方法文章

利用有机电化学晶体管转导胞外电子传递活性

DOI：

10.3791/67928

⸱

2025年1月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McKetta Department of Chemical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Austin, 3Microelectronics Research Center, The University of Texas at Austin, 4Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 5Simpson Querrey Institute, Northwestern University, 6Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 7Department of Biology, Stanford University, 8Department of Chemistry, University of Texas at Austin

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用有机电化学晶体管（OECTs）将Shewanella oneidensis的胞外电子传递（EET）活性转化为电信号的实验方案。这种杂化OECT系统具有更高的稳定性、灵敏度以及实现快速、高通量检测的潜力，是进行EET测量的有效工具。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胞外电子传递（EET）是一类特定微生物通过细胞膜将电子传递给外部电子受体的过程，从而将细胞代谢与其所处环境相连接。尽管目前EET研究主要以Geobacter和Shewanella为模型，但新兴研究表明，具有EET活性的物种也与发酵过程及人类肠道微生物组相关。利用EET连接生物系统与电子系统的潜力，本文介绍了一种使用有机电化学晶体管（OECT）将微生物EET活性转化为易于检测的电信号的实验方案。该系统可将细胞对外界刺激的响应应用于生物传感与生物计算。具体而言，我们证明了OECT中p型聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚(苯乙烯磺酸盐)（PEDOT:PSS）通道的去掺杂过程由Shewanella oneidensis的细胞EET驱动。通过基因线路对EET通量进行转录水平调控，我们验证了该杂合OECT系统检测化学刺激物（如诱导分子）的生物传感能力。此外，我们在细胞内引入基于质粒的布尔逻辑门，使其能够处理环境信号并驱动OECT中的电流变化，进一步展示了这些器件在生物计算方面的潜力。该方法为生物系统与电子器件之间提供了全新的接口，有望推动未来高通量筛选、生物传感及生物计算等应用的发展。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

能够将生物和化学活动转导并放大为电信号的器件在诸多领域中至关重要，例如传感1,2、神经形态计算3,4以及可穿戴电子设备5。其中，有机电化学晶体管（OECTs）因其与水相环境的兼容性以及低工作电压，已成为生物系统与电子读出系统之间卓越的界面器件6,7。OECTs 与传统电子器件不同，其利用电解质中的离子来调控有机沟道的电导率，通过耦合离子与电子传输实现极高的跨导性能8。这些特性使 OECTs 成为连接生物系统与电子器件的理想选择，因其能够放大微弱的生物信号并将其转化为电信号输出。

有机电化学晶体管（OECT）通过离子扩散改变混合离子-电子导电沟道的掺杂状态来工作，通常通过在栅极施加电压来控制这一过程。然而，生物反应或氧化还原反应也能改变沟道的电导率，从而使OECT能够响应多种化学和生物刺激。通过在OECT上修饰脂质双层、离子通道或生物分子，可使其检测特定分析物，因此在传感应用中具有实用价值9，10。例如，OECT已与具有氧化还原活性的酶（如葡萄糖氧化酶）集成，可将电子直接转移至沟道，从而根据葡萄糖浓度调节其电导率11。尽管此类结构在生物传感方面效果良好，但由于单个酶或蛋白质的行为相对简单，其计算能力受到限制。

相比之下，活细胞（尤其是细菌）提供了一个多功能平台，能够执行复杂且稳健的计算4,12,13,14,15。电活性细菌如Shewanella oneidensis和Geobacter sulfurreducens具有独特的跨细胞膜传递电子的能力，该过程称为胞外电子传递（extracellular electron transfer, EET）。在厌氧条件下，这些细菌将其代谢过程与外部电子受体（包括金属、金属氧化物以及导电聚合物16和纳米颗粒17等合成材料）的还原或氧化反应相偶联（图1A）。这一特性已被应用于微生物燃料电池以产生电能，并为更先进的生物电子应用提供了潜力18,19。此外，合成生物学的进步使得对电活性细菌进行精确的遗传操控成为可能，从而调控EET通路。通过构建调控EET相关基因表达的基因线路，研究人员能够根据特定环境信号或计算逻辑操作来调节电子流20,21。这种对EET的遗传控制为构建生物-混合系统开辟了途径，使细菌的计算过程可直接与OECT等电子器件相连接。例如，可设计细菌基因线路以响应多种化学输入信号，开启或关闭EET通路，从而调节OECT沟道的电导率。这将实现对细菌计算的直接电学读出，无需依赖荧光或其他传统生物学报告系统。

