检测系统（MDS）进行筛查，该系统仅能判断沙门氏菌（Salmonella）的存在与否，而无法提供污染水平的相关信息。尽管该方法在病原体检出方面具有重要价值，但未能提供可用于帮助食品加工企业更准确评估污染风险并采取针对性纠正措施的定量数据。
本研究中，我们建立了一种方法，将微生....
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方案
注意：本方案相关的所有操作均应在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。在适当情况下，应在生物安全柜（BSC）内执行本方案，以维持无菌条件，并最大限度降低样本污染或操作人员暴露于微生物病原体的风险。当需要将样本转移出生物安全柜时，应使用密封容器，以保持样本完整性，并防止意外跌落时发生泄漏。建议在整个操作过程中使用一次性耗材，以减少交叉污染的可能性。在无法使用一次性物品的情况下，应确保所有设备和材料在使用前均处于无菌状态。妥善的废弃物管理至关重要；所有使用过的一次性耗材均应作为生物危害废物丢弃。可重复使用的材料在再次使用前必须经过高压灭菌，以确保充分灭菌并有效封存潜在有害物质。遵守这些预防措施不仅有助于保护样本的完整性，还能最大限度降低操作人员接触微生物病原体的风险。
1. 肉类样品的制备
- 肉类样品的获取与处理
- 新鲜肉类
- 从当地零售商的新鲜肉类部门获取绞鸡肉。将所有样品转移至4 °C条件下储存，并在收到后24小时内进行处理。以无菌操作将肉类分成每份25 g的样品。
- 对样品进行真空密封并辐照。本研究中，由德克萨斯农工大学AgriLife电子束研究中心（Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research）对肉类进行约25 kGy剂量的辐照。
注意：尽管本....
- 新鲜肉类
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结果
辐照肉类
在回归分析中，斜率为1表示自变量（x轴）每增加一个单位，因变量（y轴）也恰好增加一个单位。这表明两个变量之间存在比例关系，即因变量的变化与自变量的变化相等。截距为0意味着当自变量为0时，因变量也为0。这表明两个变量之间的关系不存在固定的偏移或偏差。斜率为1且截距为0共同表明变量之间具有一致性11,12。这种理想情况说明不存在系统误差或偏差，在测量值与预测值完全吻合的良好校准系统中，预期会出现此结果。
图3A展示了MPN-LAMP检测结果（y轴）与步骤3.1.1注释中所述涂布平板分析验证的理论接种量（x轴）之间的关系。回归直线方程为 y = -72.36 + 0.161x，R²值为0.978，表明MPN-LAMP结果与接种细菌水平之间具有较强的线性相关性。较高的R²值说明MPN-LAMP检测在细菌污染的定量预测方面具有高度可靠性。然而，斜率0.161与理想斜.......
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讨论
该实验方案的意义
沙门氏菌仍是食品安全领域的主要关注点，尤其是在禽类产品中，这类产品常与食源性疾病暴发相关13,14。作为美国细菌性食源性疾病的首要致病原因，建立可靠的检测方法以在新鲜及即食禽类产品中检测沙门氏菌，对保障食品安全至关重要15。能够在低浓度水平下定量检测沙门氏菌，对于发现可能被忽视的污染具有重要意义。方法的灵敏度在法规合规和公共卫生方面尤为关键，因为即使少量沙门氏菌也可能导致疾病，特别是在易感人群中。
MPN-LAMP 检测利用 MDS 系统（目前 FSIS 在 MLG 4.15 中使用该系统）来确定污染的流行情况4。本文介绍的检测方法扩展了当前 FSIS 方法，能够对存活的 Salmonella 进行定量，即使在低水平时也.......
