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预测并验证淫火汤对足细胞损伤及糖尿病肾病治疗的调控作用

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DOI：

10.3791/67939

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2025年6月20日

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

通过网络药理学和实验验证，本方案揭示了 Yinhuo Tang（YHT）治疗糖尿病肾病（DKD）的作用机制，以及 YHT 如何通过抑制 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路减轻 DKD 小鼠的足细胞损伤。

摘要

糖尿病肾病（DKD）是一种以大量蛋白尿和肾小球滤过率下降为特征的慢性肾脏疾病。DKD的主要病理特征是肾微血管病变，约40%的糖尿病患者会发展为DKD。足细胞相关蛋白CD2AP和WT-1在维持足细胞正常功能及肾小球滤过屏障完整性方面发挥关键作用。当足细胞结构或功能因炎症、氧化应激或其他病理损伤而受损时，裂孔隔膜和肌动蛋白细胞骨架遭到破坏，导致肾小球滤过屏障通透性增加，从而引起蛋白尿。淫火汤（YHT）是一种具有减少蛋白尿、延缓肾功能恶化作用的中药方剂，但其治疗DKD的作用机制尚不明确。本文基于网络药理学分析和动物实验，观察了YHT连续给药8周后db/db小鼠的血糖、肝功能、肾功能、血脂、肾脏病理变化、足细胞标志蛋白CD2AP和WT-1的表达水平，以及PI3K/AKT/NF-κB信号通路的变化。结果表明，YHT通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路，降低炎症因子的表达水平，从而减轻足细胞损伤，在延缓DKD进展中发挥保护作用。

引言

糖尿病肾病（DKD）是糖尿病常见且严重的并发症，目前仍是全球终末期肾衰竭的首要病因1。该疾病经历一系列复杂的病理过程，包括肾小球增大、系膜区扩张、肾小管间质纤维化以及细胞外基质成分的过度积聚2,3。尽管糖尿病管理手段已有所改善，现有疗法主要仍以控制血糖水平和血压为目标，仅能延缓DKD的进展，而无法逆转其根本的病理改变。这凸显了开发更全面且有效治疗方案的迫切需求4,5。

传统医学（TCM）已成为治疗糖尿病肾病（DKD）等慢性疾病的一种有前景的替代疗法6,7,8。TCM强调整体治疗理念，能够应对DKD复杂的多靶点特性。在多种TCM方剂中， Yinhuo Tang（YHT）已被证明具有多种生理功能，如滋阴（补充血容量）、补肾（增强肾功能）、清热（抑制炎症）和潜阳（降低血压）9,10,11。然而，目前对YHT缓解DKD作用机制的系统性认识仍然不足。

足细胞相关蛋白CD2AP是足细胞中的关键蛋白，对维持滤过屏障的完整性至关重要，而WT-1在肾脏发育和纤维化过程中发挥重要作用12,13,14,15,16。因此，这两种蛋白的正常功能对肾小球正常滤过功能至关重要。现有文献表明，这些靶点参与糖尿病肾病（DKD）的进展过程，我们推测YHT的活性成分可能通过与这些靶点相互作用而发挥治疗作用。本研究旨在验证这些相互作用，并深入阐明YHT调控DKD疾病通路的机制。

本研究采用网络药理学与动物实验相结合的方法，探讨一贯煎（YHT）治疗糖尿病肾病（DKD）的作用机制。网络药理学整合生物信息学工具，用于分析活性成分与生物靶点之间的复杂相互作用，有助于揭示YHT多靶点、多通路的作用特点17,18,19。传统的药物研发方法通常强调单一靶点干预，而网络药理学作为一种预测性工具，可帮助识别潜在的信号通路和分子靶点，为复杂治疗手段的作用机制提供初步理论依据。尽管网络药理学不能替代药物开发所必需的严格实验与监管流程，但它能够指导科学假设的提出，并优化早期研究的设计与方向20。

最终，本研究旨在弥合传统医学与现代医学之间的差距，为将中医药（TCM）整合到糖尿病肾病（DKD）治疗中提供科学依据。本研究的结果可能有助于开发更有效且更安全的DKD治疗策略，为常因副作用而受限的标准治疗提供替代方案。通过阐明益肾活血汤（YHT）的分子作用机制并验证其治疗潜力，我们希望展示中医药在DKD治疗中的广泛适用性。

方案

本研究共选取三十只6周龄雄性自发性2型糖尿病（C57BL/Ksj db/db）小鼠和六只相同遗传背景的雄性非糖尿病对照小鼠（db/m）。小鼠在长春中医药大学动物实验中心（许可证号：SYXK (JI) 2023-0014）的无菌SPF级环境中饲养2周。在此期间，给予常规维持饲料和无菌水。在2周饲养期的开始和结束时分别测定db/db小鼠的空腹血糖，仅两次检测结果均超过11.1 mmol/L的小鼠被纳入实验。本研究经长春中医药大学伦理委员会批准（编号：2024147）。