最近的研究进展表明，将有机电化学晶体管（OECT）与电活性细菌耦合具有巨大潜力。例如，Méhes 等人利用 S. oneidensis 与 p 型 OECT 结合，实现了对胞外电子传递（EET）活性的实时监测，展示了如何通过电信号追踪细菌代谢过程22。尽管该研究揭示了使用 OECT 检测细菌活性的可能性，但这种杂化系统在生物传感与生物计算方面的潜力仍有待深入探索。为解决这一问题，我们近期开发了将基因工程改造的 S. oneidensis 整合到 p 型 OECT 中的杂化晶体管23。结果表明，OECT 通道可通过细菌的 EET 活性实现去掺杂（图 1B）。为进一步增强生物传感能力并深入理解去掺杂过程的机制，我们设计了携带调控 EET 通量的基因回路的 S. oneidensis 菌株。这使得 OECT 输出能够根据环境信号（如诱导分子）产生可预测的变化。此外，通过在这些基因回路中引入布尔逻辑，我们实现了对复杂细菌计算的直接电学读出。

本文介绍了杂化晶体管操作的完整实验方案，涵盖器件制备、细胞培养准备、测量步骤及数据分析。此外，还讨论了关键注意事项，包括器件清洗、可重复使用性以及在高通量检测中实现自动化的潜力。

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方案

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注意：所有化学品均未经进一步纯化直接使用。若无特殊说明，均使用分析纯化学品。

1. OECT 器件的制备

注意：OECT 器件采用标准的微加工技术在石英显微镜载玻片上制备，该技术借鉴自先前的研究24。如图 2A所示，八个 OECT 器件排列在一个标准载玻片上。将预先切割的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄片放置在载玻片上，以形成 OECT 腔室和通路端口。OECT 通道和栅极电极均采用 p 型导电聚合物聚（3,4-乙烯二氧噻吩）：聚（苯乙烯磺酸盐）（PEDOT:PSS）材料，通道尺寸为 150 µm × 10 µm，栅极尖端尺寸为 500 µm × 500 µm（图 2B）。OECT 通道制备及器件组装流程的概要如图 2C所示。

  1. 金电极的制备
    1. 用丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水（DI水）冲洗石英片进行清洗，然后用N2气体吹干。
    2. 使用50 sccm 的O2等离子体在150 W功率下清洗120秒。
    3. 分两步旋涂AZ5209e光刻胶（PR）：第一步以500 rpm转速、100 rpm/s加速度旋转5秒，第二步以2000 rpm转速、1000 rpm/s加速度旋转45秒。
    4. 在90 °C下硬烘150秒。
    5. 打开掩膜对准仪（Suss MA6），选择i线（365 nm）作为紫外光源，设置参数：曝光时间为3.5秒（13 W），对准间隙为15 µm，WEC类型为接触式，曝光类型为硬接触式。
    6. 将光刻掩膜和石英片装入对准仪中，对准石英片与掩膜，然后进行初次曝光。
    7. 在110 °C下反烘180秒。
    8. 取下光刻掩膜，进行泛光曝光，参数如下：曝光时间为25秒（13 W），曝光类型为泛光曝光（Flood E）。
    9. 使用厂家预稀释的AZ 400K 1:4显影液进行光刻胶显影。将适量显影液倒入培养皿中以浸没石英片，并持续以环形运动摇晃培养皿45秒。随后立即取出石英片，在去离子水中浸泡45秒，用去离子水冲洗，并用N2气体吹干。
      注：此步骤可暂停。
    10. 将石英片转移至电子束蒸发仪中，抽真空至2.7 × 10-4 Pa（2 × 10-6 T）或更低。
    11. 依次沉积钛粘附层（10 nm）和金层（100 nm）。沉积速率可能因所用蒸发仪不同而有所变化。建议采用0.1 nm/s的沉积速率，以在沉积质量和处理时间之间取得良好平衡。
    12. 将石英片在丙酮中浸泡过夜以去除多余的金属。浸泡后，使用移液器向石英片表面喷射丙酮流，以去除残留的多余金属。上述步骤完成后得到的石英片称为OECT电极片。
      注：也可使用超声处理辅助去除多余金属。
  2. PEDOT:PSS沟道的制备
    1. 用丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水（DI水）冲洗OECT电极片进行清洗，然后用N2气体吹干。
    2. 在160 °C下烘烤至少5分钟。旋涂前让石英片自然冷却。
    3. 分两步旋涂AZ5209e光刻胶：第一步以500 rpm转速、100 rpm/s加速度旋转5秒，随后以2000 rpm转速、1000 rpm/s加速度旋转45秒。
    4. 在90 °C下硬烘150秒。
    5. 使用i线在硬接触模式下进行初次曝光，条件为13 W功率下曝光3.5秒。
    6. 在110 °C下反烘180秒。
    7. 在13 W功率下进行25秒的泛光曝光。
    8. 使用AZ 400K 1:4显影液显影45秒，期间持续以环形运动摇晃培养皿。随后将石英片在去离子水中浸泡45秒，用去离子水冲洗，并用N2气体吹干。
      注：此步骤可暂停。
    9. 将PEDOT:PSS分散液瓶置于装有去离子水的超声水浴中（水位达到超声仪标线处），漂浮超声5分钟。使用0.22 µm滤膜过滤PEDOT:PSS分散液以去除团聚物。
    10. 以3500 rpm 转速、3500 rpm/s加速度旋涂PEDOT:PSS 60秒，在90 °C下干燥15分钟。
    11. 将石英片在丙酮中浸泡12分钟，随后进行1分钟超声处理，以去除多余的PEDOT:PSS薄膜。
    12. 用丙酮和异丙醇（IPA）依次冲洗石英片，然后用N2气体吹干。
    13. 将石英片置于90 °C热板上进行乙二醇（EG）处理，滴加足量EG覆盖所有PEDOT:PSS区域，处理5分钟。随后用去离子水冲洗，并用N2气体吹干。上述步骤完成后得到的石英片称为OECT片。
  3. PDMS器件腔室的制备
    1. 按10:1的比例混合PDMS基体与固化剂制备PDMS溶液。将溶液浇注至模具中，使其厚度达到3 mm，并在连接真空泵的双腔脱气室中脱气1小时。
    2. 将模具置于水平台面上，在室温下固化48小时，以确保PDMS表面平整光滑。覆盖模具以防止空气中颗粒污染。
    3. 使用剃刀片切割PDMS，并使用直径分别为5 mm和1.5 mm的圆形打孔器制作器件腔室和液体交换孔。确保PDMS高度为3 mm，与模具浇注时控制的厚度一致（步骤1.3.1）。

