利用流式细胞术鉴定损伤脊髓中的小胶质细胞和外周浸润巨噬细胞

摘要

在受损脊髓中区分小胶质细胞（MG）和外周浸润的巨噬细胞（Mø）具有挑战性。本方案中，采用流式细胞术（FCM）分别鉴定M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。该技术也可应用于其他中枢神经系统疾病，以阐明MG和Mø的作用。

摘要

在健康的脊髓中，外周浸润的巨噬细胞几乎无法检测到，而小胶质细胞（MG）通过吞噬作用、清除细胞碎片以及产生神经营养因子，参与维持脊髓微环境的稳定。脊髓损伤（SCI）后，MG被激活，外周免疫细胞浸润至受损脊髓组织。在这些免疫细胞中，活化的小胶质细胞和外周浸润的巨噬细胞（Mø）在SCI的病理过程中发挥关键作用。这些细胞可被区分为促炎型（M1样）和抗炎型（M2样）表型；然而，由于它们在形态学和许多细胞标志物上的相似性，区分二者具有挑战性。流式细胞术（FCM）是生物医学领域广泛使用的一种技术，可在单次实验中同时检测多种细胞参数，如细胞大小、颗粒度、细胞表面及胞内标志物。经过多年的科研探索，研究者尝试应用FCM鉴定脊髓中的MG和Mø，并不断优化该方法，最终建立了一种稳定的检测方案。该方法通过检测CD45、CD11b、CD68、CCR7等标志物的表达谱，实现对SCI后M1样MG、M2样MG、M1样Mø及M2样Mø的识别。在本方案中，CD11b⁺CD45^−/lowCD68⁺CCR7⁺、CD11b⁺CD45^−/lowCD68⁺CCR7^-、CD11b⁺CD45^highCD68⁺CCR7⁺和CD11b⁺CD45^highCD68⁺CCR7^-细胞可分别被鉴定为M1样MG、M2样MG、M1样Mø和M2样Mø。

引言

脊髓损伤（SCI）是由多种原因导致脊髓组织受损所引起的一种疾病。SCI致残率高，目前尚无有效的治疗方法，已成为全球最严重的公共卫生问题之一^1,2。SCI的病理生理过程复杂，可分为两个阶段：最初，机械性创伤会立即引发急性细胞功能障碍和细胞死亡；随后，继发性损伤会在数天、数周甚至数月内进一步导致细胞功能障碍和细胞死亡。在继发性损伤机制中，炎症已被证实是决定继发性损害严重程度的关键因素，最终影响细胞的存活与功能³。炎症反应的特征是炎性细胞浸润并激活于受损脊髓组织内，导致炎性细胞和炎性因子增多，形成炎症微环境，最终引起脊髓功能障碍⁴。

中枢神经系统（CNS）中的小胶质细胞和外周浸润的巨噬细胞在脊髓损伤（SCI）后的炎症反应中发挥关键作用^5,6。作为CNS的常驻巨噬细胞，小胶质细胞占CNS细胞总数的5%–10%，对SCI后的恢复至关重要^7,8。SCI后，小胶质细胞可吞噬并清除细胞碎片，介导修复性瘢痕的形成^9<....

方案

本研究经蚌埠医学院动物护理伦理委员会批准（编号：2020-050）。动物护理遵循中国科学技术部提供的相关规定。共购入并使用18只八周龄雌性C57/BL6小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 实验与动物准备

1. 手术前将小鼠饲养在通风的笼具中，维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，并提供自由摄食和饮水。环境温度保持在20–22 °C，相对湿度保持在30%–70%，适应环境至少一周。
2. 通过高压灭菌法对小鼠手术器械进行灭菌，并在使用前烘干。手术前半小时，对手术器械及动物手术室进行紫外线消毒。根据随机分组原则对小鼠进行分组并标记。记录并登记每只小鼠的体重，以备后续使用。
3. 采用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合溶液，按照机构批准的方案通过腹腔注射对小鼠进行麻醉。剃除小鼠背部T8至T10椎骨区域的毛发。

2. SCI 小鼠模型的制备

1. 使用碘伏棉签从头部至尾部对T9为中心的手术区域进行消毒，随后用75%酒精棉签再次消毒。在T9处中央做1 cm长的皮肤切口。解剖T9周围1 cm范围内的筋膜、肌肉和韧带。
   1. 分离T9棘突旁的肌肉以暴露T9。使用眼科剪剪除T9与T10之间的椎板....

