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基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

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DOI：

10.3791/67968

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2025年6月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

通讯作者： Song-Bai Liu <liusongbai@126.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种凝胶迁移生化实验，用于检测FEN1（瓣状内切酶1）的活性及抑制剂的开发。

摘要

FEN1（瓣状内切核酸酶1）是一种参与DNA复制和损伤修复的关键DNA核酸酶，在维持基因组稳定性方面发挥重要作用。FEN1活性升高与多种癌症的发生发展密切相关，使其成为肺癌、乳腺癌和前列腺癌公认的生物标志物和药物靶点。传统的放射性同位素标记法在检测FEN1核酸酶活性时存在操作不便和安全性差等问题。本研究合成了一种具有瓣状结构的DNA片段底物 体外该底物在 flap 的 5' 端标记有荧光基团，可使 FEN1 核酸酶特异性识别并切割指定位点。通过凝胶电泳后检测荧光基团信号，即可测定 FEN1 的活性。该方法能够快速、有效地评估 FEN1 核酸酶活性及其抑制剂的筛选，为分析 FEN1 活性及评价小分子抑制剂的效力提供了一种灵敏且特异的技术手段。此外，该方法对 DNA 损伤修复及癌症发生机制的研究具有重要意义，为疾病机制的临床研究以及遗传毒性物质的检测提供了新的策略。

引言

DNA复制并不总是完美的，可能受到内部和外部因素的干扰。因此，DNA复制及损伤修复机制对于细胞存活和基因组稳定性至关重要。在此过程中，人源分支结构特异性核酸内切酶FEN1（Flap Endonuclease 1）作为一种核心DNA核酸酶，发挥着关键作用1,2,3。

FEN1 主要参与 DNA 复制过程，对滞后链上冈崎片段的成熟至关重要4,5。这确保了 DNA 复制的高效进行以及受损 DNA 的准确修复。然而，FEN1 水平的异常升高已与多种癌症的发生密切相关6,7，例如肺癌和乳腺癌7。因此，FEN1 不仅在 DNA 复制和修复中发挥关键作用，还作为癌症诊断的生物标志物及潜在治疗靶点受到广泛关注8,9。检测 FEN1 活性对于癌症的早期诊断以及靶向治疗研究的推进具有重要意义。

鉴于FEN1的重要性，以及研究其活性以实现癌症早期诊断和靶向治疗开发的需求，本实验所建立方法的主要目标是准确、高效地检测FEN1核酸酶活性。该方法旨在为筛选靶向FEN1的小分子抑制剂提供一个可靠的平台。通过实现这些目标，本研究期望加深对FEN1在癌症中作用的理解，并推动新型治疗策略的发现。

目前存在多种检测FEN1核酸酶活性的技术，每种技术在特性、原理、优势、局限性及适用场景方面各不相同。例如，基于凝胶电泳和高效液相色谱（HPLC）的底物分离方法虽然能够提供直观的结果，但操作繁琐且通量较低10,11。荧光偏振（FP）检测法在评估FEN1活性时面临挑战，因为化合物的自发荧光或光散射会干扰FP信号。尽管可通过反筛策略部分排除假阳性结果，但由于技术干扰，仍有约15%的初筛活性化合物被误判12。结合使用荧光供体/淬灭剂对（如TAMRA/BHQ-2）与AlphaScreen化学发光的方法也存在缺点，例如合成复杂的三重茎环荧光底物成本较高，尤其限制了其在大规模筛选中的应用。此外，底物的双茎环结构可能阻碍其与FEN1的最佳结合，降低酶切效率，从而影响检测灵敏度。同时，该方法高度依赖专用仪器（如ViewLux、EnVision），限制了其在资源有限实验室中的推广应用13,14,15。基于银纳米簇功能化的哑铃形双茎环DNA纳米探针（DNA-AgNCs）的荧光检测方法则因依赖精确的退火和原位成核步骤，存在批次间变异问题，影响实验的可重复性和可扩展性。高昂的成本和耗时的操作流程进一步限制了其实际应用16。