2. 培养基制备

  1. 将500 mL超纯水、四根不锈钢分配针、两个橡胶瓶塞（用于250 mL圆底烧瓶）、两个250 mL圆底烧瓶和一个500 mL玻璃培养基瓶进行高压灭菌。将灭菌后的超纯水储存于4 °C，以备后续使用。
  2. 根据表1配制添加了2倍沃尔夫微量矿物混合液（2x Wolfe's Trace Mineral Mix）和0.1%酪蛋白氨基酸（casamino acids）的2倍希瓦氏菌基础培养基（2x Shewanella basal medium, SBM）。使用瓶顶滤器将培养基过滤灭菌至无菌玻璃培养基瓶中（来自步骤2.1）。该培养基称为2x SBM++，每个“+”分别表示添加了微量矿物混合液和酪蛋白氨基酸。储存于4 °C以备后续使用。
  3. 分别用0.22 µm滤器对以下化学品进行过滤灭菌：将50 mL 1 M富马酸钠滤入无菌50 mL离心管中；将1 mL 2.5 mg/mL卡那霉素（KAN）（称为100x KAN）滤入无菌微量离心管中。将1 mL 60% w/w无菌乳酸钠（直接使用）分装至微量离心管中。将所有配制好的溶液储存于4 °C。
  4. 在无菌微量离心管中分别配制以下化学品各1 mL：100 mM异丙基-ß-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），称为100x IPTG；10 mM 3-氧代己酰基-高丝氨酸内酯（OC6），称为100x OC6；1 mM盐酸无水四环素（aTc），称为100x aTc。储存于4 °C以备后续使用。
  5. 使用步骤2.1中准备的灭菌烧瓶、橡胶塞和针头对培养基储备液进行气体置换。将200 mL灭菌2x SBM++和200 mL超纯水分别加入两个250 mL圆底烧瓶中。用橡胶塞密封烧瓶，并插入灭菌分配针以构建气体洗涤装置（进气针浸入液面下，出气针位于液面上方）。通入N2气体15分钟。
  6. 将脱气处理后的2x SBM++、超纯水、乳酸钠、1 M富马酸钠、100x KAN、100x IPTG、100x OC6和100x aTc转移至手套箱中，供后续OECT实验使用。