结果

利用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅密度梯度离心法分离脊髓组织中的免疫细胞。在离心过程中，细胞根据其浮力密度分布到不同层次，从而实现细胞分离（图1）。从上至下，分布依次为：细胞碎片、富含单核细胞的层、富含淋巴细胞的层，以及底部的红细胞和粒细胞层。

M1样和M2样细胞的流式细胞术（FCM）分析采用由CD68、CD45、CD11b和CCR7组成的细胞标志物表达谱^29,30。表达CD11b⁺ CD68⁺ CCR7⁺的细胞被定义为M1样细胞，而CD11b⁺ CD68⁺ CCR7^-细胞则被定义为M2样细胞。此外，CD11b⁺CD45^−/lowCD68⁺CCR7⁺、CD11b

讨论

成功建立脊髓损伤（SCI）动物模型至关重要。SCI模型通过在T9节段对脊髓施加0.5 N的力来建立。动物模型成功的标志包括：小鼠尾巴卷曲、双侧后肢出现痉挛以及后肢瘫痪，导致小鼠在SCI后无法行走（见步骤2.3）。术后护理对小鼠的存活至关重要。需提供排尿护理，直至小鼠能够自主排尿。同时必须预防因感染引起的血尿。术后应防止小鼠后肢发生肿胀和感染，并采取措施防止小鼠啃咬其后肢，以避免致命后果（见步骤2.5）。

将脊髓组织研磨后离心获得的细胞沉淀用胰蛋白酶消化，以防止细胞黏附并获得单细胞悬液（见步骤4.1）。通过将70%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液与30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液分层叠加形成密度梯度，确保各层之间无气泡，以维持密度梯度的连续性。将待分离的细胞悬液轻轻加至30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液上层，避免扰动梯度，防止破坏密度梯度的连续性。聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅密度梯度离心体系由70%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液、30%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液以及制备好的细胞悬液组成，在20 °C条件下以300 × g离心.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1×PBS	Solarbio	P1020
10×PBS	Solarbio	P1022
18 只八周龄雌性 C57/BL6 小鼠	中国常州 Cavens 实验动物有限公司
APC-eFluor 780 标记的大鼠抗小鼠 CCR7（IgG2b kappa）	Invitrogen	47-1971-82	0.25μg/次
APC-eFluor 780 标记的大鼠 IgG2b kappa 同型对照	Invitrogen	47-4321-82	0.25μg/次
APC 标记的大鼠抗小鼠 CD45（IgG2b kappa）	Invitrogen	17-0451-82	0.125μg/次
APC 标记的大鼠 IgG2b kappa 同型对照	Invitrogen	17-4031-82	0.125μg/次
DMEM	Gibco	11965092
胎牛血清	Lonsera	S711-001
FITC 标记的大鼠抗小鼠 CD68（IgG2b kappa）	Invitrogen	MA5-16676	0.25μg/次
FITC 标记的大鼠 IgG2b kappa 同型对照	Invitrogen	11-4031-82	0.25μg/次
多聚甲醛	biosharp	23319084
PE 标记的大鼠抗小鼠 CD11b（IgG2b kappa）	Invitrogen	12-0112-81	0.25μg/次
PE 标记的大鼠 IgG2b kappa 同型对照	Invitrogen	12-4031-82	0.25μg/次
Percoll	Solarbio	P8370
胰蛋白酶溶液	biosharp	BL526A