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利用单细胞微升液滴培养组学系统实现微生物单克隆的自动化与高通量培养及挑取

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DOI：

10.3791/67925

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2025年3月14日

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1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

本文内容

摘要

本方案描述了如何使用单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）进行微生物单克隆分离、培养和挑取。MISS cell 基于液滴微流控技术，实现了集成化的工作流程，具有优异的液滴单分散性、高通量平行培养以及高通量生物量检测能力。

摘要

纯细菌培养物对于微生物培养组学的研究至关重要。基于固体平板、孔板和微反应器的传统方法由于操作繁琐且通量较低，限制了微生物培养组学研究的快速进展。为解决这些挑战，我们成功开发了单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell），这是一种利用液滴微流控技术进行微生物单克隆分离、培养和筛选的自动化高通量平台。该系统可在短时间内生成大量单细胞液滴，并实现单克隆菌落的培养、筛选与收集，从而促进从微生物分离到挑取的全流程一体化。在本实验方案中，我们以人肠道微生物群的分离与培养为例，展示了该系统的应用，并与固体平板培养法在微生物分离效率、单克隆培养性能及筛选通量方面进行了比较。实验流程简便，试剂消耗极低。与固体平板培养法相比，MISS cell 能够培养出更多样化的肠道微生物物种，为微生物培养组学研究提供了重要的潜力与价值。

引言

微生物培养组学在食品工业中有益微生物的研究、环境微生物多样性分析、新型抗菌化合物的筛选以及与疾病相关的肠道微生物组研究中具有广泛应用1,2,3,4。传统方法主要依赖固体平板、孔板或微型反应器来获得并挑取单克隆菌落，虽然操作简便，但由于步骤较多，通量较低。这一局限性制约了微生物诱变筛选、微生物培养组学研究以及高产菌株筛选等需要大规模单克隆筛选的应用。

近年来，已设计出多种单细胞检测与分液装置，可显著提高微生物样品的处理速度，同时减少人工操作所需的人力并最大限度降低人为误差5。然而，这些仪器通常仅针对传统方法中的特定步骤进行优化，往往需要复杂的设备集成，占用较大空间，且成本高昂。因此，迫切需要开发一种低成本、具有广泛适用性的微生物培养与筛选平台，以弥补上述不足。

在我们之前的研究中，我们成功开发了一种自动化的高通量筛选平台，称为单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell，下文简称为 "组学系统"）6。该平台采用液滴微流控技术，在微生物分离、培养和挑取的自动....

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方案

所有研究程序均符合相关伦理规范。研究程序已获清华大学科学技术伦理委员会批准。为研究人类肠道微生物群，粪便样本采集自一名无重大医学病史的健康成人，该成人已签署书面知情同意书。

1. 仪器安装

  1. 将Omics系统仪器置于洁净或无菌环境中（例如无菌室或厌氧操作台）。该仪器为精密设备，放置时需考虑以下事项：
    1. 使仪器处于常压和常温条件下。
    2. 避免将仪器靠近强电场、强磁场及热辐射源。
    3. 确保仪器放置区域的空间尺寸不小于2,500 mm（深）× 1,500 mm（宽）× 2,000 mm（高）。
    4. 保持仪器所处环境的湿度低于60%。

2. 准备工作

  1. 依次开启组学系统、计算机和组学系统操作软件的电源。
  2. MISS细胞微管及液滴生成微流控芯片安装：
    1. 打开液滴生成与培养室的门图1A）并垂直取下微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。使用一次性注射器向液滴培养室内的加湿器中加入10 mL无菌蒸馏水（图1C）并重新安装微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。....

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结果

人类肠道微生物群构成了主要的微生物群落，估计肠道中约含有 4 × 1013 个微生物，显示出其数量庞大且组成复杂11。在本研究中，我们旨在分离和培养肠道微生物群，并采用固体平板法作为对照，以展示MISS细胞的高通量性能。

首先，我们使用相同的粪便悬液来比较两种方法的单细胞分离通量。在MISS细胞中，我们采用较低的微生物浓度，此时液滴中微生物的分布概率可根据泊松分布计算：P(λ,x) = λxe-λ/x!，其中λ表示每个液滴中的平均细胞数，可通过微生物浓度与液滴体积的乘积计算得出；x表示被包裹在液滴中的细胞数量。在此，我们使用的初始微生物悬液浓度为0.1（初始微生物浓度为50个细胞/mL，液滴体积为2.0 µL），表明空液滴、单细胞液滴和多细胞液滴出现的概率分别为90.5%（x = 0）、9.1%（x = 1）和0.4%（x ≥ 2）。

在Omi.......