本文开发了一种基于荧光标记的检测方法，以解决当前技术的局限性，并满足对更安全、易于用户操作的FEN1活性研究方法日益增长的需求。该技术利用了荧光检测的高度特异性和高灵敏度，以及构建具有明确结构的DNA底物的能力，这些底物可被FEN1识别并切割（图1）。该方法在保持对FEN1核酸酶活性高精度评估的同时，简化了实验流程。与传统的凝胶电泳和基于高效液相色谱（HPLC）的技术相比，该方法操作更简便，检测周期更短。与荧光偏振检测不同，该方法可实现对化合物的快速定性筛选，为初步酶学评价建立了一种高效的策略。

该方法适用于在放射性材料使用受限的实验室环境中研究FEN1核酸酶活性。它也特别适合在较短时间内对大量小分子抑制剂进行筛选，尤其是在需要高灵敏度和高特异性的场合。然而，对于需要极高精度进行绝对定量的研究，或缺乏基本荧光检测设备以及荧光信号分析经验的实验室，该方法并不理想。对于侧重于体内（in vivo）应用的研究——其中FEN1的行为可能受到当前体外（in vitro）检测体系无法模拟的复杂生物学因素影响——可能需要进一步优化方法或采用其他替代方案。

该荧光检测法具有高灵敏度和高特异性，为研究FEN1活性及开发其抑制剂提供了一种安全、便捷且有效的工具。

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. FEN1 蛋白的表达与纯化

  1. 蛋白质纯化
    1. 从 −80 °C 取出含有目标质粒的细菌保藏液（见材料表）。室温融化后，使用 200 µL 移液枪头将 1.5 mL 冷冻微量离心管中的 200 µL 菌液接种至含有 50 µg/mL 卡那霉素的 20 mL LB 培养基中。
      注：菌株为 E. coli BL21(DE3)-FEN1。
    2. 在 37 °C、160 rpm 振荡条件下培养 12 小时。
    3. 将细菌悬液转移至含有添加了 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基的 200 mL 锥形瓶中。继续在 37 °C、160 rpm 振荡条件下培养 2–3 小时。
    4. 当菌液 OD600 值达到约 0.6 时，加入 2 mL IPTG（终浓度：1 mM）。继续在 25 °C、160 rpm 振荡条件下培养 10 小时。
    5. 将诱导后的菌液转移至预先称重的 50 mL 离心管中。在 4 °C、2500 × g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液。称量含有沉淀的离心管重量，减去空管重量以计算沉淀质量。
    6. 每克湿菌体沉淀加入 7 mL 裂解缓冲液。使用移液器反复吹打，充分重悬沉淀。
      注：裂解缓冲液（共 10 mL）包含 20 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、2% Triton X-100 和 ddH2O。此步骤应在通风橱中进行，以确保化学试剂的安全操作。
    7. 将含有裂解缓冲液的细菌悬液转移至 −80 °C 冰箱中，冷冻过夜。次日，在 4 °C 摇床上解冻 1 小时，以提高裂解效率。
    8. 使用超声波在 75% 功率下裂解细胞 45 分钟。在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 20 分钟，分离上清液与沉淀。
      注：若裂解液仍浑浊，可增加裂解缓冲液体积或重复冻融循环。也可加入核酸酶抑制剂以维持蛋白质完整性并防止降解。
    9. 将澄清后的上清液沿管壁缓慢加入含有预装蛋白质纯化树脂的离心管中。用 10 mL 洗脱缓冲液洗涤，去除非特异性结合的蛋白质。
      注：洗脱缓冲液包含 20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、250 mM NaCl、2% Triton X-100、200 mM 咪唑和蒸馏水。
    10. 沿离心管内壁加入 5 mL 洗脱缓冲液，洗脱 FEN1 蛋白。
  2. 通过快速考马斯亮蓝染色鉴定目标蛋白
    1. 根据 FEN1 蛋白的预期大小，配制 12% 分离胶和 5% 浓缩胶的 SDS-PAGE 凝胶。
    2. 将目标蛋白样品与 BSA 标准品按 1:4 的比例与 5× 上样缓冲液混合。在 95 °C 加热 5 分钟，使蛋白质充分变性。
    3. 分别取 20 µL BSA 标准品和变性后的蛋白样品，加入 SDS-PAGE 凝胶的不同加样孔中。
    4. 连接电泳装置。设定电压为 90 V，电泳 1 小时 40 分钟。
    5. 电泳结束后，将凝胶转移至染色容器中。用去离子水冲洗，然后加入 30 mL 蛋白染色液，染色 25 分钟。回收染色液，用 20 mL 去离子水冲洗凝胶，并在水平摇床上脱色过夜。
    6. 脱色后，将凝胶置于透明塑料板上，在白光下观察蛋白条带。
      注：若条带较弱或蛋白浓度较低，可使用超滤管浓缩样品。该步骤可去除过量溶剂和小分子，提高蛋白浓度，确保后续实验的准确分析。

