基于荧光的 FEN1 核酸酶活性检测和小分子抑制剂的筛选

摘要

该方案描述了用于测量 FEN1（瓣核酸内切酶 1）活性和抑制剂开发的凝胶位移生化测定。

摘要

FEN1 （Flap Endonucerase 1） 是一种参与 DNA 复制和损伤修复的关键 DNA 核酸酶，在维持基因组稳定性方面起着至关重要的作用。FEN1 活性水平升高与各种癌症的发生密切相关，使 FEN1 成为肺癌、乳腺癌和前列腺癌公认的生物标志物和药物靶点。用于检测 FEN1 核酸酶活性的传统放射性同位素标记方法在便利性和安全性方面存在挑战。在本研究中，在 体外合成了具有瓣结构的 DNA 片段底物。该底物在皮瓣的 5' 端用荧光团标记，使 FEN1 核酸酶能够特异性识别和切割指定位点。然后通过检测凝胶电泳后的荧光团信号来确定 FEN1 活性。该方法能够快速有效地评估 FEN1 核酸酶活性并筛选其抑制剂。它为分析 FEN1 活性和评估小分子抑制剂的疗效提供了一种灵敏和特异性的方法。此外，它对 DNA 损伤修复和癌症发展的研究做出了重大贡献，为疾病机制的临床研究和遗传毒性物质的检测提供了一种新的策略。

引言

DNA 复制并不总是完美无缺的，并且可能受到内部和外部因素的干扰。因此，DNA 复制和损伤修复机制对于细胞存活和基因组稳定性至关重要。在此过程中，核心 DNA 核酸酶 （DNA 核心核酸酶） 人分支结构特异性核酸内切酶 FEN1（皮瓣核酸内切酶 1）起着至关重要的作用 ^1,2,3。

FEN1 主要参与 DNA 复制，对于滞后链上冈崎片段的成熟是必不可少的 ^4,5。这确保了 DNA 复制的有效进展和受损 DNA 的准确修复。然而，FEN1 水平的异常升高与各种癌症的发展密切相关 ^6,7，例如肺癌和乳腺癌⁷。因此，FEN1 不仅对 DNA 复制和修复至关重要，而且作为癌症诊断的生物标志物和潜在的治疗靶标也受到了极大的关注 ^8,9。FEN1 活性的检测对于癌症的早期诊断和推进靶向治疗的研究至关重要。

鉴于 FEN1 的重要性，以及研究其活性对早期癌症诊断和靶向治疗开发的需求，本实验中开发的方法的主要目标是准确有效地测量 FEN1 核酸酶活性。该方法旨在为筛选靶向 FEN1 的小分子抑制剂提供一个可靠的平台。通过实现这些目标，该研究旨在为更好地了解 FEN1 在癌症中的作用做出贡献，并促进发现新的治疗策略。

有许多技术可用于检测 FEN1 核酸酶活性，每种技术都有不同的特性、原理、优势、局限性和适用场景。例如，凝胶电泳和基于 HPLC 的底物分离方法可提供直观的结果，但涉及繁琐的程序和低通量^10,11。由于化合物自发荧光或光散射的干扰会影响 FP 信号，荧光偏振 （FP） 检测在评估 FEN1 活性方面面临挑战。尽管反筛选策略可以部分排除假阳性，但由于技术干扰，大约 15% 的初级活性化合物仍被错误识别¹²。荧光供体/淬灭基团对（例如 TAMRA/BHQ-2）和 AlphaScreen 化学发光的联合使用存在缺点，例如复杂的三瓣荧光底物的合成成本高，特别是限制了它们在大规模筛选中的应用。此外，底物的双瓣结构可能会阻碍与 FEN1 的最佳结合，从而降低酶切割效率并损害检测灵敏度。此外，这种方法严重依赖专用仪器（例如 ViewLux、EnVision），限制了它在资源有限的实验室中的采用 13,14,15。基于银纳米簇 （DNA-AgNCs） 功能化的双瓣哑铃形 DNA 纳米探针的荧光检测方法由于依赖于精确退火和原位成核步骤，因此存在批次间差异，阻碍了可重复性和可扩展性。高成本和冗长的程序进一步限制了它们的实际应用¹⁶.