3. 使用OECT器件监测细胞电子传递

注意：为确保无氧环境，OECT 实验在室温下无湿度控制的手套箱中进行。

  1. 第1天
    1. 设备灭菌与准备
      1. 将OECT载玻片、PDMS膜和Ag/AgCl参比电极（RE）分别放入不同的容器中进行高压灭菌。在80 °C下烘烤干燥。将灭菌后的OECT载玻片和Ag/AgCl参比电极放入手套箱中。
      2. 将PDMS片置于手套箱前室中抽真空4小时，以解吸其中截留的氧气。在手套箱内将PDMS片覆盖于OECT载片上，组装OECT器件。
      3. 向每个OECT腔室中注入45 µL适当的SBM培养基。大多数实验使用添加20 mM乳酸盐的1x SBM++。例如，通过混合500 µL的2x SBM++、497 µL无菌超纯水和2.85 µL 60% w/w乳酸钠，配制1 mL的1x SBM++。
      4. 用PDMS片覆盖OECT腔室端口，以避免培养基蒸发和污染。
      5. 监测OECT沟道电流IDS 在恒定通道电压 V 下DS -0.05 V 的栅极电压 VGS 0.2 V 的电压，直至电流稳定。电压的选择可能因 OECT 器件或生物样本的不同而有所变化。在整个测量过程中，对门电极和沟道使用相同的连续偏置电压。电流稳定可能需要数小时至数天，具体时间取决于前室的真空水平和脱附持续时间。
    2. 细胞培养
      1. 将保存于-80 °C的菌种划线接种至含有LB培养基（无质粒菌株）或含25 µg/mL卡那霉素的LB培养基（含质粒菌株）的琼脂平板上，于30 °C有氧条件下过夜培养20,23.
  2. 第2天
    1. 细胞制备（需氧培养）
      1. 从LB琼脂平板（步骤3.1.2.1获得）中随机挑取单菌落，接种于15 mL培养管中含2 mL 1×SBM++培养基（添加20 mM乳酸）的液体培养基中。将细胞在30 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。同时准备6 mL不含细胞的培养基作为非生物对照，用于后续的细胞洗涤步骤。
    2. 细胞制备（厌氧培养）
      1. 将含有待测菌株的LB琼脂平板转移至手套箱中。
      2. 从LB琼脂平板上随机挑取单菌落，接种于15 mL离心管中含1 mL相应SBM培养基的液体中，培养基需补充20 mM乳酸钠和40 mM延胡索酸钠。例如，配制用于IPTG诱导菌株的1 mL培养基（含1 mM IPTG和25 µg/mL KAN），可将500 µL 2x SBM++、437 µL无菌超纯水、2.85 µL 60% w/w乳酸钠、40 mM 1 M延胡索酸钠、10 µL 100 mM IPTG以及10 µL 2.5 mg/mL KAN混合均匀。
      3. 将细胞置于30 °C条件下静置培养18 - 24小时。为确保不同实验批次间的可比性，应保持一致的培养时间。
  3. 第3天
    1. 初始OECT电化学测量
      注意：有机电化学晶体管（OECT）的表征类型从静态类型（如恒定电压偏置）到动态类型（如栅极脉冲）不等。本文采用栅极电压阶跃测试来获取OECT的动态和静态特性。OECT与仪器（此处为多通道恒电位仪）之间的电气连接重构，通过定制的手动多路复用（MUX）电路板实现。也可开发自动化的MUX电路板以实现高通量测量。
      1. 测量OECT沟道电流IDS 对应于栅极电压从 0 V 到 0.2 V 的步进，具体设置如下所述（确切名称可能因仪器而异）。
      2. 仪器通道1测量OECT沟道电流IDS设置技术名称：快速安培法；平衡时间：1 秒；平衡电压：-0.05 V；偏置电压：-0.05 V；运行时间：14 秒；采样间隔：0.5 毫秒。
      3. 仪器通道2控制OECT栅极电压VGS设置技术名称：混合模式；条件时间：1 秒；条件电压：0 伏；第一阶段模式：恒定电位；第一阶段偏置电压：0 伏；第一阶段运行时间：4 秒；第二阶段模式：恒定电位；第二阶段偏置电压：0.2 伏；第二阶段运行时间：10 秒；采样间隔：0.5 毫秒。
      4. 对所有OECT重复进行栅极电压步进测试（步骤3.3.1.1至3.3.1.3）。此步骤可实现自动化，以进行高通量测试。
      5. 施加恒定通道电压 VDS -0.05 V 的栅极电压 VGS 在接种前，对所有OECT施加0.2 V的偏置电压。确保偏置电压与器件稳定期间（步骤3.1.1.5）所使用的电压相同。
    2. 接种物制备（需氧培养）
