本文报道了一种利用人CD59/中介溶血素细胞清除工具选择性清除肾巨噬细胞以研究其再生的实验方案。该方法也可用于研究肾脏、肝脏和脂肪组织中其他细胞群体的功能与再生。
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摘要
摘要
肾脏巨噬细胞（RMs）对肾脏健康至关重要，可协调免疫监视、组织稳态以及对损伤的应答。此前，我们报道了利用人CD59（hCD59）/中介溶血素（ILY）细胞清除工具，研究来源于骨髓或胚胎的不同命运、动态变化及微环境的RMs。RMs起源于卵黄囊来源的巨噬细胞、胎儿肝脏单核细胞以及骨髓来源的单核细胞，并通过局部增殖和循环单核细胞的招募在成年期得以维持。本文中，我们报告了一种选择性清除RMs以研究其再生的详细实验方案，包括：1）在小鼠RMs中诱导Cre依赖性hCD59表达的构建与表征；2）ILY的纯化及其活性的鉴定；3）在复合型小鼠中诱导RMs表达hCD59；以及4）ILY介导的RMs清除后再生过程的表征。ILY可在复合型小鼠中特异性且快速地清除RMs，在给予ILY后1天内即可实现高效的巨噬细胞清除。肾内巨噬细胞的再生在清除后第3天开始，至第7天恢复约88%。该模型为研究巨噬细胞生物学提供了有力工具，也可用于选择性清除肾脏、肝脏及脂肪组织中的其他细胞群体，以探究其功能与再生机制。
引言
肾巨噬细胞（RMs）是维持肾脏稳态、调节免疫反应以及在损伤后促进组织修复的关键免疫细胞。它们执行多种功能，包括吞噬作用、抗原提呈，以及协调炎症和抗炎反应1,2,3。根据局部微环境的不同，RMs 可极化为促炎型（M1）或抗炎型（M2）表型，从而加剧损伤或促进修复4,5,6。RMs 功能失调已被证实参与急性肾损伤（AKI）和慢性肾脏病（CKD）的发生与发展，使其成为肾脏健康与疾病过程中的关键参与者7,8。RMs 来源于多种前体细胞，包括胚胎发育期间卵黄囊来源的巨噬细胞、胎儿肝脏单核细胞以及成年期骨髓来源的单核细胞。出生后，RMs 随肾脏生长同步扩增和成熟，出生前主要来源于胎儿肝脏单核细胞，成年后则通过外周单核细胞补充实现自我维持9。在成体中，循环单核细胞可被稳态或损伤信号招募至肾脏，并在局部微环境影响下分化为巨噬细胞。RMs 的稳态维持依赖于局部增殖以及循环单核细胞的周期性补充
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方案
动物实验方案经杜兰大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 1482）。实验小鼠， Cx3cr1CreER+/+ 和 ihCD59+/+，10-12周龄，体重25-30 g，在大学动物实验中心的特定病原体-free（SPF）条件下饲养。所有涉及肾脏分离的操作均在无菌环境中进行，研究人员佩戴手套和口罩以防止污染。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.
1. 动物准备
- 从杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）获取 CX3CR1CreER+/+ 小鼠。将小鼠饲养于杜兰大学医学院（Tulane University School of Medicine, SOM）的特定无病原体（SPF）设施中。在12小时光照/12小时黑暗循环及受控环境条件下维持动物生存。
- 使用先前构建的具有C57BL/6遗传背景的 ihCD59+/+ 小鼠进行繁育。将纯合的 CX3CR1CreER+/+ 小鼠（CX3CR1表达缺陷型）与 ihCD59+/- 小鼠杂交，以获得以下基因型子代：CX3CR1CreER+/-/i....
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结果
His标签重组ILY的纯化遵循此前文献14中所述的相同方案。ILY在含有编码中间链球菌（Streptococcus intermedius）ILY基因质粒的E. coli BL21(DE3)细胞中成功表达。经IPTG诱导后，目标蛋白的过表达明显。表达完成后，利用C端His标签进行镍-NTA亲和层析纯化ILY蛋白。通过SDS-PAGE分析确认了ILY的纯度及其分子量（约54 kDa）（图1A）。使用ImageJ软件对蛋白条带强度进行密度测定定量，并通过分光光度分析进一步验证蛋白浓度，最终浓度为1.27 mg/mL。通过人红细胞（RBCs）溶血实验评估纯化后ILY的生物学活性，该实验是评估胆固醇依赖性溶细胞素的标准方法。实验结果显示剂量依赖性的溶血活性，证实了重组蛋白的功能完整性。阳性对照（水）引起完全溶血，而阴性对照（PBS缓冲液）未出现溶血。纯化的ILY表现出强烈的溶血活性，在7.24 ng/mL浓度下可引起50%的人红细胞裂解，在650 ng/mL时溶血率接近完全（99.62%）（
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讨论
本研究中，His标签重组ILY蛋白的成功表达、纯化及功能验证遵循了一项成熟 established 的实验方案15。然而，该过程包含多个关键步骤，以确保获得高产量、高纯度及具有生物活性的蛋白。通过IPTG诱导E. coli BL21 (DE3)细胞时，优化了诱导条件，以在控制蛋白表达水平的同时尽量减少包涵体的形成。尽管该方案具有良好的重复性，但仍需进行若干修改和故障排查，以最大化蛋白产量和功能活性。其中一项关键改进是优化IPTG浓度和诱导温度，因为在较高温度下过度表达会导致蛋白形成不溶性聚集体。在37 °C条件下，将IPTG浓度从0.2 mM逐步提高至0.5 mM，显著改善了蛋白的可溶性。此外，在纯化过程中，洗涤缓冲液中的咪唑浓度经过精细调整，以在有效洗脱目标蛋白的同时尽量减少非特异性蛋白结合。
在本文中，我们描述了一种利用 ILY-hCD59 系统选择.......