在本文中，开发了一种基于荧光标记的检测方法，以解决当前的技术限制，并满足对更安全、用户可访问的 FEN1 活性研究方法日益增长的需求。该技术利用了荧光检测的特异性和高灵敏度，以及设计具有可被 FEN1 识别和裂解的明确结构的 DNA 底物的能力（图 1）。该方法简化了实验程序，同时保持了评估 FEN1 核酸酶活性的高精度。与传统的凝胶电泳和基于 HPLC 的技术相比，它提供了简化的作和更快的周转时间。与荧光偏振测定不同，这种方法能够对化合物进行快速定性筛选，为初步酶学评估建立有效的策略。

该方法适用于在放射性物质获取受限的实验室环境中研究 FEN1 核酸酶活性。它也非常适合在相对较短的时间内筛选大量小分子抑制剂，尤其是在需要高灵敏度和特异性的情况下。然而，对于需要非常高精度的绝对定量的研究或缺乏基本荧光检测设备和荧光信号分析专业知识的实验室，它并不理想。对于专注于 体内 应用的研究 - 其中 FEN1 行为可能受到当前 体外 测定设计中未复制的复杂生物因素的影响 - 可能需要进一步改进或替代方法。

这种荧光检测具有高度的灵敏度和特异性，为研究 FEN1 活性和开发其抑制剂提供了一种安全、方便和有效的工具。

方案

本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. FEN1 蛋白表达纯化

1. 蛋白纯化
   1. 从 -80 °C 中取出含有目标质粒的细菌原液（参见 材料表）。 在室温下解冻，并使用 200 μL 移液器吸头将 200 μL 从冷冻的 1.5 mL 微量离心管接种到含有 50 μg/mL 卡那霉素的 20 mL LB 培养基中。
      注意：该菌株是 大肠杆菌 BL21（DE3）-FEN1。
   2. 在 37 °C 下孵育，以 160 rpm 振荡 12 小时。
   3. 将细菌悬浮液转移到含有补充有 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基的 200 mL 锥形瓶中。继续在 37 °C 下孵育，以 160 rpm 振荡 2-3 小时。
   4. 当培养物的 OD₆₀₀ 达到约 0.6 时，加入 2 mL 的 IPTG（终浓度：1 mM）。继续在 25 °C、160 rpm 下孵育 10 小时。
   5. 将诱导的培养物转移到预先称重的 50 mL 离心管中。在 4 °C 和 2500 × g 下离心 15 分钟。丢弃上清液。称量含颗粒的试管并减去空试管的重量以计算颗粒质量。
   6. 每克湿细胞沉淀物加入 7 mL 裂解缓冲液。使用移液管通过上下移液彻底重悬沉淀。
      注：裂解缓冲液（共 10 mL）含有 20 mM Tris-HCl、250 mM NaCl、2% Triton X-100 和 ddH₂O。在通风橱中执行此步骤，以确保安全处理化学试剂。
   7. 将裂解缓冲液中的细菌悬浮液转移到 −80 °C 冰箱中并冷冻过夜。第二天，在 4 °C 摇床上解冻悬浮液 1 小时以提高裂解效率。
   8. 使用超声以 75% 的功率裂解细胞 45 分钟。将裂解物在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 20 分钟，以将上清液与沉淀分离。
      注：如果裂解液仍然浑浊，请增加裂解缓冲液的体积或重复冻融循环。也可以添加核酸酶抑制剂以保持蛋白质完整性并防止降解。
   9. 将澄清的上清液沿含有制备的蛋白质纯化树脂的试管壁涂抹。用 10 mL 洗脱缓冲液洗涤以去除非特异性结合的蛋白质。
      注：洗脱缓冲液含有 20 mM Tris-HCl （pH 7.5）、250 mM NaCl、2% Triton X-100、200 mM 咪唑和蒸馏水。
   10. 沿试管内壁添加 5 mL 洗脱缓冲液洗脱 FEN1 蛋白。
2. 通过快速考马斯亮蓝染色鉴定靶蛋白
   1. 根据 FEN1 的预期大小，使用 12% 分离凝胶和 5% 浓缩凝胶制备 SDS-PAGE 凝胶。
   2. 将目标蛋白样品和 BSA 标准品与 5× 样品缓冲液以 1：4 的比例混合。将混合物在 95 °C 下加热 5 分钟以使蛋白质完全变性。
   3. 将 20 μL BSA 标准品和变性蛋白样品分别上样到 SDS-PAGE 凝胶的单独孔中。
   4. 连接电泳仪。将电压设置为 90 V 并运行 1 小时 40 分钟。
   5. 电泳后，将凝胶转移至染色容器中。用去离子水冲洗，然后加入 30 mL 蛋白质染色液并染色 25 分钟。回收染色溶液，用 20 mL 去离子水冲洗凝胶，并在水平摇床上脱色过夜。
   6. 脱色后，将凝胶放在透明塑料板上，在白光下观察蛋白质条带。
      注：如果条带微弱或蛋白质浓度低，请使用超滤管浓缩样品。此步骤可去除多余的溶剂和小分子，提高蛋白质浓度并确保后续实验中的准确分析。