      1. 以1503 x g离心，洗涤细胞三次 g 4 分钟，然后在 1 中重悬 mL 新鲜培养基用于细胞生长（步骤 3.2.1.1）。在最后一次（3rd) 离心，用0.5 mL溶液重悬细胞 mL（或原始培养液体积的一半）以获得OD值对应的浓缩细胞悬液600 1 至 3.5。相应调整最终悬浮液的体积。
      2. 将细胞悬液转移至手套箱中。
      3. 为获得接种物，将细胞稀释至目标OD值600 0.1（或接种OD的10倍）600）。转接培养基的成分与生长培养基相同，但在手套箱中使用已脱气的培养基储备液新鲜配制。例如，若细胞在添加了乳酸盐的SBM++培养基中进行有氧培养，则在手套箱中新鲜配制添加乳酸盐的SBM++培养基用于接种物的稀释。
      4. 停止恒电位仪。向OECT腔室（内含45 µL适当的SBM）中注入5 µL接种物，以达到最终OD600 OECT 中的 0.01。用 PDMS 薄膜覆盖 OECT 腔室端口，以避免培养基蒸发和污染。
    3. 接种物制备（厌氧培养）
      1. 为获得接种物，将细胞培养物稀释10倍。使用与生长培养基成分相同但不含延胡索酸的稀释培养基。例如，若细胞是在补充有乳酸、延胡索酸、卡那霉素（KAN）和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的SBM++培养基中厌氧培养的，则在手套箱中配制新鲜的、添加乳酸、KAN和IPTG但不含延胡索酸的SBM++培养基用于接种物的稀释。
      2. 停止使用恒电位仪。向OECT腔室（内含45 µL适当的SBM）中注入5 µL接种物。用PDMS片覆盖OECT腔室的端口，以避免培养基蒸发和污染。
    4. 连续测量与时间点
      1. 对OECT通道施加恒定偏置电压（VDS = -0.05 V）和栅极（VGS 在整个实验过程中，电位仪保持在0.2 V，仅在进行时间点测量时，将电位仪连接至单个OECT以进行表征。
      2. 接种后运行实验24小时。将接种前的测量值（见步骤3.3.1）视为0小时时间点。
      3. OECT沟道掺杂状态的显著变化通常发生在最初的8小时内。在此期间应选择5至7个时间点进行测量，随后在12小时至16小时之间进行一次测量，最后一次测量在24小时时间点进行。示例时间点可包括接种后立即测量，以及接种后1小时、2小时、3小时、4.5小时、6小时、8小时、18小时和24小时。
      4. 为避免夜间测量，应在当天尽早开始接种（参见步骤 3.3.2 或 3.3.3），以便在前 8 小时内进行频繁的时间点取样。
      5. 对每个时间点的测量重复执行 3.3.1 步骤。
  4. 第4天
    1. 24小时时间点的转移曲线测量
      1. 将Ag/AgCl参比电极通过轻轻旋转并推入流体交换口的方式插入OECT腔室中。
      2. 通过监测沟道电流 I，同时将栅极电压从 -0.1 V 扫至 0.6 V，测量 OECT 的转移曲线DS 恒定偏压 VDS 在 -0.05 V 下，相对于 Ag/AgCl 参比电极测量栅极和源极电极的精确电势。
      3. 按照以下说明配置仪器（具体名称可能因仪器型号而异）。
      4. 仪器通道1测量OECT通道电流IDS, 使用以下设置：技术名称：计时安培法（CA），平衡时间：5 秒，平衡电压：-0.05 V，偏置电压：-0.05 V，运行时间：35 秒，采样间隔：0.09915 秒。
      5. 仪器通道2控制OECT栅极电压VGS，使用以下设置：技术名称：线性扫描伏安法（Linear Sweep Voltammetry, LSV），平衡时间：5 s，平衡电压：-0.1 V，起始电压：-0.1 V，终止电压：0.6 V，电压步长：0.002 V，扫描速率：0.02 V/s。
      6. 仪器通道3测量OECT源极电位VS 相对于Ag/AgCl参比电极，采用以下设置：技术名称：开路电位法（OCP），运行时间：40 s，采样间隔：0.09915 s。
      7. 仪器通道4测量OECT栅极电势VG 相对于Ag/AgCl参比电极，采用以下设置：技术名称：开路电位法（OCP），运行时间：40 s，采样间隔：0.09915 s。
      8. 对所有OECT重复转移曲线测量。每次测量后，用70%乙醇冲洗Ag/AgCl参比电极（RE），并用新的低绒布擦拭。Ag/AgCl参比电极可在同一样本组的三次重复实验中重复使用，但不应在不同样本组之间重复使用。