2. FEN1 TAMRA标记的DNA底物制备

  1. TAMRA 标记的 DNA 底物制备
    1. 根据 FEN1 的特异性切割活性设计 DNA 寡核苷酸链，参考已发表的方法17（见表 1）。D1 序列的 5′ 端用荧光 TAMRA 标记进行修饰。
    2. 将混合的单链 DNA 寡核苷酸加入 10 μL 退火缓冲液中，具体体积如下：5 μL D1（10 pmol/μL）、10 μL T1（10 pmol/μL）和 7.5 μL U2（10 pmol/μL）。加入去离子水使总体积达到 50 μL。
      注：退火缓冲液包含 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 10 mM MgCl2。
    3. 将反应混合物置于金属浴中，100 °C 加热 1 分钟，然后立即转移至 72 °C 保温 10 分钟18。
      注：最终 DNA 底物长度为 80 个核苷酸。初始高温（100 °C）确保完全变性，而退火温度（72 °C）促进准确的链间配对。
    4. 关闭热源，使溶液逐渐冷却至室温，形成完整的双链 DNA 底物。
  2. TAMRA 标记的 DNA 底物检测
    1. 通过混合以下组分制备 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶：4.8 mL 30% 丙烯酰胺（29:1）、4.32 mL 6 M 尿素、2.4 mL 5× TBE、50 µL 10% APS、5 µL TEMED 和 0.48 mL 去离子水。充分混匀以制备凝胶。
    2. 将凝胶置于 37 °C 烘箱中 30 分钟以使其完全凝固。
    3. 用于检测时，将 2 µL 合成的 DNA 底物加入 18 µL 蒸馏水中，并加入 7.7 µL 终止缓冲液。
    4. 作为对照，将 2 µL TAMRA 标记的 D1 加入 18 µL 蒸馏水中，并加入 7.7 µL 终止缓冲液。
    5. 将每种制备好的样品各取 20 µL 上样至凝胶，进行 SDS-PAGE 电泳以分析 DNA 底物的形成情况。

3. FEN1 核酸酶活性检测

  1. FEN1 酶活性检测
    1. 通过将 2 µL DNA 底物与 FEN1 核酸酶在反应缓冲液中混合，配制 20 µL 反应体系。
      注意：反应缓冲液由 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、200 mM MgCl2、2 mM DTT、0.2 mg/mL BSA 和去离子水组成。
    2. 将反应体系置于金属浴中，37 °C 孵育 15 分钟。
    3. 加入 20 µL 2× 终止缓冲液以终止反应。
    4. 取 20 µL 反应后的样品，上样至预置的 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶，于 100 V 恒压电泳 60 分钟。
    5. 电泳结束后，使用荧光成像系统（600 pathway）观察结果。