2. FEN1 TAMRA 标记的 DNA 底物制备

1. TAMRA 标记的 DNA 底物制备
   1. 根据 FEN1 的特异性切割活性设计 DNA 寡核苷酸链，参考已发表的方法¹⁷（见 表 1）。D1 序列的 5' 末端用荧光 TAMRA 标记修饰。
   2. 将混合的单链 DNA 寡核苷酸加入 10 μL 退火缓冲液中，体积如下：5 μL D1 （10 pmol/μL）、10 μL T1 （10 pmol/μL） 和 7.5 μL U2 （10 pmol/μL）。加入去离子水，使总体积达到 50 μL。
      注：退火缓冲液含有 100 mM 的 Tris-HCl （pH 7.5） 和 10 mM 的 MgCl₂。
   3. 将反应混合物在金属浴中于 100 °C 加热 1 分钟，然后立即转移至 72 °C 反应 10 分钟¹⁸.
      注：最终 DNA 底物长度为 80 个核苷酸。高初始温度 （100 °C） 可确保变性，而退火温度 （72 °C） 可促进精确的链配对。
   4. 关闭热源，让溶液逐渐冷却至室温，形成完整的双链 DNA 底物。
2. TAMRA 标记的 DNA 底物测定
   1. 通过混合 4.8 mL 30% 丙烯酰胺 （29：1）、4.32 mL 6 M 尿素、2.4 mL 5× TBE、50 μL 10% APS、5 μL TEMED 和 0.48 mL 去离子水，制备 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶。充分混匀以制备凝胶。
   2. 将凝胶置于 37 °C 的烘箱中 30 分钟以凝固。
   3. 检测时，将 2 μL 合成的 DNA 底物移液到 18 μL 蒸馏水中，并加入 7.7 μL 终止缓冲液。
   4. 作为参考，将 2 μL TAMRA 标记的 D1 移液到 18 μL 蒸馏水中，并加入 7.7 μL 终止缓冲液。
   5. 将 20 μL 制备的样品加载到凝胶上，并进行 SDS-PAGE 电泳以分析 DNA 底物的形成。

3. FEN1 核酸酶活性测定

1. FEN1 酶活性测定
   1. 通过在反应缓冲液中将 2 μL DNA 底物与 FEN1 核酸酶混合，制备 20 μL 反应混合物。
      注：反应缓冲液由 100 mM Tris-HCl （pH 7.5）、200 mM MgCl₂、2 mM DTT、0.2 mg/mL BSA 和去离子水组成。
   2. 将反应混合物在 37 °C 的金属浴中孵育 15 分钟。
   3. 加入 20 μL 2× 终止缓冲液终止反应。
   4. 将 20 μL 反应样品加载到预先制备的 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，并在 100 V 下进行电泳 60 分钟。
   5. 电泳后，使用荧光成像系统（600 通路）可视化结果。

4. FEN1 核酸酶小分子抑制剂的筛选

1. 小分子抑制剂筛选
   1. 使用移液器将 2 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 转移到 1.5 mL 微量离心管中。
   2. 向试管中加入 2 μL FEN1 核酸酶和 10 μL 2× 反应缓冲液。
   3. 充分混合并在冰上孵育混合物 10 分钟。
   4. 加入 2 μL DNA 底物和 4 μL 去离子水，充分混合，使总反应体积达到 20 μL。
   5. 通过在 DMSO 中对 1 M 储备液进行两倍连续稀释，制备 FEN1 核酸酶抑制剂 FEN1-IN-4 的工作稀释液。
   6. 将 2 μL FEN1 核酸酶 （0.03 μg/μL） 和 2 μL 稀释的 FEN1-IN-4 抑制剂移液到新的 1.5 mL 微量离心管中。加入 10 μL 2× 反应缓冲液和 4 μL 去离子水。轻轻混匀并在冰上孵育 10 分钟，以确保抑制剂和酶之间有足够的相互作用。
   7. 向试管中加入 2 μL DNA 底物，形成最终的 20 μL 反应混合物。
   8. 将反应物在 37 °C 下在金属浴中孵育 15 分钟。
   9. 加入 20 μL 2× 终止缓冲液终止反应。