1. 药物制备

  1. YHT 的制备（表1)
    1. 选择 地黄 (30 g) Ophiopogon japonicus (10 g) 巴戟天 (10 g) 茯苓 （15 g），以及 五味子 （6克），用水冲洗药材以去除表面的杂质和灰尘。然后，将71克生药与710毫升蒸馏水混合，置于陶瓷罐中浸泡60分钟
    2. 在100 °C下煮沸后，将药液温度降至80 °C，持续60分钟，然后通过两层医用纱布过滤药渣。将滤液置于4 °C冰箱中保存。
    3. 向上述残渣中加入710 mL蒸馏水，重复步骤1.1.1和步骤1.1.2的浸泡过程一次；将液体置于4 °C冰箱中保存。
    4. 将步骤1.1.2和1.1.3所得的上述两种药液混合后，置于真空冷冻干燥机的物料盘中。启动真空泵，抽去冻干室内的空气，设置温度为-40 °C，维持6小时，使药液中的水分完全冻结为固态。随后将温度调节至-20 °C，持续36小时，使冰晶直接升华成气体。最后将温度升至40 °C，维持24小时以去除药液中残留的水分，关闭加热装置和真空泵，取出冻干粉末（YHT粉末）。
    5. 称取0.4615 g、0.923 g和1.846 g冻干YHT粉末，分别溶于1 mL生理盐水中，配制成浓度为0.4615 g/mL、0.923 g/mL和1.846 g/mL的YHT混悬液。
  2. 缬沙坦的制备
    1. 将缬沙坦（10.29 mg）加入50 mL PEG300中，充分振荡至完全溶解。
    2. 向步骤1.2.1所得溶液中加入50 mL生理盐水，充分振荡混匀，得到浓度为10.29 mg/mL的缬沙坦溶液。

2. 药物处理

注意：实验分为六组：正常对照组（CON）、模型组（MOD）、缬沙坦阳性对照组（POS）、YHT低剂量组（YH-L）、YHT中剂量组（YH-M）和YHT高剂量组（YH-H）。成人每日需要YHT 71 g。根据实验小鼠与人药物剂量换算公式，小鼠每日剂量约为9.23 g/kg：

小鼠等效实验剂量（g/kg）= 人体剂量（g）/ 体重（70 kg）× 9.1

  1. 用非惯用手牢固抓住小鼠的背部，使其头部、颈部和身体呈一条直线（以避免挣扎），并将1 mL灌胃针以接近小鼠食管生理弯曲的角度适当放置。将灌胃针从鼠嘴的口角处插入，压住舌头，紧贴腭部，然后轻轻向内推进至胃中。
  2. 用惯用手的食指缓慢推注药物，然后垂直拔出针头，完成灌胃操作。
    注意：药物剂量为10 mL/kg，持续给药4周。
    1. 对CON组和MOD组小鼠，以10 ml∙kg-1∙day-1的剂量灌胃给予生理盐水。
    2. 对POS组小鼠，以10.29 mg∙kg-1∙day-1的剂量灌胃给予缬沙坦混悬液。
    3. 对以下各组小鼠灌胃给予相应剂量的YHT：YH-L组为4.615 g∙kg-1∙day-1；YH-M组为9.23 g∙kg-1∙day-1；YH-H组为18.46 g∙kg-1∙day-1。

