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方法文章

利用计算机视觉库简化细胞核定量分析

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DOI：

10.3791/67945

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2025年6月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

本文内容

摘要

本文详细描述了使用一款开源可执行程序对基于图像的细胞核进行自动化定量分析的逐步方法，该程序已在多种细胞密度范围内得到验证。该程序提供了一种替代方案，可克服现有技术在成本、对技术能力有限的用户而言的可及性，以及特定应用验证方面的局限性，从而提升其实用性。

摘要

活细胞检测和基于图像的细胞分析需要进行数据归一化，以实现准确解读。一种常用的方法是对细胞核进行染色并定量，随后将数据归一化为细胞核数量。对于单核细胞，该细胞核计数通常被表示为细胞数量。尽管手动定量可能费力且耗时，但现有的自动化方法可能并非所有用户都愿意使用，可能缺乏针对此特定应用的验证，或成本过高。本文提供了详细的分步操作指南，用于获取经荧光DNA染料染色的细胞核的可定量图像，并利用基于Python计算机视觉库开发的自动化目标计数软件程序对细胞核进行定量分析。我们还在不同细胞密度范围内对该程序进行了验证。虽然程序运行的确切时间取决于图像数量和计算机硬件，但该程序可将原本需要数小时的人工计数工作缩短至数秒内完成。尽管本实验方案是基于固定后染色细胞的图像开发的，但该程序同样适用于活细胞中染色细胞核以及免疫荧光 应用的图像定量。最终，该程序提供了一种无需高技术水平即可使用的、经过验证的开源替代方案，有助于细胞与分子生物学家优化工作流程，实现繁琐且耗时的细胞核定量任务的自动化。

引言

功能实验和成像实验对于理解实验处理对全细胞生物化学和生理学的影响至关重要。对细胞生物学实验数据进行有效解读，依赖于实验方案的准确性和可重复性，包括数据的标准化处理。例如，在基础状态下以及使用特定药物处理后，检测活细胞的耗氧量和细胞外酸化率，可用于评估能量代谢的多个方面1,2。测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶等酶的活性，有助于量化细胞膜的完整性3。在固定前使用膜联蛋白V和碘化丙啶对培养细胞进行染色，可评估凋亡和坏死细胞的比例4。然而，不同孔之间细胞密度的差异会影响上述每项检测的结果。仅依赖接种密度可能导致结果误导，原因包括接种时细胞计数误差、铺板过程中细胞在培养基中密度不均，或样品及处理组在实验过程中细胞生长速率不同。因此，必须对实验结果进行标准化处理。

目前用于功能性和基于图像的细胞数据归一化的方法包括蛋白质浓度5或细胞核/细胞计数6。为了将数据归一化至蛋白质浓度，需在实验完成后，将细胞以等体积的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液提取，并额外进行一次蛋白定量实验（例如二辛可宁酸法、Bradford法等）。该方法的准确性依赖于细胞的完全提取；任何残留的蛋白质都会导致定量误差。细胞核或细胞计数则提供了一种替代方案，无需将细胞从其生长表面移除。取而代之的是，对活细胞或固定细胞使用比色或荧光染料进行染色或复染，然后基于全细胞或仅细胞核的图像进行计数。在荧光显微镜应用中，以及对融合细胞（如肌管细胞）或组织的数据进行归一化时，优先选择对细胞核进行定量。在采用荧光方法对细胞核进行定量时，可将荧光DNA染料（例如4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）、Hoechst 33342、Hoechst 33358、DRAQ5等）应用于活细胞或固定细胞，并通过荧光显微镜成像。DAPI、Hoechst和DRAQ5优先结合DNA中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的区域7,8,9，从而实现细胞核的检测。优化染料浓度可避免脱靶结合（例如与线粒体DNA结合，导致细胞质中出现点状荧光）10。通过使用市售的含DAPI的封片剂（如含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂）以及文献报道的活细胞染料浓度（如Hoechst）6,11,12，可简化优化过程。染色后，使用适当的激发滤光片（例如紫外光[DAPI和Hoechst]或远红光[DRAQ5]）对活细胞或固定细胞中的细胞核进行可视化。DAPI、Hoechst和DRAQ5的激发最大值位于荧光显微镜光谱的两端。这一特性，加上这些染料对DNA的特异性以及在最佳浓度下的使用，可最大限度地减少脱靶荧光。所得图像显示在黑色背景上明亮的细胞核，这些细胞核可作为单核细胞细胞数量的衡量指标。尽管存在其他基于组织学染色和明场显微镜的准确染色定量方法13，但使用这些方法实现自动化较为困难，尽管仍有可能。