4. 数据分析

  1.  数据提取
    1. 使用自定义的 MATLAB 代码进行数据处理，以自动提取并记录仪器原生软件中的数据，显著缩短处理时间。MATLAB 脚本可从德克萨斯数据存储库获取（https://doi.org/10.18738/T8/MNKO8D）。
  2. 数据处理
    1. 拟合OECT沟道电流IDS 数据以获得速率常数 k，用于进一步分析和比较（图3）。对于具有EET能力的细胞样品，我们发现单指数模型提供了最佳拟合效果。因此，在分析软件中采用单相指数衰减模型对I进行拟合DS 时间序列数据，并获得拟合的速率常数 k。这 IDS 时间序列数据可以是原始值，也可以归一化至0小时时间点，因为速率常数k反映的是变化速率而非绝对值。
    2. 获取归一化的 IDS 通过分割 IDS 以0小时时间点的值为基准进行归一化处理（IDS0），称为 IDS/IDS0.
  3. 测定速率常数 k
    1. 打开分析软件（Prism 10，GraphPad），通过点击新建项目 文件 > 新 > 新项目文件在“创建”选项卡下，选择 XY在“选项”部分，将 X 设置为“数字”，将 Y 设置为“输入并绘制每个数据点的单个 Y 值”。
    2. 导入OECT沟道电流IDS 将数据添加到表格中。拟合 IDS 通过点击单相指数衰减模型来处理数据 分析 在“分析”选项卡中，找到 XY 分析中的非线性回归（曲线拟合）方法。请确保选择 所有需要在右侧进行拟合的数据集，然后点击 好的.
    3. 在新的参数窗口中，选择 单相衰减 指数组中的模型，然后单击 好的模型方程如下：
      Y = (Y₀ - 平台期) * e-k*X + 高原
      ​其中：Y 为 OECT 通道的电流 IDS，T 为时间，k 为速率常数。
    4. 获得 k 值后，通过检查每次拟合的 R 平方值来评估拟合质量。良好的拟合应具有较高的 R2 高于 0.95。
  4. 非配对双尾学生t检验
    1. 为评估样本组间的统计学显著性，进行非配对双尾学生t检验。
    2. 打开分析软件，通过点击创建一个新项目 文件 > 新 > 新项目文件在“创建”选项卡下，选择 XY在“选项”部分，将 X 设置为“数字”，将 Y 设置为“在并列的子列中输入 3 个重复值”。
    3. 将拟合得到的速率常数 k 值导入表格中。通过点击执行 t 检验 分析 在“分析”选项卡中，于“列分析”部分找到 t 检验（及非参数检验）方法。请确保选择 每次两个数据集，然后点击 好的.
    4. 在实验设计手册中选择 未配对，是采用参数检验和非配对t检验，假设两个总体具有相同的标准差。每次比较将生成相应的p值。在图中，p值表示如下：n.s.：p<0.05；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p<0.0001 > 0.05（无显著性差异），*：p ≤ 0.05，**：p ≤ 0.01，***：p ≤ 0.001，****：p ≤ 0.0001。
    5. 对所有相关数据集重复步骤 4.4.3 至 4.4.4。

5. OECT 器件的清洗与可重复使用性

  1. 实验结束后，拆解装置，并将OECT载玻片放入肥皂水（肥皂：去离子水 = 1:10）中煮沸15分钟。
  2. 迅速将载玻片转移至盛有室温去离子水的烧杯中，静置5分钟使其冷却。用去离子水冲洗载玻片，并用洁净空气吹干。
  3. 使用万用表测量OECT沟道的电阻。若沟道电阻在原始值的400%范围内，则该器件可在灭菌后（步骤3.1.1）重复用于实验。OECT载玻片也可通过以下步骤清洗，并适用于采用步骤1.2进行沟道制备。
    警告：piranha溶液具有强腐蚀性，且可能产生大量热量。务必佩戴适当个人防护装备（PPE），包括手套、护目镜和实验服。操作时需格外小心，并遵守所在机构的安全指南。
  4. 在通风良好的通风橱中配制piranha溶液。在搅拌条件下，通过轻轻来回倾斜结晶皿，缓慢将30%（w/w）过氧化氢加入98%硫酸中，体积比为1:4。
  5. 将结晶皿置于加热至70 °C的加热板上。使用镊子将载玻片转移并浸入piranha溶液中，持续1分钟。
  6. 小心地将载玻片转移至盛有去离子水的烧杯中，静置至少1分钟。用去离子水彻底冲洗载玻片，并用空气吹干。
  7. 根据机构的化学废弃物处理规定处置piranha溶液。通过将piranha溶液缓慢加入盛有冰水混合物的烧杯中（体积约为溶液的4倍）进行中和。在监测pH试纸的同时，逐渐加入中和剂（如10 M NaOH），直至溶液呈中性。