3. 评估 YHT 的疗效

  1. 血液和尿液生化指标检测
    1. 连续给药8周后，使用代谢笼收集小鼠24小时尿液，以7,992 × g 离心10分钟，弃去上清液，使用尿蛋白检测试剂盒测定尿蛋白水平。
    2. 用非优势手抓住小鼠背部以固定小鼠，并用同一只手的小指和无名指固定小鼠尾巴。用碘蒸气棉球消毒小鼠尾尖。用优势手持采血针迅速刺穿小鼠尾尖，从尾根向尾尖挤压，将血液滴加至血糖试纸上。
    3. 用非优势手握住小鼠尾巴，同时用拇指和食指固定肩胛区域，使小鼠腹部朝上。用优势手持装有苯巴比妥钠的1 mL注射器，将针头以30–45°角插入腹腔，深度为3–5 mm，进针位置位于脐部与后肢之间，针尖朝向头部。缓慢回抽注射器活塞检查是否有血液；若抽吸到血液，则相应调整针头位置。
    4. 缓慢注射戊巴比妥钠溶液以确保均匀给药，注射完成后拔出注射器。等待10分钟后，用优势手持镊子轻轻夹住小鼠后肢脚趾以检查反应。若仍有反应，可根据需要追加小剂量（10 mg/kg）。
      注：假设小鼠体重为60 g，苯巴比妥溶液浓度为1% w/v，则追加剂量为0.06 mL。
    5. 用剪刀修剪小鼠胡须及眼部周围的毛发，用非优势手按压需摘除眼球一侧的眼周皮肤，使眼球突出。用乙醇消毒眼球周围皮肤，用镊子迅速取出眼球，使血液滴入微量离心管（1.5–2 mL）中，在室温下孵育10分钟，以7,992 × g 离心10分钟，收集上清液。
    6. 根据试剂盒说明书测定血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的表达水平。
  2. 肾组织分离
    1. 采血后，将小鼠仰卧位固定于手术板上，剪除小鼠前胸部区域的毛发，用乙醇消毒前胸部区域，用剪刀剪开腹部皮肤，推开小肠和大肠以暴露肾脏。
    2. 取出小鼠肾组织，使用止血钳钝性分离骨膜，将左肾置于–80 °C冰箱中保存，右肾放入含4%多聚甲醛溶液的20 mL管中进行固定。
    3. 24小时后取出右肾，用蒸馏水短暂冲洗5分钟，依次使用梯度无水乙醇脱水（100% → 95% → 85% → 75%，每级5 分钟），梯度二甲苯透明（2 × 10 分钟），石蜡包埋，并在室温下使蜡块凝固21。随后，将其置于–20 °C冰箱中过夜。
    4. 取出蜡块，切成3 µm厚度的切片，放入水中展开，用载玻片捞出，置于40 °C恒温烘箱中烘烤30分钟，之后保存以供后续分析。
  3. 肾组织病理学分析
    1. 取出右肾，按上述步骤3.2.3进行梯度二甲苯脱蜡和无水乙醇脱水处理，然后用蒸馏水洗涤。
    2. 根据苏木精-伊红染色（H&E）、过碘酸-雪夫染色（PAS）和Masson染色试剂盒说明书进行染色。
    3. 再次按步骤3.2.3进行梯度无水乙醇脱水和二甲苯透明处理。
    4. 室温干燥后，使用中性树胶作为封片剂，将组织切片封固于载玻片上，盖上盖玻片。在光学显微镜下以400倍放大倍数观察并拍照。
  4. 肾组织免疫组织化学分析
    1. 取出右肾，按步骤3.2.3所述进行脱蜡和脱水处理，将切片置于10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，加热（125 °C，103 kPa）5分钟进行抗原修复。10分钟后取出切片，冷却至室温，用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。
    2. 将切片置于3%过氧化氢溶液中孵育10分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，再用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    3. 滴加10%山羊血清至切片上，确保血清均匀覆盖整个切片。将切片置于湿盒中，37 °C孵育30分钟，再用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    4. 滴加一抗COI-I（1:200）、α-SMA（1:200）、WT-1（1:200）、CD2AP（1:200）（见材料表），置于湿盒中，4 °C冰箱中孵育过夜。
    5. 取出切片，用PBS洗涤3次，每次5分钟，滴加二抗（1:3,000），37 °C孵育60分钟，再用PBS洗涤3次，每次5分钟。
    6. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液显色10分钟，用蒸馏水洗去显色液，室温下加入100 µL苏木精孵育5分钟，再用蒸馏水冲洗5分钟。
    7. 按步骤3.2.3所述进行脱水、透明和封片处理，并使用光学显微镜采集图像。
  5. 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测分析
    1. 取约100 mg冷冻肾组织置于10 mL匀浆管中，用研杵充分研磨至无明显组织块，然后加入1 mL RNA提取试剂进行匀浆。
    2. 加入250 µL氯仿，涡旋振荡10秒，冰上孵育5分钟，4 °C下以15,984 × g 离心10分钟，吸取上层水相转移至新管中。
    3. 向水相中加入500 µL异丙醇，涡旋振荡10秒充分混匀，冰上孵育5分钟。随后以15,984 × g 离心10分钟。小心弃去上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。短暂涡旋后再次以15,984 × g 离心10分钟。弃去乙醇，将RNA沉淀在室温下晾干。
    4. 加入30 µL焦碳酸二乙酯水溶解RNA，使用分光光度计测定RNA溶液在260 nm和280 nm处的吸光度，计算RNA浓度。
      注：RNA纯度通过A260/A280比值评估。理想A260/A280比值应在1.8至2.0之间，表明RNA纯度良好。若比值低于1.8，可能提示存在蛋白质或苯酚污染，需进一步纯化，例如进行额外的苯酚-氯仿抽提或乙醇沉淀以去除杂质。
    5. 将3 µg总RNA、4 µL 4 gDNA去除液和无RN酶的ddH2O混合至终体积16 µL，以1,250 × g 离心10秒，42 °C孵育2分钟。向上述16 µL溶液中加入4 µL 5×逆转录酶，以1,250 × g 离心10秒。进行逆转录程序：50 °C（15分钟）→ 85 °C（5秒）→ 4 °C（10分钟）。将合成的cDNA保存于–20 °C。
    6. 从冰箱中取出cDNA溶液，进行预变性（90 °C，10分钟），随后进行40个循环（94 °C，30秒 → 60 °C，30秒 → 72 °C，24秒），最后进行熔解曲线分析（95 °C，15秒 → 60 °C，60秒 → 95 °C，350秒，60 °C至95 °C以0.1 °C/s速率逐步升温）。
    7. 以Gapdh为内参基因，采用2-ΔΔCt法根据各样本Ct值计算WT-1、CD2AP、PI3K、AKT、NF-κB和IL-1β的相对表达量（ΔΔCt = 目标基因Ct值 – 内参基因Ct值）（见表2）。
  6. 蛋白质印迹（WB）检测分析
    1. 取约100 mg冷冻肾组织置于10 mL匀浆管中，加入500 µL裂解液（蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂:RIPA = 1:1:100），用研杵充分研磨至无明显组织块。
    2. 将匀浆管置于冰上孵育30分钟，以15,984 × g 离心10分钟，吸取上清液。
    3. 使用BCA法测定各样本蛋白浓度。根据测定结果，从各组中取等量总蛋白（如30 µg）加入新管中，并用PBS调整终体积以保持一致。随后加入5×蛋白上样缓冲液，100 °C煮沸10分钟，取出后冷却至室温。
    4. 使用12.5% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。首先以80 V电压使样品缓慢通过浓缩胶，然后调至120 V，直至样品运行至分离胶底部，关闭电源。
    5. 将滤纸浸泡于转膜缓冲液中，用镊子夹住PVDF膜一角并浸入甲醇中活化。取出凝胶，用塑料板切去浓缩胶及分离胶底部，按滤纸/凝胶/PVDF膜/滤纸的“三明治”结构组装转膜装置（凝胶为负极，PVDF膜为正极），将装置放入盛有预冷转膜缓冲液的转膜槽中，周围放置冰块以维持低温，以200 mA恒定电流进行转膜。
      注：根据蛋白分子量决定转膜时间（分子量越大，转膜时间越长）。
    6. 将PVDF膜置于封闭液中，室温摇床封闭90分钟，用TBST（每升TBST含50 mL 20× TBS和0.5 mL Tween-20）洗涤3次，每次5分钟。
    7. 使用一抗稀释液稀释一抗：WT-1（1:1,000）、CD2AP（1:1,000）、P-PI3K（1:1,000）、P-AKT（1:1,000）、P-NF-κB（1:1,000）、IL-1β（1:1,000），将一抗加至PVDF膜上，置于湿盒中，4 °C冰箱中孵育过夜（见材料表）。
    8. 从4 °C冰箱中取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，每次5分钟，使用二抗稀释液稀释二抗（1:10,000），加入二抗后室温孵育60分钟，再用TBST洗涤3次，每次5分钟，将PVDF膜放入化学发光成像仪中，均匀滴加ECL发光液（A:B = 1:1）。