尽管手动核计数仍是金标准，但该方法费时费力，且在长时间计数过程中容易引入人为误差。虽然已有自动化细胞计数程序，但并非所有用户都倾向于使用，这些程序可能成本较高，且针对特定应用的验证可能不足。近年来，Python 已成为生物学家一种有价值且易于获取的资源。Python 的计算机视觉库在图像分析方面尤为有用14。本文提供了使用基于 Python 代码开发的可执行程序对经荧光染料染色并利用荧光显微镜成像的细胞核进行定量分析的分步操作指南。使用本程序无需编程技能。该工作流程专门适用于应用了荧光 DNA 染料的细胞或组织，不适用于明场图像。第 1 节介绍如何以与本工作流程兼容的方式采集并保存荧光显微镜获取的图像。第 2 节提供将核计数程序作为可执行文件运行并获取输出结果的操作说明。该可执行程序可直接通过提供的 .exe 文件运行，无需任何修改即可对高质量图像中的细胞核进行定量。该可执行程序需在基于 Windows 的计算机上运行。第 3 节介绍如何将程序作为 Python 脚本而非可执行文件运行（在基于 Mac 或 Linux 的系统中为必需，在基于 Windows 的系统中为可选），并允许根据需要调整代码。第 4 节描述如何利用结果进行归一化处理。随后提供了代表性结果，包括来自本实验室的验证数据。

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方案

注意：补充文件可在以下链接找到 https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 使用荧光显微镜捕获和保存图像

  1. 准备待成像的细胞或组织样本，包括使用所需的DNA染料进行染色。为获得本实验所用图像，C2C12成肌细胞（CRL-1772，美国模式培养物集存库）在标准培养条件（5% CO2、37 °C、湿润环境）下于6孔板中培养48–72小时，部分样本添加50 mM EtOH6，随后按先前描述的方法用预冷甲醇固定13。固定后的细胞使用含DAPI的封片剂进行封片15，避光干燥后进行成像。
  2. 根据既定的标准操作程序开启荧光显微镜及计算机的所有组件，并打开显微镜配套软件。
  3. 将显微镜设置为通过目镜观察样本。检查物镜，必要时旋转物镜转换器至所需物镜。确保软件中选择的物镜与实际使用的一致，以准确显示成像区域。本实验使用10倍物镜采集图像。
  4. 关闭光源后，将样本（载玻片、培养板或培养皿）放置于载物台上。开启实时成像，选择合适的滤光片并设置曝光时间（可采用预设时长或自动曝光模式）。本实验使用DAPI滤光片，曝光时间为61–62 ms。有关设置曝光时间的指导，特别是针对细胞密度较高的图像，请参见故障排除表。
  5. 通过目镜缓慢调节粗调焦旋钮，直至可见染色的细胞核，再使用微调焦旋钮缓慢调节焦距，使细胞核图像清晰锐利。
    注：合适的图像示例如图1所示。
    1. 若出现背景染色过强或细胞核信号过弱的情况，可手动调整曝光时间。单张图像中不同细胞核的信号强度可能存在可见差异；但所有细胞核均应呈现清晰的圆形轮廓，且信号干扰最小。
      注：下游应用所用程序对不同信号强度具有良好的鲁棒性。用于细胞核定量程序开发与验证的原始图像包含不同信号强度的图像，可通过开放科学框架（Open Science Framework）知识库获取（见上文链接）。