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披露
作者声明，他们不存在可能影响本论文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。本研究的设计、实施、解释或报告未受到任何利益冲突的影响，包括财务、非财务、专业或个人方面的关系。
致谢
我们感谢秦实验室的历任及现任成员，为本研究所采用的实验方案的开发与优化所做出的贡献。同时，我们感谢俄克拉荷马大学健康科学中心 R. K. Tweten 博士团队慷慨提供了重组 ILY 质粒，该质粒对本研究起到了关键作用。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NIH 5 P51OD011104-58、R01DK129881（X.Q.）和 R21OD024931（X.Q.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm 注射器滤器 | Millipore | SLHVR33RS | |
| 4-15% TGX 免染色蛋白质凝胶 | Bio-Rad | 4568084 | |
| 6X 上样缓冲液 | Fisher | 50-103-6570 | |
| 70% 乙醇 | WWR Life Science | 64-17-5 | |
| ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| 亲和树脂珠 | Millipore | 69670 | |
| 氨苄青霉素钠溶液 | Zymo Research | A1001-5 | |
| 抗 CD11b-PE-Cy7（克隆 M1/70） | Invitrogen | 25-0112-82 | |
| 抗 CD16/32（FcγRIII/II，克隆 93） | eBioscience | 48-0161-80 | |
| 抗 CD45-e450（克隆 30-F11） | eBioscience | 48-0451-82 | |
| 抗 F4/80-BV605（克隆 BM8） | BioLegend | 123133 | |
| 抗 hCD59-PE（克隆 OV9A2） | Invitrogen | 12-0596-42 | |
| Aqua 活/死细胞染料 | Invitrogen | L34957A | |
| 珠粒（树脂） | Millipore | 69670 | |
| 苯并核酸酶 | Millipore | 70664-10KUN | |
| BugBuster 蛋白提取试剂 | Millipore | 70584-4 | |
| 微量离心管用离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 离心管用离心机 | Thermo Scientific | 75-001-241 | |
| IV 型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS004188 | |
| 玉米油 | Sigma Aldrich | C8267 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNA酶）I | Worthington Biochemical Corporation | LS002007 | |
| Detoxi-Gel 树脂柱 | Millipore | 69670 | |
| DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液）溶液 | Corning | 21-031-CV | |
| EDTA 管 | BD | 365974 | |
| FBS（胎牛血清） | Gibco | 10082-139 | |
| 甘油 | Fisher | BP229-1 | |
| HBSS（Hank’s 平衡盐溶液） | Gibco | 24020117 | |
| IPTG（异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷） | Millipore-Sigma | 206-703-0 | |
| 异氟烷 | VET one | 502017 | |
| LB 培养基 | |||
| LSRFortessa 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸] | Fisher | 50-488-796 | |
| MOPS [3-(N-吗啉代)丙磺酸] | Fisher | 50-213-522 | |
| Percoll 密度梯度介质 | Cytiva | 17089101 | |
| 蠕动泵 | Fisher Scientific | 现已停产，请使用替代品 | |
| PFA（多聚甲醛） | Thermo Scientific | I28800 | |
| 纯化柱 | Millipore | UFC900308 | |
| r溶菌酶溶液 | Novagen | 20C71110 | |
| 摇床水浴箱 | Thermo Scientific | TSSB15 | |
| Slide-A-Lyzer 透析试剂盒 | Thermo | 66107 | |
| 脱氧胆酸钠 | Fisher | BP349-100 | 新鲜配制或使用一个月内 |
| 无菌细胞筛（40 μm） | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | 6734 | |
| 超滤离心管 | Millipore | UFC900308 | |
| 超纯水 | Thermo | 10977-015 | |
| 涡旋混合器 | Fisher Scientific | 2215365 | |
| β-ME（β-巯基乙醇） | Fisher | BP176-100 |
参考文献
- Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
- Nelson, P. J., et al. The renal mononuclear phagocytic system. J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).
- Wang, Y., Harris, D. C.
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重印与许可