4. YHT 治疗 DKD 的网络药理学分析

  1. 筛选YHT的活性成分及靶点
    1. 使用TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）确定Radix Rehmanniae Praeparata、Morindae Officinalis Radix、Poria和Schisandra Chinensis的活性成分，使用BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）确定 Maitake的活性成分。以 口服生物利用度（OB）≥ 30%和类药性（DL）≥ 0.18为筛选标准，识别活性成分。
    2. 通过TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索上述中药活性成分的作用靶点。
    3. 去除上述活性成分靶点的重复项，并整合成列表以供进一步分析。使用Uniprot蛋白数据库（https://www.uniprot.org）对靶点名称进行标准化。
  2. 构建YHT活性成分的靶点网络
    1. 将活性成分及其对应靶点导入软件：选择File | Import | Network，加载相关数据，构建"活性成分-靶点"网络。
    2. 通过导航至Tools | Network Analysis | Analyze Network进行网络拓扑分析，以可视化药物、活性成分、靶点与疾病之间的关系。在网络可视化中，节点代表活性成分，边代表活性成分与靶点之间的相互作用。
  3. 筛选糖尿病肾病（DKD）相关靶点
    1. 以Diabetic Kidney Disease为检索词，设置物种为Human，从以下数据库中筛选DKD相关靶点：GeneCards数据库（https://www.genecards.org）；OMIM数据库（http://www.omim.org）；TTD数据库（https://www.ttd.cn）；DrugBank数据库（http://www.drugbank.ca）；DisGeNET数据库（http://www.disgenet.org）。
    2. 从五个数据库获得结果后，将其合并至电子表格中，并使用Data菜单下的Remove Duplicates功能去除重复项，确保仅保留DKD相关靶点的唯一名称。
  4. 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心靶点
    1. 使用电子表格软件，将YHT靶点列表输入一列，DKD靶点列表输入另一列，通过条件格式高亮显示两列中的共同条目，从而识别YHT与DKD的交集靶点。
    2. 打开String数据库网站（https://cn.string-db.org/），选择 Input | Paste/Upload批量导入数据，并设置阈值Degree ≥ 1，以过滤网络中无相互作用的游离靶点。
    3. 选择File | Import | Network，将筛选后的交集靶点导入软件，生成最终可视化结果。
    4. 进入Network Analysis | Analyze Network，根据Degree值筛选YHT-DKD的核心靶点。
  5. 基因本体（GO）功能分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
    1. 访问http://metascape.org/gp/index.html打开Metascape平台，选择 Start Analysis开始分析，在Custom Analysis部分的输入框中粘贴YHT与DKD的靶点列表，从下拉菜单中设置物种为Homo sapiens，选择Custom Analysis，设置P值阈值为<0.01，点击Submit运行分析。
    2. Metascape返回结果后，前往http://www.bioinformatics.com.cn/，选择 Tools | enrichment GO term，粘贴结果中的GO术语，点击Submit生成气泡图。根据P值对前10个GO术语进行排序并可视化。
    3. 根据Metascape分析结果中的P值对KEGG通路进行排序。前往相同的微生物学网站（http://www.bioinformatics.com.cn/），选择 go kegg pathway enrichment，粘贴筛选出的前10个KEGG通路，点击Submit生成KEGG气泡图。