细胞密度比较；荧光显微镜图像显示用于分析的不同样本密度。
图1：DAPI染色细胞核的示例图像。 这些图像展示了在（A）低、（B）中等或（C）高细胞密度下细胞核的状态，背景信号极低。请注意图像C中细胞核信号强度的差异；这种差异并未影响定量分析。图像C中的比例尺表示100 µm；用于细胞核定量的图像应省略比例尺。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 通过目镜观察到细胞核清晰聚焦后，将检测模式切换至相机模式，使用微调旋钮进一步调节焦距。
  2. 根据需要调整曝光时间，并记录最终的曝光时间，以便后续样本和图像使用。
    注意：尽管在所有图像中使用相同的曝光时间最为理想，但在此应用中允许曝光时间存在差异，因为本实验不进行样本间荧光强度的定量或比较。
  3. 使用软件中相应的图像采集按钮捕获图像。若样本应用了多种染色，需切换滤光片（例如 FITC、TRITC 或 Cy5），并对同一区域成像，以便后续图像合并。
  4. 应用快门以最小化样本暴露于光照的时间。在未将比例尺烧录进图像的前提下，将图像以通用的图像文件格式（.tif、.png 或 .jpg）保存至指定文件夹。确保每个图像文件名具有足够的描述性，或对所用的命名编码提供相应的关联文档说明。
    注意：该文件夹将作为定量分析程序的图像目录。若使用了多色成像，请仅将细胞核图像复制到另一个独立的专用文件夹中（也可在成像结束后统一处理）。大多数成像软件默认导出设置所生成的图像通常已具备足够分辨率，可用于本程序分析，前提是原始图像质量良好。然而，导出后应目视检查图像，确保细胞核形态清晰。若以 .jpg 格式保存图像，应注意避免过度压缩，确保图像质量。
  5. 打开快门，返回实时成像模式，扫描样本至下一个成像位置。根据需要重复步骤 1.8–1.9。对于在6孔板中接种、以10倍物镜拍摄的细胞图像，每孔采集10–15张图像（具体数量取决于样本区域中细胞密度的一致性）。
  6. 完成单个样本的所有图像采集后，执行以下任一操作：
    1. 继续下一个样本，重复步骤 1.4–1.10。
    2. 暂停实验流程，留待后续时间继续。样本应始终保持避光状态。若处理活细胞，不建议采用此选项。
  7. 成像完成后，在打开室内灯光前，确保所有样本均已避光保护。若图像文件夹保存在本地，应将文件转移至U盘、云存储位置或可被运行定量分析程序的计算机访问的其他网络驱动器中，并保存于专用文件夹内。
  8. 根据既定的标准操作程序，关闭显微镜和计算机的所有组件。
  9. 成像步骤现已完成。可按照第2节所述使用自动化定量分析程序处理文件，或按照第3节所述以Python脚本方式运行程序进行分析。

2. 作为可执行文件运行自动细胞核定量程序

注意：此方法通过将程序作为可执行文件运行，适用于基于 Windows 的计算机，是 Windows 操作系统用户的推荐方法。Mac OS 或其他非 Windows 用户应将程序作为 Python 脚本运行（参见第 3 节）。

