使用计算机视觉库简化细胞核定量

Summary

本文介绍了使用开源可执行程序自动进行基于图像的细胞核定量的分步方法，该程序在一系列细胞密度中进行了验证。该计划提供了一种替代方案，可以解决与成本相关的障碍、技术技能有限的用户的可访问性以及可能限制现有技术效用的特定应用程序验证。

Abstract

活细胞检测和基于图像的细胞分析需要数据归一化才能准确解释。一种常用的方法是对细胞核进行染色和定量，然后将数据归一化为细胞核计数。该细胞核计数通常表示为单核细胞的细胞计数。虽然手动定量可能费力且耗时，但可用的自动化方法可能并非所有用户都喜欢，可能缺乏针对此特定应用的验证，或者可能成本高昂。在这里，我们提供了捕获用荧光 DNA 染料染色的细胞核的可量化图像的分步说明，然后使用使用 Python 计算机视觉库开发的自动对象计数软件程序对细胞核进行定量。我们还在一系列细胞密度中验证了该程序。尽管程序执行的确切时间因图像数量和计算机硬件而异，但该程序将数小时的细胞核计数工作合并为几秒钟，以便程序运行。虽然该方案是使用固定的染色细胞的图像开发的，但也可以使用该方案对活细胞和免疫荧光应用中染色细胞核的图像进行量化。最终，该程序提供了一个不需要高度技术技能的选项，并且是一种经过验证的开源替代方案，可帮助细胞和分子生物学家简化他们的工作流程，自动化繁琐且耗时的细胞核定量任务。

Introduction

功能和基于图像的实验对于了解实验性治疗对全细胞生物化学和生理学的影响至关重要。对细胞生物学实验数据的有效解释取决于实验方案的准确性和可重复性，包括数据归一化。例如，在基线和用特定药物治疗后分析活细胞的耗氧量和细胞外酸化率可以评估能量代谢的各个方面 ^1,2。测量细胞培养物上清液中乳酸脱氢酶等酶的活性有助于量化细胞膜完整性³。固定前用膜联蛋白 V 和碘化丙啶对培养的细胞进行染色，可以评估凋亡细胞和坏死细胞⁴。然而，孔间细胞密度的差异会影响这些检测的结果。由于接种细胞计数错误、接种时培养基中细胞密度的变化或整个实验过程中样品或处理之间的细胞生长速率不同，仅依赖接种密度可能会提供误导性结果。因此，需要对实验结果进行标准化。

目前功能和基于图像的细胞数据的归一化方法包括蛋白质浓度⁵ （protein concentration） 或细胞核或细胞计数⁶ （nuclei or cell count）。为了将数据标准化为蛋白质浓度，在检测运行后，必须在等体积的裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂中提取细胞，并且必须进行额外的检测（例....

Protocol

注意：补充文件可在以下链接中找到 https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 使用荧光显微镜捕获和保存图像

1. 准备要成像的细胞或组织样品，包括用所需的 DNA 染料染色。为了获得此处使用的图像，将 C2C12 成肌细胞（CRL-1772，美国典型培养物收藏中心）在标准培养条件（5% CO 2,37°C，加湿）下在 6 孔板中生长 48-72 小时，有或没有 50 mM EtOH⁶，并如前所述固定在冰冷的甲醇中¹³。使用含有 DAPI 的封固剂¹⁵ 封固固定细胞，并在成像前避光干燥。
2. 根据既定的标准作程序打开荧光显微镜和计算机的所有组件。打开与显微镜关联的软件。
3. 设置显微镜以通过目镜观察样品。检查目标。如果需要，将物镜转盘转到所需的物镜。确保软件程序选择了所需的物镜，以准确指示图像区域。在这里，图像是使用 10 倍物镜拍摄的。
4. 关灯，将样品（载玻片、板或培养皿）放在载物台上。使用适当的滤镜打开实时成像，并将曝光时间设置为预先确定的持续时间或自动曝光。这里使用 DAPI 滤波器和 61-62 毫秒的曝光时间。有关设置曝光时间的指导，尤其是....

Results

每次批量图像运行都会产生：1） 一组应用了轮廓的图像文件，显示已识别细胞核的轮廓（图 5），以及 2） 一个链接图像文件名和相关计数的.csv文件（电子表格）。查看等值线将允许用户直观地评估计数质量。具体来说，根据第 1 节获得的图像应具有所有（或几乎所有）细胞核被一条绿色实线包围，表明程序对细胞核进行了计数。这些等值线用于调整此处的程序。

图 5：原始图像和相应轮廓的示例。 （A-C）分析前的原始图像示例和分析后 （D-F） 相应的等值线示例。比例尺 （C） 表示 .......

Discussion

与现有选项相比，我们的细胞核定量程序具有几个优势：它只需要最少的技术技能，针对细胞核定量的特定任务进行了验证，并且是开源的;后者克服了与成本相关的障碍。最终，该程序为细胞和分子生物学家提供了另一种选择，可以快速准确地量化使用荧光显微镜捕获的图像中的细胞核。目前可用的自动细胞核或细胞计数程序并非所有用户都喜欢，有些程序成本高昂，并且对于特定应用可能很少或没有验证。BioTek Cytation 系列等专用设备随附技术公告，可验证使用细胞核染色²⁰ 进行原位细胞计数，以及各种其他应用。虽然存在验证数据并且 Cytation 产品线被广泛使用，尤其是与 Seahorse 细胞外通量分析仪连接以轻松有效地标准化活细胞数据时，该产品对于可用设备资金有限的实验室来说可能成本高昂。例如，在 2024 日历年，配备四个物镜和四个荧光显微镜滤光片立方体的基本型号的标价超过 100,000 美元。对于那些无法购买专用设备的用户，开源软件为图像分析提供了免费的替代方案。可用于细胞核和细胞定量的开源软件包括 ImageJ（美国国立卫生研究院，美国.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
可以访问方法 2 或 3 中的结果文件的计算机	-		请参阅步骤 2.6（对于方法 2）或步骤 3.3.9 或 3.4.9（对于方法 3）
可以访问互联网的计算机、现代浏览器	-	-	例如，可以
访问互联网的 Google Chrome 计算机、现代浏览器和 Windows作系统	不相同		对于 Mac、Linux 或其他作系统，请使用方法 3
带有图像捕获软件的计算机	蔡司	AxioVision	其他软件是可以接受的;必须与荧光显微镜兼容
输出的文件位置（结果电子表格和图像轮廓）	-	-	可以是一个新的空文件夹
荧光显微镜	蔡司	Axiovert 200M	其他荧光显微镜是可以接受的;必须配备适当的滤光片立方体、所需的物镜和相机
包含所有要量化的图像的文件夹	-	-	参见步骤 1.12
Python 3.10 或更高版本	Python	-	可在 https://www.python.org/downloads/  免费下载和安装;
要成像的样品	-	-	用荧光DNA染料固定或活染色，染色或复染
电子表格软件	Microsoft	Excel	的电子表格软件也可以接受