5. 统计分析

  1. 若数据符合正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；若方差不齐，采用Dunnett's T3检验或独立样本t-检验。
  2. 对于不符合正态分布的数据，采用非参数方法中的秩和检验。
  3. 认为P < 0.05具有统计学显著性。

结果

YHT 对糖尿病肾病小鼠的血糖、肝肾功能及脂质代谢紊乱的改善作用
经过 8 周给药后，不同剂量的 YHT 显著降低了随机血糖、24 小时尿总蛋白（UTP）、血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，改善了肾功能(图 1A-D）；提高了白蛋白（ALB）水平；降低了丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，增强了肝功能（图 1E-G）；降低了总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，改善了脂质代谢调节能力（图 1H,I）。上述结果表明，YHT 对血糖控制、肝肾功能及脂质代谢具有保护作用。

YHT对DKD小鼠肾脏组织病理学损伤的改善作用
为验证YHT是否能够改善DKD小鼠的肾脏损伤，采用H&E、PAS和Masson染色以及免疫组化（IHC）检测肾组织中病理损伤的程度。H&E和PAS染色显示，与对照组（CON组）相比，模型组（MOD组）小鼠出现肾小球萎缩、肾小球基底膜区域增宽、肾小管上皮细胞肿胀与脱落、间质炎性细胞浸润以及明显的肾小球糖原沉积（图2A、B）。Masson染色显示，MOD组小鼠肾脏中蓝色胶原纤维面积显著增加，提示纤维化程度加重（图2C、D）。免疫组化结果显示，MOD组中I型胶原（COI-I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性区域的比例显著高于CON组（图2E–G）。相比之下，在使用YHT和POS治疗后，肾小球萎缩、基底膜区域增宽、肾小管上皮细胞肿胀与脱落、间质炎性细胞浸润程度以及肾小球糖原沉积均显著减轻；蓝色胶原纤维面积显著减少；COI-I和α-SMA阳性区域的比例也显著降低。上述结果表明，YHT可有效缓解DKD小鼠的肾脏病理损伤及肾纤维化。

YHT 对 DKD 小鼠足细胞损伤的缓解作用
通过免疫组化（IHC）、PCR 和 Western blot（WB）检测 DKD 小鼠足细胞的损伤情况。IHC 结果显示，与对照组（CON 组）相比，模型组（MOD 组）小鼠足细胞功能标志蛋白 CD2AP 和 WT-1 的表达水平显著降低，表明肾足细胞受到损伤。YHT 治疗可提高 CD2AP 和 WT-1 的表达水平，减轻足细胞损伤（图 3A-C）。PCR 和 WB 结果显示，与 CON 组相比，MOD 组足细胞功能标志蛋白 CD2AP 和 WT-1 的 mRNA 及蛋白相对表达水平均显著下降；而经 YHT 治疗后，CD2AP 和 WT-1 的 mRNA 及蛋白相对表达水平均显著升高（图 3D-H）。上述结果表明，YHT 可缓解 DKD 小鼠的足细胞损伤。

基于网络药理学解析 YHT 对 DKD 作用的潜在靶点及信号通路
通过 TCMSP 和 BATMAN-TCM 数据库筛选 YHT 的活性成分（共 291 个），其中 39 个活性成分满足口服生物利用度（OB）≥ 30% 且药物相似性（DL）≥ 0.18 的标准。在数据库中检索这些活性成分对应的作用靶点，经合并并剔除重复值后，共获得 303 个靶点（图 4A）。整合 GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 和 DisGeNET 五个数据库的结果，并去除重复项后，最终获得 1,867 个与 DKD 相关的靶点。随后，利用 http://www.bioinformatics.com.cn/ 将筛选得到的 YHT 活性成分靶点与 DKD 相关靶点取交集，获得 84 个共同靶点（图 4B）。将这 84 个靶点导入 Cytoscape 软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，识别出 YHT 治疗 DKD 的潜在关键靶点，包括 AKT、IL-1β、CASP3、APOE 和 JUN（图 4C）。GO 功能富集分析共获得 1,246 个条目，提示 YHT 可能通过调控激素反应等生物过程、蛋白质同源二聚化活性和氧化还原酶活性等分子功能，以及膜筏和膜微区等细胞组分，发挥对 DKD 的治疗作用（图 4D）。KEGG 通路富集分析共获得 263 条结果，主要涉及糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路、酒精性肝病、脂质与动脉粥样硬化通路等。根据 P 值选取前 10 位结果绘制 KEGG 可视化气泡图（图 4E）。AGE-RAGE 信号通路在糖尿病相关疾病中高度富集，且 PPI 网络中的多个核心靶点（如 PI3K、AKT 和 IL-1β）均在此通路中富集，因此选择该信号通路进行后续验证。