  1. 确保计算机上已安装 Python。如有需要，可从 python.org/downloads（推荐）下载安装，或使用 Anaconda 或 Miniconda 安装。截至发布日期，本程序已在 Python 3.10–3.12 版本上测试通过。
  2. 打开浏览器，访问 https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases，下载名为 count_nuclei.zip 的最新版本文件。
  3. 在“下载”文件夹中，右键单击 Zip 文件，将所有文件解压到本地计算机的指定位置（见 图 2A）。保持该文件位置打开，后续步骤 2.5 中将使用此文件路径（见 图 2B）。
    注意：此时应显示名为 Count_nuclei 的应用程序文件，即为可执行文件。
  4. 在搜索栏中搜索 CMD 或命令提示符，打开命令提示符窗口。使用 cd 命令将目录切换至可执行文件所在的路径（见 图 2C），然后按 Enter 键。示例命令行：C:\Users\janedoe>cd [cd 后加一个空格，然后复制/粘贴文件路径]
  5. 在下一行命令提示符中输入以下命令，然后按 Enter 键：
    count_nuclei.exe --img_dir "path/to/images" --output_dir "path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
    其中，path/to/images 为待分析图像所在文件夹的路径（见步骤 1.14）；path/to/output 为输出 .csv 文件的保存路径（若未指定，则默认为当前工作目录）；results.csv 为保存计数结果的文件名（若未指定，则默认文件名为 count_results.csv）。
    注意：命令行中必须包含引号，且引号与文件路径之间不得有空格（见 图 2C）。
  6. 当下一行命令提示符出现时，表示处理已完成。此时，轮廓图像和结果表格文件将保存在步骤 2.5 中指定的输出目录中（即 path/to/output；见 图 2C）。
  7. 请目视检查轮廓图像，以确认计数质量。随后可按照第 4 节所述方法，使用结果数据进行数据归一化处理。
    注意：若轮廓图像中存在遗漏细胞核（例如细胞核过暗）或多个细胞核被合并为单个对象（例如图像过曝、背景过强、存在伪影）的情况，用户应参考故障排除表，并可能需要返回第 1 节优化图像采集条件，再进入第 4 节。

细胞核定量过程；用于图像分析结果的文件提取设置和命令提示符。
图 2：第 2 节工作流程中关键步骤的示例。 （A）从“下载”文件夹中解压文件，注意根据箭头指示点击正确的文件夹以启动解压过程；（B）在步骤 2.3 中将文件解压至目标位置；（C）步骤 2.4 和 2.5 的命令示例，以及步骤 2.6 中表示操作完成的下一条命令行。请注意，步骤 2.4（C）中的文件路径应与步骤 2.3（B）中指定的解压位置一致。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 以 Python 脚本运行自动细胞核定量程序

  1. 确保计算机上已安装 Python。如有需要，可从 python.org/downloads（推荐）下载安装，或使用 Anaconda 或 Miniconda 安装。截至本文发表时，该程序已在 Python 3.10–3.12 版本上测试通过。
  2. 打开浏览器并访问 https://github.com/rbudnar/nuclei_counter。点击绿色代码按钮，然后点击下载 ZIP以下载代码仓库（见图 3A）。
  3. 请按照以下说明操作 Windows 操作系统。Mac OS 系统的用户请参见步骤 3.4。
    1. 在“下载”文件夹中，右键单击文件，选择全部解压，将文件解压到本地计算机（见图 3B–C）。
    2. 在解压后的文件位置，打开名为 nuclei_counter-main 的文件夹。此即为代码仓库。
      注意：此步骤仅在首次使用该程序时需要执行；可将解压后的文件移至可访问的网络位置，并记录该路径。
    3. 在搜索栏中搜索 CMD 或命令提示符，以打开命令提示符窗口。若 Python 是通过 Anaconda 或 Miniconda 安装的，请改用 Anaconda Prompt。可在搜索栏中输入 Anaconda Prompt 查找该程序。
    4. 使用 cd 命令将当前目录切换至代码仓库路径，然后按Enter键。请参考以下代码行，注意大小写敏感。复制文件路径时，请确保已打开名为 nuclei_counter-main 的文件夹，并能看见 pyproject 或 pyproject.toml 文件（见图 3D）。示例命令行：C:\Users\janedoe>cd [cd 后加空格，然后复制/粘贴文件路径]
    5. 在下一行命令中输入以下内容，包括空格和句点（见图 3D）：
      pip install -e .
      注意：步骤 3.3.5 和 3.3.6 仅需在任一计算机上首次运行该程序时执行一次。若已完成，可直接进入步骤 3.3.7。安装过程可能需要数秒时间初始化。
    6. 按Enter键。该命令将安装运行脚本所需的库，并以可编辑模式安装仓库，以便在需要修改代码时进行调整（见图 3D）。
    7. 在下一行命令中输入以下内容，将目录切换至主源代码目录（见图 3E）：
      cd "nuclei_counter"
    8. 在下一行命令中输入以下内容并按Enter键（见图 3E）：
      python count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir "path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      其中，path/to/images 是包含待分析图像的文件夹路径（见步骤 1.14）；path/to/output 是保存 .csv 文件的文件夹路径（若未指定，则默认为当前工作目录）；results.csv 是保存计数结果的文件名（若未指定，则默认输出文件名为 count_results.csv）。
      注意：命令行中必须包含引号。请确保引号后紧接文件路径，引号与路径之间不得有空格。Python 脚本将读取指定路径中的文件，并对目录内所有图像执行细胞核计数程序（见图 3E）。计数结果将保存至指定位置的 results.csv 文件中。
    9. 当下一行命令提示符出现时，表示处理已完成（见图 3E）。此时，轮廓图像和结果表格文件已保存至步骤 3.3.8 中指定的输出目录（即 path/to/output）。