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结果

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拟合速率常数 k
OECT 通道电流 IDS 的拟合速率常数 k 可作为评估样品胞外电子传递（EET）活性的可靠指标。尽管恒定的栅极偏压会影响速率常数，我们选择 0.2 V 的偏压，以确保提供正向偏置促进细菌电子传递，同时避免在较高栅压下发生快速去掺杂，并尽量减少对细菌细胞的电化学应力23。选择 -0.05 V 的漏极电压，以确保在对细菌细胞施加最小电化学应力的前提下获得可靠的电流测量结果。在这些条件下，拟合得到的速率常数能够显著区分不同菌株之间的 EET 活性差异。例如，EET 缺陷型菌株 ΔmtrC 和 ΔMtr 的拟合速率常数显著低于野生型 S. oneidensis MR-1（图 4A、B）。为恢复 EET 通量，通过引入 mtrC 和 mtrCAB 缓冲门控系统对 ΔmtrC

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讨论

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电化学电池（EC）比较
从OECT沟道电流拟合速率常数的一个主要优势在于，它通过关注电流变化的基本动力学过程，最大限度地减少了器件间的差异DS 相较于传统电化学电池（EC），该方法结合了有机场效应晶体管（OECT）固有的信号放大能力，能够增强杂化OECT系统的鲁棒性，且关注的是信号变化而非原始输出。例如，在每次24小时OECT实验结束后，通过扫描栅极电压V来测量转移曲线GS 从 -0.1 到 0.6 V。通过将栅极连接至工作电极（WE），将源极连接至对电极（CE）和参比电极（RE），在栅极与源极之间形成一个双电极EC，测得的IGS 即为工作电极（WE）的电流。因此，我GS 代表可与同一实验中OECT拟合速率常数进行比较的传统电化学结果。如图所示 图7A，IGS 诱导与非诱导的 mtrC+mtrC 菌株的重叠区域比 Mtr+ 更多mtrCAB 菌株（

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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NAND 电路的基础质粒由 Voigt 实验室通过 Addgene 慷慨提供（#49375、#49376、#49377）。本研究得到了 Welch 基金会（资助号 F-1929，B.K.K.）、美国国立卫生研究院（资助号 R35GM133640，B.K.K.）、美国国家科学基金会 CAREER 奖（1944334，B.K.K.）以及美国空军科学研究办公室（资助号 FA9550-20-1-0088，B.K.K.）的经费支持。A.J.G. 获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（项目资助号 DGE-1610403）的支持。作者感谢德克萨斯材料研究所、动态与材料控制中心（美国国家科学基金会材料研究科学与工程中心，DMR-1720595）以及美国国家科学基金会国家纳米技术协调基础设施（ECCS-1542159）部分支持的共享研究设施的使用。我们衷心感谢德克萨斯大学奥斯汀分校细胞与分子生物学研究所核心显微镜实验室所提供的设施支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-氧代己酰基高丝氨酸内酯 Sigma-Aldrich
盐酸脱水四环素 VWR
酪蛋白氨基酸 VWR
仪器
乙二醇 Sigma-Aldrich无水，99.8% 
HEPES缓冲液 VWR水溶液，1 M，pH = 7.3
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷ß Teknova
硫酸卡那霉素 Growcells
七水合硫酸镁(II) VWR
PEDOT:PSS水性悬浮液 Heraeus Epurio LLCClevios PH1000
磷酸氢二钾 Sigma-Aldrich
磷酸二氢钾Sigma-Aldrich
恒电位仪 PalmSens BVMultiPalmSens4
石英显微镜载玻片 AdValue FQ-S-003
石英显微镜载玻片 
氯化钠 VWR
DL-乳酸钠 TCI水溶液，60%
富马酸钠 VWR98%
硫酸 Sigma-Aldrich95.0%-98.0%
双组分硅酮弹性体 Electron Microscopy SciencesSylgard184
Wolfe's微量元素混合物 ATCC