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讨论

本方案概述了MISS细胞在微生物单克隆的自动化、高通量分离、培养、检测与收集中的操作流程。与传统方法相比，传统方法仅能分离和培养约20%-30%的肠道微生物群2,12，而使用Omics系统获得的单克隆克隆数量比固体培养板获得的数量高出1.97倍。该比较表明，MISS细胞在单细胞分离、单克隆培养和筛选方面具有优势。

对于单细胞分离，Omics 系统依据泊松分布获取单细胞液滴，从而确保良好的单克隆性。此外，Omics 系统的液滴生成速率达每小时最多 5,000 个，能够在实现高通量单细胞分离的同时，由于液滴体积小而显著降低试剂消耗。在液滴生成过程中，微管上的聚焦流通道被用于控制流体。Omics 系统通过注射泵将油相、样品溶液和气体推入聚焦流通道，从而形成液滴。用户可通过通道或直接观察液滴导管，判断液滴是否成功生成。微管和液滴生成微流控芯片上的硅胶管连接至 10 根液滴导管的末端。当某一根液滴导管中生成了足够数量的液滴（约 5,000 个）时，夹紧阀将自动夹闭该导管的硅胶.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由以下机构资助： 广东省重点领域研发计划（2024B1111130002）、河北省重点研发计划（22375503D）以及安徽工业微生物分子育种工程实验室开放项目（编号 ELMB-07）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 培养皿Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP5731-500EA用于固体培养基平板的制备
30 mL 粪便采样容器Boen Healthcare Co., Ltd611101用于收集粪便样本
37 °C 恒温培养箱上海一恒科技有限公司LRH-150用于在培养箱中培养固体平板
96 孔透明平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板Corning3599用于微孔板运动检测和液滴收集
琼脂Becton, Dickinson and Company214010用于固体培养基平板的制备
去气泡油洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell-S-oil液滴筛选过程中去气泡装置中的油相
去气泡装置洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell-S在进行液滴检测和收集前排除液滴间的气相
厌氧工作站常熟市海虞镇 氩氮空间设备经营部VGB-4CM 用于在厌氧条件下进行无菌操作和紫外灭菌
高压灭菌器普和西健康医疗设备有限公司MLS-830L用于对 BHI 培养基、EP 管等进行高压灭菌
脑心浸出液（BHI）肉汤青岛高科技工业园海博生物技术有限公司HB8297-1BHI 培养基的组分
配方列表：
38.5 g/L BHI 肉汤溶于蒸馏水中
涂布棒Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHS8151将微生物悬液接种至固体平板
离心管，15 mL北京新恒岩科技有限公司HB53397用于微生物悬液的制备
计算机联想E450软件安装及 MISS cell 仪器控制
冻存管Thermo Fisher2.0 mL用于粪便样本的保存
蒸馏水北京麦瑞德科技有限公司M306444-100ml加入加湿器中，以维持液滴培养室内的湿度
EP 管Thermo Fisher2.0 mL用于收集粪便样本
荧光倒置显微镜奥林巴斯生命科学（LS）CKX53检查并计算微生物浓度
甘油GENERAL-REAGENTG66258A用于菌株保存
血细胞计数板AcmecAYA0810-1ea用于计算微生物浓度
KClAmbeedA442876磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4 溶于蒸馏水中
KH2PO4MACKLINP815661磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4 溶于蒸馏水中
筛网滤器安平县九丰丝网制造有限公司200 目（0.075 mm），400 目（0.038 mm），800 目（0.018 mm） 去除粪便样本中未消化的食物残渣及较小颗粒物
微管及液滴生成微流控芯片洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISC-B2用于液滴生成和液滴培养
MISS cell 油洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell-BOS-B液滴微流控中的油相
MISS cell 软件洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell V3.2.4在 MISS cell 仪器上执行实验操作
Na2HPO4SolarbioD7292磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4 溶于蒸馏水中
NaClGENERAL-REAGENTG81793J生理盐水溶液的组分
配方列表：
9 g/L NaCl 溶于蒸馏水中
移液器eppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL用于液体操作
聚四氟乙烯管深圳市沃而热缩材料有限公司3401000141用于液滴培养。该材料已包含在微管及液滴生成微流控芯片中
采样瓶洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell-bottle用于微生物悬液的取样
单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）洛阳泰茂斯生物科技有限公司MISS cell-G3f用于微生物单克隆的分离、培养、检测和收集
超高速离心机Thermo FisherSorvall Lynx 4000 用于制备测序用微生物悬液
注射器江苏智予医疗器械有限公司10 mL吸取蒸馏水并注入液滴培养室的加湿器中
超低温冰箱SANYO 超低温 MDF-U4086S 用于菌株保存（-80 °C）

参考文献

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res....

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