细胞核定量的软件安装过程和命令执行步骤，显示文件解压和命令提示符操作。
图3：在Windows操作系统下进行第3节工作流程中关键步骤的示例。 要获取代码，请点击标有Code的绿色按钮，然后（A）下载Zip文件（箭头所示）。(B) 通过右键单击Zip文件（蓝色显示）进行解压，并（C）设置目标路径。（D）打开命令提示符后，显示步骤3.3.4和3.3.5的命令示例。请注意，步骤3.3.5的命令位于同一行；下一行以“Obtaining file”开头的文本是在按下回车键（步骤3.3.6；即运行命令）后出现的。（E）步骤3.3.7和3.3.8的命令示例，执行步骤3.3.8后出现的进度条，以及步骤3.3.9中显示完成的命令行。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 请按照以下说明在 Mac OS 系统上操作。
    1. 在“下载”文件夹中，点击 文件 菜单，选择 打开，以将文件解压到本地计算机（见 图 4A）。
    2. 在解压后的文件位置，打开名为 nuclei_counter-main 的文件夹。此即代码仓库。
      注意：此步骤仅在首次使用该程序时需要执行；可将解压后的文件移至可访问的网络位置，并记录该位置。
    3. 按下 command+空格键 打开 Spotlight 搜索，然后搜索“terminal”（终端）。
    4. 使用 cd 命令将目录切换至代码仓库，然后按 Enter 键。请参见下方代码行，该命令区分大小写。建议先在文本文档中输入文件路径，再复制到终端中。确保文件路径以紧接在 cd 后的文本开头（例如 图 4B 中的 /Users/userid）。示例命令行：/Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. 在下一行命令行中，用户 ID 后将出现一个美元符号（见 图 4B）。请确保美元符号后有一个空格，然后输入以下命令，包括命令末尾的空格和句点。在 pip 后立即输入相应的 Python 版本号，中间不留空格：pip3 install -e .
      注意：步骤 3.4.5 和 3.4.6 仅需在任一计算机上首次运行该程序时执行一次。若已完成，可直接进入步骤 3.4.7。安装过程可能需要数秒时间初始化。
    6. 按 Enter 键。运行此命令将安装运行脚本所需的库，并以可编辑模式安装代码仓库，以便在需要修改代码时进行调整。
    7. 在下一行命令行中，确保美元符号后有一个空格，然后输入以下命令，将目录切换至主源代码目录（见 图 4C）：
      cd "nuclei_counter"
    8. 在下一行命令行中，输入以下命令行。如果使用的 Python 版本不是 3，请将命令中 python 后的数字替换为正确的版本号，然后按 Enter 键（见 图 4C）：
      python3 count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir " path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      其中，path/to/images 是包含待分析图像的文件夹路径（见步骤 1.14）；path/to/output 是保存 .csv 文件的文件夹路径（若未提供，则默认为当前工作目录）；results.csv 是保存计数结果的文件名（若未提供，则默认输出文件名为 count_results.csv）。
      注意：命令行中必须包含引号。请确保引号后紧接文件路径，引号后无空格。Python 脚本将读取指定路径中的文件，并对目录中的所有图像执行核计数程序（见 图 4C）。计数结果将保存至指定位置的 results.csv 文件中。
    9. 当下一行命令行出现时，表示处理已完成（见 图 4C）。此时，轮廓图像和结果表格文件将保存在步骤 3.4.8 中指定的输出目录（即 path/to/output）中。
  2. 请目视检查轮廓，以验证计数质量。现在可按照第 4 节所述，使用结果对数据进行归一化处理。
    注意：若轮廓显示遗漏了细胞核（例如细胞核过暗）或多个细胞核被聚类为单个对象（例如图像过曝、背景过强或存在伪影），用户应参考 Table 1，并可能需要返回第 1 节优化图像采集，再进入第 4 节。