5. FEN1--IN-4 小分子抑制剂的抑制效能评价

1. 使用微量移液器吸取 10 μL 2× 反应缓冲液，并将其添加到 1.5 mL 微量离心管中。
2. 加入 2 μL 浓度为 0.03 μg/μL 的 FEN1 核酸酶，以及 2 μL 不同浓度的 FEN1 抑制剂 FEN1-IN-4。
   注意：应根据实验要求建立多个浓度梯度。
3. 加入 4 μL 去离子水并充分混合溶液。将 1.5 mL 微量离心管置于冰上并孵育 10 分钟。
4. 向试管中加入 2 μL 双链 DNA 底物，形成 20 μL 反应系统。
5. 将 EP 管置于 37 °C 金属浴中 15 分钟。
6. 反应完成后，向反应混合物中加入 20 μL 2× 终止缓冲液以终止反应。
7. 使用荧光成像设备观察结果并绘制 IC₅₀ 曲线¹⁹。
   注：使用 Fiji/ImageJ²⁰ 进行荧光强度定量，然后使用绘图和分析软件²¹ 进行统计分析和可视化。

结果

如图 2A 所示，染色试剂与蛋白质结合，导致蛋白质在凝胶上显示为蓝色条带。第一条泳道包含用作分子量参考的标记蛋白，其中 BSA 标准蛋白条带对应于 70 kDa 的分子量，FEN1 核酸条带对应于 45 kDa 的分子量。实验结果表明，FEN1 核酸酶在大约 45 kDa 处显示为一条清晰条带，表明成功纯化了诱导蛋白的表达。

如图 2B 所示，泳道 2 中的 D1 代表荧光素标记的单链 DNA 底物，条带大小为 59 kDa。泳道 3 中的 SF 是合成的荧光素标记的双链底物，条带尺寸为 80 kDa。与泳道 2 相比，结果表明荧光素标记的双链 DNA 底物的成功合成。

如图 2C 所示，泳道 2 中的 D1 是荧光素标记的单链 DNA 底物，而泳道 3 中的 SF 代表未处理的荧光素标记的双链 DNA 底物。泳道 4 至 9 显示了 FEN1 在 ...

讨论

FEN1 核酸酶活性测定和小分子抑制剂筛选是 DNA 损伤修复和癌症发展研究的核心。与传统的放射性标记技术相比，该方法提供了一种经济高效、易于作且更安全的替代方案。此外，与基于荧光突发的 FEN1 检测不同，这种方法提供了更直观的底物切割可视化，从而可以更准确地评估酶活性，并为相关研究提供更可靠的平台¹⁴。

几个关键步骤对于确保结果的可靠性和可重复性至关重要。首先，使用原核表达系统 （E. coli BL21） 生产重组 FEN1 蛋白，从而能够大规模生产用于酶测定的蛋白质。使用镍亲和色谱法纯化标记有 N 端 His 标签的蛋白质，并用咪唑洗脱。 通过 SDS-PAGE 和 Western blotting 确认蛋白质的纯度和身份，如图 2A 所示。

DNA 底物是根据研究小组之前对 FEN1 核酸酶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M Tris-HCL	碧奥泰姆	ST774型
30% Acr-Bis （29：1）	碧奥泰姆	ST003-500毫升
5M 氯化钠	碧奥泰姆	ST347
碧洋蓝加	碧奥泰姆	P0003S
BL21（DE3）-FEN1	瓦济姆	C504-F1型
BSA的	碧奥泰姆	P0007
脱色摇床	麒麟贝尔	TS-100型
DL-二硫苏糖醇	碧奥泰姆	ST041
干浴培养箱	瑞城	第200迪拉姆
电泳仪	北京六益生物科技	DDY-6D
FEN1-IN-4	目标商船三井	T8545
IPTG的	高叶	9030
Kanamycin Slufate	生物夏普	BS152
实验室离心机	热	SL 16R
LB肉汤	索拉生物	L8291
Ni-NTA His Bind 树脂	7SE生物科技	PANF001-001C
奥德赛足球俱乐部	奥德赛	锂电
SDS-页面	碧奥泰姆	P0015L
滴水-x-100	师源业	S15022