参考文献

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  1. Luo, Y. F., et al. Technology roadmap for flexible sensors. Acs Nano. 17 (6), 5211-5295 (2023).
  2. Din, M. O., Martin, A., Razinkov, I., Csicsery, N., Hasty, J. Interfacing gene circuits with microelectronics through engineered population dynamics. Sci Ad. 6 (21), eaaz8344(2020).
  3. Markovic, D., Mizrahi, A., Querlioz, D., Grollier, J. Physics for neuromorphic computing. Nat Rev Phys. 2 (9), 499-510 (2020).
  4. Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497 (7451), 619-623 (2013).
  5. Ates, H. C., et al. End-to-end design of wearable sensors. Nat Rev Mater. 7 (11), 887-907 (2022).
  6. Rivnay, J., et al. Organic electrochemical transistors. Nat Rev Mater. 3 (2), e17086(2018).
  7. Rashid, R. B., Ji, X. D., Rivnay, J. Organic electrochemical transistors in bioelectronic circuits. Biosens Bioelectron. 190, 113461(2021).
  8. Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv Funct Mater. 17 (17), 3538-3544 (2007).
  9. Lubrano, C., Matrone, G. M., Iaconis, G., Santoro, F. New frontiers for selective biosensing with biomembrane-based organic transistors. Acs Nano. 14 (10), 12271-12280 (2020).
  10. Guo, K., et al. Rapid single-molecule detection of COVID-19 and MERS antigens via nanobody-functionalized organic electrochemical transistors. Nat Biomed Eng. 5 (7), 666-677 (2021).
  11. Pappa, A. M., et al. Direct metabolite detection with an n-type accumulation mode organic electrochemical transistor. Sci Adv. 4 (6), eaat0911(2018).
  12. Siuti, P., Yazbek, J., Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells. Nat Biotechnol. 31 (5), 448-452 (2013).
  13. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  14. Rubens, J. R., Selvaggio, G., Lu, T. K. Synthetic mixed-signal computation in living cells. Nat Comm. 7, 11658(2016).
  15. Rizik, L., Danial, L., Habib, M., Weiss, R., Daniel, R. Synthetic neuromorphic computing in living cells. Nat Comm. 13 (1), 5602(2022).
  16. Tseng, C. P., et al. Solution-deposited and patternable conductive polymer thin-film electrodes for icmrobial bioelectronics. Adv Mater. 34 (13), 2109442(2022).
  17. Dundas, C. M., Graham, A. J., Romanovicz, D. K., Keitz, B. K. Extracellular electron transfer by Shewanella oneidensis controls palladium nanoparticle phenotype. Acs Synth Biol. 7 (12), 2726-2736 (2018).
  18. Catania, C., Karbelkar, A. A., Furst, A. L. Engineering the interface between electroactive bacteria and electrodes. Joule. 5 (4), 743-747 (2021).
  19. Logan, B. E., Rossi, R., Ragab, A., Saikaly, P. E. Electroactive microorganisms in bioelectrochemical systems. Na Rev Microbiol. 17 (5), 307-319 (2019).
  20. Graham, A. J., et al. Transcriptional regulation of living materials via extracellular electron transfer. Nat Chem Biol. 20 (10), 1329-1340 (2024).
  21. Cao, Y. X., et al. A synthetic plasmid toolkit for Shewanella oneidensis MR-1. Front Microbiol. 10, 410(2019).
  22. Mehes, G., et al. Organic microbial electrochemical transistor monitoring extracellular electron transfer. Adv Sci. 7 (15), 2000641(2020).
  23. Gao, Y., et al. A hybrid transistor with transcriptionally controlled computation and plasticity. Nat Commun. 15 (1), 1598(2024).
  24. Yoo, B., Dodabalapur, A., Lee, D. C., Hanrath, T., Korgel, B. A. Germanium nanowire transistors with ethylene glycol treated poly(3,4-ethylenedioxythiophene): poly(styrene sulfonate) contacts. Appl Phys Lett. 90 (7), 072106(2007).
  25. Tahernia, M., et al. A 96-well high-throughput, rapid-screening platform of extracellular electron transfer in microbial fuel cells. Biosens Bioelectron. 162, 112259(2020).
  26. Ainla, A., et al. Open-source potentiostat for wireless electrochemical detection with smartphones. Anal Chem. 90 (10), 6240-6246 (2018).
  27. Rowe, A. A., et al. CheapStat: an open-source, "do-it-yourself" for analytical and educational applications. PLoS One. 6 (9), e23783(2011).
  28. Salyk, O., et al. Organic electrochemical transistor microplate for real-time cell culture monitoring. Appl Scil. 7 (10), 998(2017).
  29. Zhao, F. J., et al. Light-induced patterning of electroactive bacterial biofilms. Acs Synth Biol. 11 (7), 2327-2338 (2022).
  30. Tan, S. T. M., et al. Operation mechanism of organic electrochemical transistors as redox chemical transducers. J Mater Chem. 9 (36), 12148-12158 (2021).
  31. White, S. P., Dorfman, K. D., Frisbie, C. D. Operating and sensing mechanism of electrolyte-gated transistors with floating gates: Building a platform for amplified biodetection. J Phys Chem. 120 (1), 108-117 (2016).
  32. Huang, B., Gao, S., Xu, Z., He, H., Pan, X. The functional mechanisms and application of electron shuttles in extracellular electron transfer. Curr Microbiol. 75 (1), 99-106 (2018).
  33. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).

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