核计数器设置的文件导航和命令行脚本执行步骤。
图4：使用 Mac OS 进行第3节工作流程中关键步骤的示例。下载代码后（见图3A），（A）通过点击Zip文件（以蓝色显示）并设置目标路径来解压。（B）打开终端后，执行步骤3.4.4（将目录切换至代码仓库）和步骤3.4.5（安装pip）的命令示例。（C）步骤3.4.7和3.4.8的命令示例，执行步骤3.4.8后显示的进度条，以及步骤3.4.9中显示完成的命令行界面。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 使用计数数据标准化实验数据

  1. 打开 results.csv 文件，该文件将每张图像与使用自动化程序确定的细胞核定量结果相关联。
  2. 确定归一化方法：1）基于每张图像进行归一化（例如，适用于多色荧光显微镜），2）将数据归一化为每个样本的平均细胞核计数相对于参考样本（或条件）的比值，3）将数据归一化为每个样本的细胞核计数（例如，将总细胞核计数外推至样本面积）。有关归一化方法的建议详见讨论部分。
    1. 若按每张图像进行归一化，只需将每张图像的实验数据除以该图像的细胞核数量即可。
    2. 若以比值形式进行数据归一化，请遵循以下步骤。
      1. 对于单个重复中采集了多张图像的样本（例如，从6孔板中的单个孔采集10–15张图像），计算每张图像的平均细胞核数量。这些细胞核计数被视为细胞数量，假设为单核细胞，或多个细胞融合形成的多核细胞（如肌管细胞）中的细胞数量。
      2. 选择一个参考样本或参考条件（例如，对照条件下所有样本的平均计数），并记录其计数值。
      3. 将所有样本的计数除以该参考计数，得到归一化值。若使用了参考样本，则该参考样本的归一化值设为1。
        注意：若使用参考条件，则该条件下所有样本的平均归一化值将为1。细胞核数量少于参考样本（即密度较低）的样本，其归一化值小于1；细胞核数量多于参考样本（即密度较高）的样本，其归一化值大于1。
      4. 将每个孔的实验数据除以相应计算出的归一化值。
    3. 若将数据归一化为每个样本的细胞核计数，请遵循以下步骤。
      1. 对于单个重复中采集了多张图像的样本（例如，从6孔板中的单个孔采集10–15张图像），计算每张图像的平均细胞核数量。这些细胞核计数被视为细胞数量，假设为单核细胞，或多个细胞融合形成的多核细胞（如肌管细胞）中的细胞数量。
      2. 确定采集数据所用载玻片（盖玻片）、孔或培养皿的表面积。该信息可在产品网站的规格说明部分找到。
      3. 确定每张采集图像的面积。该信息通常可在成像或分析软件中作为元数据获取。
      4. 确保样本表面积与图像面积使用相同的单位（例如，mm2）。若单位不同，需转换为相同单位。
      5. 使用以下公式计算每个样本的总细胞核计数：
        TC = AC • (SA/IA)
        其中 TC 为总细胞核计数，AC 为平均计数，SA 为表面积，IA 为图像面积。
      6. 将实验数据除以对应样本的 TC 值。
  3. 对实验数据进行归一化处理，并根据需要用于统计分析。