4. FEN1 核酸酶小分子抑制剂的筛选

  1. 小分子抑制剂筛选
    1. 使用移液器将 2 µL 二甲基亚砜 (DMSO) 转移至一个 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 向管中加入 2 µL FEN1 核酸酶和 10 µL 2× 反应缓冲液。
    3. 充分混匀，并将混合物置于冰上孵育 10 分钟。
    4. 加入 2 μL DNA 底物和 4 μL 去离子水，充分混匀，使总体积达到 20 μL。
    5. 通过将 1 M 储存液用 DMSO 进行两倍倍比系列稀释，制备 FEN1 核酸酶抑制剂 FEN1-IN-4 的工作稀释液。
    6. 用移液器将 2 µL FEN1 核酸酶 (0.03 µg/µL) 和 2 µL 稀释后的 FEN1-IN-4 抑制剂加入一个新的 1.5 mL 微量离心管中。加入 10 µL 2× 反应缓冲液和 4 µL 去离子水。轻轻混匀，并在冰上孵育 10 分钟，以确保抑制剂与酶之间充分结合。
    7. 向管中加入 2 µL DNA 底物，形成最终体积为 20 µL 的反应混合物。
    8. 将反应体系在 37 °C 金属浴中孵育 15 分钟。
    9. 加入 20 µL 2× 终止缓冲液以终止反应。

FEN1--IN-4 小分子抑制剂抑制效力的评估

  1. 使用微量移液器吸取10 µL的2×反应缓冲液，加入到一个1.5 mL的微量离心管中。
  2. 加入2 µL浓度为0.03 µg/µL的FEN1核酸酶，以及不同浓度的2 µL FEN1抑制剂FEN1-IN-4。
    注意：应根据实验要求建立多个浓度梯度。
  3. 加入4 μL去离子水，并充分混匀溶液。将1.5 mL微量离心管置于冰上，孵育10分钟。
  4. 向管中加入2 µL双链DNA底物，形成20 µL的反应体系。
  5. 将EP管放入37 °C金属浴中孵育15分钟。
  6. 反应完成后，向反应混合物中加入20 µL的2×终止缓冲液以终止反应。
  7. 使用荧光成像设备观察结果，并绘制IC50 曲线19。
    注意：使用Fiji/ImageJ20进行荧光强度定量，随后采用绘图与分析软件进行统计分析和可视化21。

结果

如图2A所示，染色试剂与蛋白质结合，使蛋白质在凝胶上呈现为蓝色条带。第一泳道包含用作分子量参照的标记蛋白质，其中BSA标准蛋白质条带对应的分子量为70 kDa，FEN1核酸酶蛋白质条带对应的分子量为45 kDa。实验结果表明，FEN1核酸酶在约45 kDa处出现清晰条带，表明诱导表达的蛋白质已成功纯化。

如图2B所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，其条带大小为59 kDa。第3泳道中的SF为合成的荧光素标记双链底物，其条带大小为80 kDa。与第2泳道相比，结果表明荧光素标记的双链DNA底物合成成功。

如图2C所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，而第3泳道中的SF代表未经处理的荧光素标记双链DNA底物。第4至第9泳道显示了FEN1在1 µg/µL、0.5 µg/µL、0.25 µg/µL、0.125 µg/µL、0.0625 µg/µL和0.031 µg/µL浓度下对底物的切割情况，反映了蛋白切割产物的分布特征。在FEN1核酸蛋白浓度为0.031 µg/µL时，双链DNA底物（80 nt）含量较对照组减少，而切割片段（20 nt）含量增加。当浓度达到0.5 µg/µL时，双链DNA底物（80 nt）被完全切割，表明FEN1核酸酶具有较强的酶活性。

如图2D所示，以不含FEN1核酸酶的体系作为阴性对照，加入FEN1-IN-4药物后，第4泳道中DNA双链底物（80 nt）的含量较第5泳道（小分子抑制剂浓度为0）显著增加。该结果表明，FEN1-IN-4能够抑制FEN1核酸酶对底物的切割活性。

