利用计算机视觉库简化细胞核定量分析

摘要

本文详细描述了使用一款开源可执行程序对基于图像的细胞核进行自动化定量分析的逐步方法，该程序已在多种细胞密度范围内得到验证。该程序提供了一种替代方案，可克服现有技术在成本、对技术能力有限的用户而言的可及性，以及特定应用验证方面的局限性，从而提升其实用性。

摘要

活细胞检测和基于图像的细胞分析需要进行数据归一化，以实现准确解读。一种常用的方法是对细胞核进行染色并定量，随后将数据归一化为细胞核数量。对于单核细胞，该细胞核计数通常被表示为细胞数量。尽管手动定量可能费力且耗时，但现有的自动化方法可能并非所有用户都愿意使用，可能缺乏针对此特定应用的验证，或成本过高。本文提供了详细的分步操作指南，用于获取经荧光DNA染料染色的细胞核的可定量图像，并利用基于Python计算机视觉库开发的自动化目标计数软件程序对细胞核进行定量分析。我们还在不同细胞密度范围内对该程序进行了验证。虽然程序运行的确切时间取决于图像数量和计算机硬件，但该程序可将原本需要数小时的人工计数工作缩短至数秒内完成。尽管本实验方案是基于固定后染色细胞的图像开发的，但该程序同样适用于活细胞中染色细胞核以及免疫荧光 应用的图像定量。最终，该程序提供了一种无需高技术水平即可使用的、经过验证的开源替代方案，有助于细胞与分子生物学家优化工作流程，实现繁琐且耗时的细胞核定量任务的自动化。

引言

功能实验和成像实验对于理解实验处理对全细胞生物化学和生理学的影响至关重要。对细胞生物学实验数据进行有效解读，依赖于实验方案的准确性和可重复性，包括数据的标准化处理。例如，在基础状态下以及使用特定药物处理后，检测活细胞的耗氧量和细胞外酸化率，可用于评估能量代谢的多个方面^1,2。测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶等酶的活性，有助于量化细胞膜的完整性³。在固定前使用膜联蛋白V和碘化丙啶对培养细胞进行染色，可评估凋亡和坏死细胞的比例⁴。然而，不同孔之间细胞密度的差异会影响上述每项检测的结果。仅依赖接种密度可能导致结果误导，原因包括接种时细胞计数误差、铺板过程中细胞在培养基中密度不均，或样品及处理组在实验过程中细胞生长速率不同。因此，必须对实验结果进行标准化处理。

目前用于功能性和基于图像的细胞数据归一化的方法包括蛋白质浓度⁵或细胞核/细胞计数⁶。为了将数据归一化至蛋白质浓度，需在实验完成后，将细胞以等体积的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液提取，并额外进行一次蛋白定量实验（例如二辛可宁酸法、Bradford法等）。该方法的准确性依赖于细胞的完全提取；任何残留的蛋白质都会导致定量误差。细胞核或....

方案

注意：补充文件可在以下链接找到 https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 使用荧光显微镜捕获和保存图像

1. 准备待成像的细胞或组织样本，包括使用所需的DNA染料进行染色。为获得本实验所用图像，C2C12成肌细胞（CRL-1772，美国模式培养物集存库）在标准培养条件（5% CO₂、37 °C、湿润环境）下于6孔板中培养48–72小时，部分样本添加50 mM EtOH⁶，随后按先前描述的方法用预冷甲醇固定¹³。固定后的细胞使用含DAPI的封片剂进行封片¹⁵，避光干燥后进行成像。
2. 根据既定的标准操作程序开启荧光显微镜及计算机的所有组件，并打开显微镜配套软件。
3. 将显微镜设置为通过目镜观察样本。检查物镜，必要时旋转物镜转换器至所需物镜。确保软件中选择的物镜与实际使用的一致，以准确显示成像区域。本实验使用10倍物镜采集图像。
4. 关闭光源后，将样本（载玻片、培养板或培养皿）放置于载物台上。开启实时成像，选择合适的滤光片并设置曝光时间（可采用预设时长或自动曝光模式）。本实验使用DAPI滤光片，曝光时间为61–62 ms。有关设置曝光时间的指导，特别是....

结果

每批图像运行将生成：1）一组已应用轮廓的图像文件，显示所识别出的细胞核的轮廓（图5）；以及 2）一个 .csv 文件（电子表格），用于关联图像文件名及其对应的计数结果。通过查看这些轮廓，用户可对计数质量进行视觉评估。具体而言，按照第1节 所述方法获得的图像中，所有（或几乎全部）细胞核应被实心绿色线条包围，表明该细胞核已被程序计入。此处正是利用这些轮廓对程序进行了优化调整。

图5：原始图像及对应轮廓示例。（A-C）分析前的原始图像示例，（D-F）为其正下方对应的分.......

讨论

我们的细胞核定量程序相较于现有选项具有多项优势：仅需基本的技术技能，针对细胞核定量这一特定任务经过验证，且为开源程序；其中开源特性克服了与成本相关的障碍。最终，该程序为细胞与分子生物学家提供了一种额外的选择，可快速、准确地对荧光显微镜拍摄的图像中的细胞核进行定量分析。目前可用的自动化细胞核或细胞计数程序并非所有用户都青睐，部分程序价格昂贵，且在特定应用中的验证可能不足或缺失。专用设备（如 BioTek Cytation 系列）虽附有技术公告，验证了利用细胞核染色进行原位细胞计数²⁰，并支持多种其他应用。尽管已有验证数据，且 Cytation 产品线被广泛使用——尤其是在与 Seahorse 细胞外通量分析仪联用时，可便捷高效地归一化活细胞数据——但对于设备经费有限的实验室而言，该产品可能因成本过高而难以承受。例如，在2024日历年度，配备四个物镜和四个荧光滤光片组的基础型号的标价已超过10万美元。对于无力购买专用设备的研究者，开源软件为图像分析提供了免费的替代方案。适用于细胞核和细胞定量的开源软件包括 ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国；可访问

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可访问方法2或方法3结果文件的计算机	-	-	参见步骤2.6（方法2）或步骤3.3.9或3.4.9（方法3）
具备互联网连接和现代浏览器的计算机	-	-	例如，Google Chrome
具备互联网连接、现代浏览器和Windows操作系统的计算机	视情况而定	视情况而定	对于Mac、Linux或其他操作系统，请使用方法3
配备图像采集软件的计算机	Zeiss	AxioVision	其他软件也可接受；必须与荧光显微镜兼容
输出文件存储位置（结果电子表格和图像轮廓）	-	-	可以是一个新建的空文件夹
荧光显微镜	Zeiss	Axiovert 200M	其他荧光显微镜也可接受；必须配备合适的滤光片组、所需物镜和相机
包含所有待量化图像的文件夹	-	-	参见步骤1.12
Python 3.10或更高版本	Python	-	可在 https://www.python.org/downloads/ 免费下载和安装
待成像样品	-	-	固定或活体样品，使用荧光DNA染料染色或复染
电子表格软件	Microsoft	Excel	类似的电子表格软件也可接受