通过抑制 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路减轻足细胞损伤
采用 PCR 和 WB 进一步检测 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路相关基因和蛋白的表达水平。PCR 结果显示，与 CON 组相比，MOD 组中 Pi3k、Akt、Nf-κb 和 Il-1β 的相对 mRNA 表达水平显著升高，而给予 YHT 后上述基因的表达显著降低（图 5A-D）。WB 结果显示，与 CON 组相比，MOD 组中 P-PI3K、P-AKT、P-NF-κB 和 IL-1β 的相对蛋白水平也显著升高，而在给予 YHT 后显著降低（图 5E-I）。这些结果进一步表明，YHT 可通过抑制 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路减轻糖尿病肾病小鼠的足细胞损伤。

空腹血糖、白蛋白、肌酐、尿素氮、血清分析的柱状图；比较研究结果。
图 1：YHT 对糖尿病肾病（DKD）小鼠血糖、肝肾功能及脂质代谢紊乱的改善作用。YHT 对（A）随机血糖；（B-D）肾功能指标（包括 24 小时尿蛋白、血肌酐和尿素氮）；（E-G）肝功能指标（包括血清白蛋白、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶）；以及（H,I）脂质代谢调节（包括总胆固醇和甘油三酯）的影响。数据以六次独立样本的均值 ± 标准差表示，与空白组比较，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；与模型组比较，#p < 0.05，##p < 0.01，###p < 0.001；所有图中均统一使用上述统计标注。缩写：YHT = 阴火汤；DKD = 糖尿病肾病；ALB = 白蛋白；ALT = 丙氨酸氨基转移酶；AST = 天冬氨酸氨基转移酶；TC = 总胆固醇；TG = 甘油三酯；CON = 对照组；MOD = 模型组；POS = 缬沙坦阳性对照组；YH-L = YHT 低剂量组；YH-M = YHT 中剂量组；YH-H = YHT 高剂量组。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学分析；H&E、PAS、Masson染色；纤维化研究；柱状图，COL1、α-SMA表达。
图2：糖尿病肾病小鼠肾脏组织病理损伤的改善。（A,B）H&E染色和PAS染色观察肾脏组织学（比例尺 = 20 µm）；（C）Masson染色观察肾纤维化程度；（D）使用ImageJ软件进行半定量分析；（E-G）采用免疫组化（IHC）结合ImageJ软件对肾组织中I型胶原（COI-I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）相对表达水平进行半定量分析（比例尺 = 20 µm）。缩写：YHT = 淫火汤；DKD = 糖尿病肾病；H&E = 苏木精-伊红染色；PAS = 过碘酸雪夫染色；COI-I = I型胶原；α-SMA = α-平滑肌肌动蛋白；CON = 对照组；MOD = 模型组；POS = 缬沙坦阳性对照组；YH-L = YHT低剂量组；YH-M = YHT中剂量组；YH-H = YHT高剂量组。请点击此处查看本图的放大版本。

CD2AP 和 WT-1 表达分析；免疫组织化学、柱状图及蛋白质印迹结果。
图 3：糖尿病肾病小鼠中足细胞损伤的减轻。（A-C）免疫组织化学检测肾组织中 CD2AP 和 WT-1 的相对表达水平（比例尺 = 20 µm）；（D,E）PCR 检测肾组织中 CD2AP 和 WT-1 的相对 mRNA 表达水平，并使用 Image J 软件进行半定量分析；（F-H）蛋白质印迹检测肾组织中 CD2AP 和 WT-1 的相对蛋白表达水平，并使用 ImageJ 软件进行半定量分析。缩写：YHT = 淫火汤；DKD = 糖尿病肾病；IHC = 免疫组织化学；WB = 蛋白质印迹；CD2AP = CD2 相关蛋白；WT-1 = 肾母细胞瘤 1；CON = 对照组；MOD = 模型组；POS = 缬沙坦阳性对照组；YH-L = YHT 低剂量组；YH-M = YHT 中剂量组；YH-H = YHT 高剂量组。请点击此处查看该图的放大版本。

生物网络分析图；维恩图 B：DKD/YHT 重叠部分，D：富集评分。
图 4：YHT 治疗 DKD 的网络药理学分析。（A）YHT 治疗 DKD 的活性成分-疾病靶点图。（B）YHT 与 DKD 靶点的维恩图。橙色表示 DKD 相关靶点数量；绿色表示 YHT 活性成分的治疗靶点数量；交集部分表示共同靶点数量（即 YHT 治疗 DKD 的靶点数量）。（C）YHT 与 DKD 共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。（D）YHT 治疗 DKD 的 10 个最重要靶点的 GO 富集分析。（E）YHT 治疗 DKD 的 10 个最重要靶点的 KEGG 富集分析。缩写：YHT = yinhuo Tang；DKD = diabetic kidney disease；PPI = Protein-Protein Interaction；GO = Gene Ontology；KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；CON = 对照组；MOD = 模型组；POS = 缬沙坦阳性对照组；YH-L = YHT 低剂量组；YH-M = YHT 中剂量组；YH-H = YHT 高剂量组。请点击此处查看该图的放大版本。