如图2F所示，横轴表示反应体系中FEN1-IN-4的浓度，纵轴表示FEN1核酸酶的活性，其活性随抑制剂浓度增加而显著降低。实验结果表明，FEN1-IN-4的IC50为14.03 µM。

figure-results-1
图 1：FEN1 核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选。 DNA 底物制备与 FEN1 酶切反应检测的示意图。该图展示了 DNA 底物的制备步骤及实验流程，显示 FEN1 在特定底物位点介导的切割反应，生成明确的产物。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：FEN1 核酸酶结构-功能关系的表征及小分子抑制剂筛选。（A）FEN1 蛋白纯化实验。经 SDS-PAGE 电泳后染色分析纯化的 FEN1 蛋白。第 2–4 泳道分别含有 1 µg 和 2 µg 的 BSA 作为标准品。第 5–7 泳道分别含有 1 µL、2 µL 和 5 µL 的纯化 FEN1 核酸酶。（B）用于酶谱分析的 DNA 底物合成。通过凝胶电泳观察荧光素标记的 DNA 底物。第 2 泳道显示 D1（单链 DNA 底物），第 3 泳道显示 SF（合成的双链 DNA 底物）。（C）FEN1 核酸酶活性实验。第 2 泳道显示 D1（单链底物）；第 3 泳道显示 SF（未经处理的双链底物）。第 4–9 泳道代表 FEN1 浓度递增（1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 和 0.031 µg/µL），通过逐步切割显示酶活性。（D）FEN1 抑制剂筛选实验。反应体系中含 0.03 µg/µL FEN1 和 2 µL SF（荧光素标记的双链底物），在 2× 反应缓冲液中 37 °C 孵育 15 分钟。第 1 泳道显示 D1（无酶）；第 2 泳道显示 SF（无酶）；第 3 泳道为 DMSO 对照。第 4–7 泳道代表不同小分子抑制剂处理条件。（E）FEN1-IN-4 抑制效果评估。第 1 泳道：单链底物（D1）；第 2 泳道：双链底物（SF）；第 3 泳道：阴性对照（无 FEN1 酶或抑制剂）；第 4–14 泳道：在 FEN1 存在下，FEN1-IN-4 浓度递增，用于评估剂量依赖性抑制作用。（F）FEN1-IN-4 抑制效应的定量分析。对 FEN1-IN-4 在 0.12 至 250.00 µM 浓度范围内的抑制作用进行灰度密度分析。反应在 37 °C 孵育 15 分钟，计算 IC50 值以评估抑制效力。请点击此处查看该图的放大版本。

名称序列 (5'至3')*碱基数5'端修饰
T1CGAATTCCTGAGACGGAGTT
GAGGTGTCTCGATCTAAAGG
TCAATCCTGACGAACTGTAG
GGTTCGTCTGGATAGAATTG		80
U2GCTTAAGGACTCTGCCTCAA
CTCCACAGAGCTAGATTTCC		40
D1AAGTGCCATTAATACCGGTA
GTTAGGACTGCTTGACATC
CCAAGCAGACCTATCTTAAC		59TAMRA

表1：用于FEN1核酸酶活性检测的DNA底物序列。 列出了在酶活性和抑制实验中使用的荧光素标记的单链和双链DNA底物的序列。

讨论

FEN1 核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选在DNA损伤修复与癌症发生研究中具有核心作用。与传统的放射性标记技术相比，本方法具有成本低、效率高、操作简便和安全性好等优势。此外，与基于荧光爆发信号的FEN1检测方法不同，该方法能够更直观地显示底物的切割情况，从而更准确地评估酶活性，并为相关研究提供更为可靠的实验平台14。

确保结果的可靠性和可重复性，有几个关键步骤至关重要。首先，采用原核表达系统（E. coli BL21用于表达重组FEN1蛋白，从而实现酶学实验所需蛋白的大规模制备。该蛋白带有N端His标签，通过镍亲和层析进行纯化，并用咪唑洗脱。蛋白的纯度和身份已得到确认 通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹，如图所示 图2A.