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披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国农业部农业研究局（USDA-ARS）国家项目108资助，项目编号分别为8072-42000-093-000-D和8072-42000-094-000-D。本文中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48孔深孔板 4.6 ml | Fisher Scientific International, Inc | NC1964628 | |
| 琼脂 - 凝固剂（Difco） | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | JL602-G/L | 设备 |
| 分析天平 | Mettler Toledo | AB54-S | 仪器设备 |
| 高压灭菌器 - Amsco Lab250，实验室蒸汽灭菌器 | Steris plc | LV-250 | 设备 |
| 生物安全柜，A2型，Purifier Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | 设备 |
| 脑心浸液（BHI）肉汤 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 237500 | |
| 缓冲蛋白胨水 | 伯乐生命科学公司 | 3564684 | |
| 细胞涂布棒 - L型 | VWR | 76208-438 | |
| 离心机 微型离心机 5424 | Eppendorf | 5424 | 仪器设备 |
| Avanti J-25 离心机 | Beckman Coulter, Inc. | 设备 | |
| DNA提取——PreMan Ultra样品制备试剂 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4318930 | |
| 碎鸡肉 | 当地零售商 | ||
| IAC 正向引物 引物：5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3' | Integrated DNA Technologies | ||
| IAC探针：5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC 5' TAMRA/3' BHQ-2 标记的 CACCA-3' | Biosearch Technologies | ||
| IAC 反向引物：5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3' | Integrated DNA Technologies | ||
| 孵育摇床 - Inova 4230 孵育摇床 | 新不伦瑞克科学公司 | 4230 | 设备 |
| 接种环 - Combi Loop 10µL 和 1µL | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| invA 正向引物：5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3' | Integrated DNA Technologies | ||
| invA 探针：5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1 标记的 CTTCCTC-3' | Biosearch Technologies | ||
| invA 反向引物：5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3' | Integrated DNA Technologies | ||
| 辐照处理 | 德克萨斯A&M 农业生命研究中心国家电子束研究中心 | 服务 | |
| Luria Bertani (LB) 肉汤 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 244620 | |
| 手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | 设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | 仪器设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | 设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | 设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | 仪器设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | 设备 |
| 手动移液器 Pipet-Lite 多通道移液器 L8-20XLS+ | Mettler Toledo | 17013803 | 设备 |
| 培养基储存瓶 - PYREX 1 L 方形玻璃瓶 带GL45螺口盖的瓶子 | 康宁公司 | 1396-1L | 设备 |
| PYREX 2L 圆形广口瓶，GLS80 螺口盖，用于培养基储存 | 康宁公司 | 1397-2L | 仪器设备 |
| 96孔微孔板，平底，聚苯乙烯，0.34 cm²，无菌，108块/箱 | MilliporeSigma | Z707902 | |
| 混匀器 - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | 仪器设备 |
| 分子检测试剂盒 2-沙门氏菌套件 | Neogen | MDA2SAL96 | |
| 分子检测仪器 | Neogen | MDS100 | 仪器 |
| 电动移液器控制器，PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | 155019 | 仪器设备 |
| PCR预混液2× TaqMan 基因表达 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4369542 | |
| 培养皿旋转器 - bioWORLD 接种转盘 | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | 仪器 |
| 带透明盖培养皿（100 mm × 15 mm） | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| 移液器吸头 GP LTS 1000µL S 768A/8 | Mettler Toledo | 30389273 | |
| Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| 移液器吸头 GP LTS 200µL F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| 即食鸡肉产品 | 当地零售商 | ||
| 试剂储液槽，25 mL无菌储液槽，用于多通道移液器 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| 实时荧光定量PCR - 7500 实时荧光定量PCR系统 | （Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城） | 2750036476 | 仪器设备 |
| 血清移液管，Nunc 血清移液管（10 mL） | 赛默飞世尔科技公司 | 170356N | |
| 血清移液管，Nunc 血清移液管（2 mL） | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| 血清移液管，Nunc 血清移液管（25 mL） | 赛默飞世尔科技公司 | 170357N | |
| 血清移液管，Nunc 血清移液管（50 mL） | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170376N | |
| 涂布棒 - Fisherbrand L型细胞涂布棒 | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Stomacher 均质袋，Nasco Whirl-Pak 可书写均质搅拌滤袋 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| Stomacher 80 Biomaster 实验室均质器 | Seward | 30010019 | 设备 |
| 热循环仪（GeneAmp PCR system 9700） | Applied Biosystems | 535028293 | 仪器设备 |
| 水过滤 - Elga Veolia Purelab Flex | Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | 设备 |
| Whirlpak 1.63L 袋 | VWR | 11216-777 |
参考文献
- Batz, M., Hoffmann, S., Morris, J. G. Disease-outcome trees, eq-5d scores, and estimated annual losses of quality-adjusted life years (qalys) for 14 foodborne pathogens in the united states. Foodborne Pathogens and Disease. 11 (5), 395-402 (2014).
- The Grand Challenge: Salmonella. , United States Department of Agriculture.
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重印与许可