显示足细胞损伤中蛋白表达分析及细胞信号通路的Western blot与柱状图
图5：通过抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路减轻足细胞损伤。（A-D）PCR检测肾组织中Pi3k、Akt、Nf-κb和Il-1β的相对mRNA表达水平。（E-I）WB检测肾组织中P-PI3K、P-AKT、P-NF-κB和IL-1β的相对蛋白表达水平，并使用ImageJ软件进行半定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：阴火汤的组成。 请点击此处下载该表格。

表2：qRT-PCR 引物详情。 请点击此处下载该表格。

讨论

本方案中的一个关键步骤是利用网络药理学鉴定YHT的活性成分，并预测其与糖尿病肾病（DKD）相关靶点的相互作用。该步骤涉及使用生物信息学工具（如TCMSP、DrugBank和GeneCards等数据库）分析大规模生物学数据，以绘制YHT影响的分子通路和潜在的生物网络。随后通过DKD动物模型进行实验验证，检验YHT对这些通路的假设效应。将计算预测结果与实验数据相结合是我们方法中的关键环节，有助于提高研究结果的可靠性，并弥合理论预测与实际效果之间的差距。此外，使用动物模型是验证YHT治疗作用的另一个关键步骤。动物模型中的DKD在疾病进展上高度模拟人类疾病，可有效评估YHT对肾小球损伤和肾纤维化的影响。同时，严密监测血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）和蛋白尿等肾功能指标，并结合组织病理学评估，对于全面评价YHT的治疗效果至关重要。

尽管我们的实验方案结合了强大的计算与实验方法，但仍存在若干局限性。首先，网络药理学方法高度依赖公共数据库中的现有数据，而关于益肾化浊汤（YHT）或糖尿病肾病（DKD）相关通路的某些组分可能存在数据偏差或信息缺失。尽管我们通过交叉比对多个数据库以减轻这一问题，但仍可能遗漏部分相关相互作用。其次，本研究仅在实验动物层面探讨了YHT减轻足细胞损伤的作用机制，尚需细胞实验及临床大样本研究进一步验证实验结果。最后，网络药理学分析显示，YHT治疗DKD还可能与酒精性肝病、脂质代谢及动脉粥样硬化，以及脂肪细胞中脂解作用的调控相关。本研究仅验证了YHT通过调控PI3K/AKT/NF-κB信号通路是否可延缓DKD进展；相关结果仍需进一步深入探索。

PI3K/AKT/NF-κB 信号通路是一条重要的细胞内信号通路，参与调控多种生物学过程，如细胞生长、增殖、存活以及炎症反应22。研究表明，该通路在足细胞损伤的进展中发挥重要作用23,24。NF-κB 是 PI3K/Akt 通路的重要下游组分，参与多种细胞内信号的传递及多个基因的表达。PI3K/AKT 信号通路的激活可导致 NF-κB 抑制蛋白 IκB 的降解，进而引起 NF-κB 的磷酸化及其进入细胞核，促进多种趋化因子和炎症因子的产生，最终导致足细胞损伤和肾间质纤维化25。一些研究显示，抑制 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路的激活可有效抑制炎症反应和肾纤维化，从而延缓糖尿病肾病（DKD）的进展26。

研究表明，脂质代谢紊乱在糖尿病肾病（DKD）的发生和发展中起着重要作用27,28。DKD患者常表现出脂质代谢异常，包括低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯（TG）水平升高以及脂肪酸积聚。这些异常与肾小球硬化和肾小管间质纤维化等病理改变密切相关29,30。研究指出，脂质代谢紊乱可通过多种信号通路促进DKD的进展31,32。首先，mTOR信号通路是调控脂质代谢的关键通路，其过度激活可导致足细胞损伤和蛋白尿33,34。高脂环境可通过PI3K/AKT/mTOR轴促进脂质积聚，诱导足细胞凋亡，最终加重肾功能恶化35,36,37。其次，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞能量代谢的重要调节因子，可通过促进脂肪酸氧化、抑制脂质合成和减轻脂毒性来保护肾脏免受代谢紊乱的损害38,39,40。AMPK失活被认为是DKD进展的重要机制之一。AMPK激活剂（如二甲双胍）已显示出显著的肾脏保护作用，是DKD潜在的治疗靶点41。