DNA底物的设计基于该研究团队先前关于FEN1核酸酶的研究工作17。这些底物模拟了在DNA复制和修复过程中通常遇到的DNA结构，为评估FEN1功能提供了生理相关的实验环境。采用靶向荧光标记策略以确保底物的特异性。当FEN1在特定位点介导切割后，底物长度的变化将导致荧光信号发生可检测的位移。该方法具有操作简便、安全性高和特异性强等优点，能够可靠地检测FEN1核酸酶的活性。

精确的序列设计、按比例混合以及严格的温度控制对于正确合成DNA底物至关重要，该底物是后续检测中特异性结合与反应的基础（图2B）。在检测过程中，酶活性有时可能超出预期范围——过高或过低。为解决此问题，需核对并根据需要调整所有反应组分的浓度，特别是MgCl2和DTT等关键辅因子的浓度。同时检查酶的活性及其储存条件，以避免潜在的失活。必要时，对FEN1酶重新纯化或更换。反应温度（通常为35 °C至39 °C）和孵育时间（10–20分钟）应优化，以确保检测的准确性。底物浓度的选择依据本研究团队先前发表的实验方案17。

在涉及竞争性抑制剂（如 FEN1-IN-4）的系统中，底物浓度起着关键作用。当底物浓度较高——显著超过酶的 Km 值时——底物能更有效地与抑制剂竞争酶的活性位点，从而减少抑制剂的结合，降低其表观抑制效应。相反，当底物浓度接近或低于 Km 值时，抑制剂更易与 FEN1 结合，导致更显著的抑制作用，表现为产物生成减少，并相应地引起荧光信号下降。

本方法所用底物也适用于荧光偏振（FP）检测。FP检测的主要优势之一是其与高通量筛选（HTS）的兼容性，可在大规模化合物筛选中提高效率和准确性。然而，FP检测需要专用的荧光偏振仪器和熟练的操作人员，这可能限制其可及性。相比之下，所述方法更为简便，可直接通过肉眼观察抑制效应，便于更广泛的应用。

综上所述，所描述的FEN1核酸酶活性检测方法及小分子抑制剂筛选策略为开发高通量筛选平台奠定了坚实基础。通过优化实验参数，该方法可支持对大规模化合物库进行快速筛选，从而加速药物发现与开发的早期阶段。此外，该方法在癌症早期诊断相关研究以及靶向治疗药物的开发中具有重要意义。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了江苏省高等教育机构科学技术创新团队（2021年）、江苏省高等职业院校工程技术研究中心项目（2023年）、苏州市民生科技项目关键技术计划（SYWD2024099）、苏州大学放射医学与防护国家重点实验室项目（GZK12023013）、苏州卫生职业技术学院项目（SZWZYTD202201、SZWZYTD202205）以及中国江苏省青蓝工程（2021年、2022年）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M Tris-HCLBeyotimeST774
30% Acr-Bis (29:1)BeyotimeST003-500ml
5M NaclBeyotimeST347
BeyoBlue PlusBeyotimeP0003S
BL21(DE3)-FEN1VazymeC504-F1
BSABeyotimeP0007
脱色摇床Kylin-BellTS-100
DL-二硫苏糖醇BeyotimeST041
干式恒温孵育器RUICHENGDH200
电泳仪北京六一生物科技DDY-6D
FEN1-IN-4TargetMOLT8545
IPTGTakaba9030
卡那霉素硫酸盐BiosharpBS152
实验室离心机ThermoSL 16R
LB 培养基SolarbioL8291
Ni-NTA His Bind Resin7se biotechPANF001-001C
Odyssey FCODYSSEYLI-COR
SDS-PAGEBeyotimeP0015L
Trition-x-100ShyuanyeS15022

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