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结果

每批图像运行将生成：1）一组已应用轮廓的图像文件，显示所识别出的细胞核的轮廓（图5）；以及 2）一个 .csv 文件（电子表格），用于关联图像文件名及其对应的计数结果。通过查看这些轮廓，用户可对计数质量进行视觉评估。具体而言，按照第1节 所述方法获得的图像中，所有（或几乎全部）细胞核应被实心绿色线条包围，表明该细胞核已被程序计入。此处正是利用这些轮廓对程序进行了优化调整。

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图5：原始图像及对应轮廓示例。（A-C）分析前的原始图像示例，（D-F）为其正下方对应的分...

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讨论

我们的细胞核定量程序相较于现有选项具有多项优势：仅需基本的技术技能，针对细胞核定量这一特定任务经过验证，且为开源程序；其中开源特性克服了与成本相关的障碍。最终，该程序为细胞与分子生物学家提供了一种额外的选择，可快速、准确地对荧光显微镜拍摄的图像中的细胞核进行定量分析。目前可用的自动化细胞核或细胞计数程序并非所有用户都青睐，部分程序价格昂贵，且在特定应用中的验证可能不足或缺失。专用设备（如 BioTek Cytation 系列）虽附有技术公告，验证了利用细胞核染色进行原位细胞计数20，并支持多种其他应用。尽管已有验证数据，且 Cytation 产品线被广泛使用——尤其是在与 Seahorse 细胞外通量分析仪联用时，可便捷高效地归一化活细胞数据——但对于设备经费有限的实验室而言，该产品可能因成本过高而难以承受。例如，在2024日历年度，配备四个物镜和四个荧光滤光片组的基础型号的标价已超过10万美元。对于无力购买专用设备的研究者，开源软件为图像分析提供了免费的替代方案。适用于细胞核和细胞定量的开源软件包括 ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国；可访问

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所（R01AG084597；DEL 和 HYL）以及德克萨斯理工大学的启动资金（DEL）提供资助。作者谨此感谢德克萨斯理工大学本科生研究学者计划（Undergraduate Research Scholars）和 TrUE 学者计划为参与本研究工作的本科生研究人员（REH、MRD、CJM、AKW）提供的财政支持。我们还感谢 Lauren S. Gollahon 博士和 Michael P. Massett 博士慷慨共享其实验室空间与设备。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可访问方法2或方法3结果文件的计算机--参见步骤2.6（方法2）或步骤3.3.9或3.4.9（方法3）
具备互联网连接和现代浏览器的计算机--例如，Google Chrome
具备互联网连接、现代浏览器和Windows操作系统的计算机视情况而定视情况而定对于Mac、Linux或其他操作系统，请使用方法3
配备图像采集软件的计算机ZeissAxioVision其他软件也可接受；必须与荧光显微镜兼容
输出文件存储位置（结果电子表格和图像轮廓）--可以是一个新建的空文件夹
荧光显微镜ZeissAxiovert 200M其他荧光显微镜也可接受；必须配备合适的滤光片组、所需物镜和相机 
包含所有待量化图像的文件夹--参见步骤1.12
Python 3.10或更高版本Python-可在 https://www.python.org/downloads/ 免费下载和安装 
待成像样品--固定或活体样品，使用荧光DNA染料染色或复染
电子表格软件MicrosoftExcel类似的电子表格软件也可接受

参考文献

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