最后，研究已表明过氧化物酶体增殖物激活受体α/γ（PPARα/γ）在调控脂质代谢和糖尿病肾病（DKD）中发挥关键作用42,43。PPARα的激活可促进脂肪酸氧化，减少肾脏中的脂质积聚，而PPARγ则可改善胰岛素敏感性并发挥抗炎作用44,45。PPAR激动剂（如贝特类药物）在降低DKD患者蛋白尿方面已显示出潜在的临床益处46。综上所述，脂质代谢紊乱通过多条信号通路影响DKD的病理进展，这些通路之间的相互作用构成了复杂的病理网络。靶向脂质代谢可能为DKD提供新的治疗策略。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase，CASP）家族是一类广泛存在于细胞中的特异性半胱氨酸蛋白酶，主要参与细胞凋亡和炎症反应的调控47,48。CASP家族成员具有结构相似性，通常以酶原形式存在，通过级联反应被激活，从而触发细胞凋亡、焦亡及其他程序性细胞死亡过程49。其中，CASP3是CASP家族中具有保守结构的成员，通常以酶原形式存在，是细胞凋亡执行阶段的关键蛋白酶，可催化特定细胞蛋白的裂解，从而在调控正常细胞生长和维持内环境稳态中发挥重要作用50,51。Caspase-8作为凋亡级联反应的起始因子，可通过激活NPK（调控细胞生长的关键因子）参与炎症反应的调节。此外，caspase-8还可通过激活NLRP1和NLRP3等炎症小体，参与炎症反应的调控，进而引发细胞焦亡52。鉴于CASP信号通路在调控有蒂细胞凋亡和焦亡过程中的重要作用，未来有必要进一步深入探讨YHT、CASP3/8、有蒂细胞与DKD之间的关系。

与传统药物发现方法通常强调明确的单一靶点机制以满足监管清晰性和可预测性不同，我们基于网络药理学的策略能够系统地探索中药复方如益火通（YHT）所固有的多靶点相互作用。尽管这种复杂性反映了中医药的整体特性及其潜在的广泛治疗作用，但也凸显了意外脱靶效应所带来的挑战，这些效应需要经过严谨的验证与解读。通过综合考虑YHT多靶点、多通路的作用特征，我们对其治疗糖尿病肾病（DKD）的治疗效应提供了更为整体性的理解。此外，网络药理学能够预测潜在的药物相互作用和不良反应，这对于确保多组分疗法的安全性和有效性至关重要。目前DKD的治疗主要集中在症状控制或延缓疾病进展，而非针对其根本的疾病机制。本研究通过整合现代生物信息学工具与实验验证，强调了系统生物学在提升中医药疗效方面的重要作用，尤其是在DKD等慢性疾病治疗中。

展望未来，该技术在扩展中医药网络药理学研究范围方面具有重要意义，尤其适用于糖尿病肾病（DKD）等复杂疾病的治疗研究。本方法可用于探索其他中药方剂或单味中药在治疗肾脏疾病、心血管疾病及代谢性疾病方面的治疗潜力。此外，该方法还可用于药物再定位研究，通过识别现有药物在DKD治疗中的新用途，拓展其临床应用。本方法的另一潜在应用方向是个性化医疗。通过整合患者特异性数据，可利用网络药理学根据个体的分子特征定制中医药治疗方案，从而提高治疗效果并减少不良反应。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由吉林省自然科学基金（编号：20210101201JC）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇中国医药集团化学试剂有限公司10009218
动物实验中心长春中医药大学SYXK (吉) 2023-0014
BATMAN-TCM 数据库http://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
BCA 蛋白检测试剂盒SolarbioPC0020
封闭缓冲液BeyotimeP0023B
陶瓷锅美的MD-DG30E103
化学发光成像系统杭州申华科技有限公司SH-523
氯仿中国医药集团化学试剂有限公司10006818
Cytoscape 3.8.0 软件----
DAB 试剂盒ServicebioG1212-200T
db/db 小鼠南京金开生物技术有限公司SCXK (苏) 2020-009
ECL 底物溶液affinityKF8003
电热恒温水浴锅菲莎夫仪器（河北）有限公司DK-20000-IIIL
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玻璃匀浆器SolarbioYA0852
载玻片南通美维德生命科学有限公司PC2-301
山羊抗兔 IgG HRP（二抗）AffinityS0001免疫组化 1:3000，Western blot 1:10000
苏木精武汉凌澌生物科技有限公司G1140
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HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA 擦除剂)VAZYMER223-01
水平摇床江苏海门麒麟贝尔仪器制造有限公司TS-1
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异丙醇中国医药集团化学试剂有限公司80109218
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Masson 染色试剂盒BASOBA4079B
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甲醇Thermo67-56-1
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烘箱上海惠泰仪器制造有限公司DHG-9140A
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蛋白磷酸酶抑制剂复合物迈伦生物MB12707-1
PVDF 膜（0.22 μm）SolarbioISEQ00010
快速一抗/二抗稀释液SolarbioA1811
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二抗稀释缓冲液BeyotimeP0023D
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TrizolAmbion15596-026
Tween 20中国医药集团化学试剂有限公司30189328
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Western 封闭缓冲液SolarbioSW3010
二甲苯中国医药集团化学试剂有限公司10023418
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