本方案描述了一种凝胶迁移生化实验，用于检测FEN1（瓣状内切酶1）的活性及抑制剂的开发。
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方法文章
基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
FEN1（瓣状内切核酸酶1）是一种参与DNA复制和损伤修复的关键DNA核酸酶，在维持基因组稳定性方面发挥重要作用。FEN1活性升高与多种癌症的发生发展密切相关，使其成为肺癌、乳腺癌和前列腺癌公认的生物标志物和药物靶点。传统的放射性同位素标记法在检测FEN1核酸酶活性时存在操作不便和安全性差等问题。本研究合成了一种具有瓣状结构的DNA片段底物 体外该底物在 flap 的 5' 端标记有荧光基团，可使 FEN1 核酸酶特异性识别并切割指定位点。通过凝胶电泳后检测荧光基团信号，即可测定 FEN1 的活性。该方法能够快速、有效地评估 FEN1 核酸酶活性及其抑制剂的筛选，为分析 FEN1 活性及评价小分子抑制剂的效力提供了一种灵敏且特异的技术手段。此外，该方法对 DNA 损伤修复及癌症发生机制的研究具有重要意义，为疾病机制的临床研究以及遗传毒性物质的检测提供了新的策略。
引言
DNA复制并不总是完美的，可能受到内部和外部因素的干扰。因此，DNA复制及损伤修复机制对于细胞存活和基因组稳定性至关重要。在此过程中，人源分支结构特异性核酸内切酶FEN1（Flap Endonuclease 1）作为一种核心DNA核酸酶，发挥着关键作用1,2,3。
FEN1 主要参与 DNA 复制过程，对滞后链上冈崎片段的成熟至关重要4,5。这确保了 DNA 复制的高效进行以及受损 DNA 的准确修复。然而，FEN1 水平的异常升高已与多种癌症的发生密切相关6,7，例如肺癌和乳腺癌7。因此，FEN1 不仅在 DNA 复制和修复中发挥关键作用，还作为癌症诊断的生物标志物及潜在治疗靶点受到广泛关注8,9。检测 FEN1 活性对于癌症的早期诊断以及靶向治疗研究的推进具有重要意义。
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方案
本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. FEN1 蛋白的表达与纯化
- 蛋白质纯化
- 从 −80 °C 取出含有目标质粒的细菌保藏液（见材料表）。室温融化后，使用 200 µL 移液枪头将 1.5 mL 冷冻微量离心管中的 200 µL 菌液接种至含有 50 µg/mL 卡那霉素的 20 mL LB 培养基中。
注：菌株为 E. coli BL21(DE3)-FEN1。 - 在 37 °C、160 rpm 振荡条件下培养 12 小时。
- 将细菌悬液转移至含有添加了 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基的 200 mL 锥形瓶中。继续在 37 °C、160 rpm 振荡条件下培养 2–3 小时。
- 当菌液 OD600 值达到约 0.6 时，加入 2 mL IPTG（终浓度：1 mM）。继续在 25 °C、160 rpm 振荡条件下培养 10 小时。
- 将诱导后的菌液转移至预先称重的 50 mL 离心管中。在 4 °C、2500 × g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液....
- 从 −80 °C 取出含有目标质粒的细菌保藏液（见材料表）。室温融化后，使用 200 µL 移液枪头将 1.5 mL 冷冻微量离心管中的 200 µL 菌液接种至含有 50 µg/mL 卡那霉素的 20 mL LB 培养基中。
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结果
如图2A所示，染色试剂与蛋白质结合，使蛋白质在凝胶上呈现为蓝色条带。第一泳道包含用作分子量参照的标记蛋白质，其中BSA标准蛋白质条带对应的分子量为70 kDa，FEN1核酸酶蛋白质条带对应的分子量为45 kDa。实验结果表明，FEN1核酸酶在约45 kDa处出现清晰条带，表明诱导表达的蛋白质已成功纯化。
如图2B所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，其条带大小为59 kDa。第3泳道中的SF为合成的荧光素标记双链底物，其条带大小为80 kDa。与第2泳道相比，结果表明荧光素标记的双链DNA底物合成成功。
如图2C所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，而第3泳道中的SF代表未经处理的荧光素标记双链DNA底物。第4至第9泳道显示了FEN1在1 µg/µL、0.5 µg/µL、0.25 µg/µL、0.125 µg/µL、0.0.......
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讨论
FEN1 核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选在DNA损伤修复与癌症发生研究中具有核心作用。与传统的放射性标记技术相比，本方法具有成本低、效率高、操作简便和安全性好等优势。此外，与基于荧光爆发信号的FEN1检测方法不同，该方法能够更直观地显示底物的切割情况，从而更准确地评估酶活性，并为相关研究提供更为可靠的实验平台14。
确保结果的可靠性和可重复性，有几个关键步骤至关重要。首先，采用原核表达系统（E. coli BL21用于表达重组FEN1蛋白，从而实现酶学实验所需蛋白的大规模制备。该蛋白带有N端His标签，通过镍亲和层析进行纯化，并用咪唑洗脱。蛋白的纯度和身份已得到确认 通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹，如图所示 图2A.
DNA底物的设计基于该研究团队先前关于FEN1核酸酶的研究工作17。这些底物模拟了在DNA复制和修复过.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了江苏省高等教育机构科学技术创新团队（2021年）、江苏省高等职业院校工程技术研究中心项目（2023年）、苏州市民生科技项目关键技术计划（SYWD2024099）、苏州大学放射医学与防护国家重点实验室项目（GZK12023013）、苏州卫生职业技术学院项目（SZWZYTD202201、SZWZYTD202205）以及中国江苏省青蓝工程（2021年、2022年）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCL | Beyotime | ST774 | |
| 30% Acr-Bis (29:1) | Beyotime | ST003-500ml | |
| 5M Nacl | Beyotime | ST347 | |
| BeyoBlue Plus | Beyotime | P0003S | |
| BL21(DE3)-FEN1 | Vazyme | C504-F1 | |
| BSA | Beyotime | P0007 | |
| 脱色摇床 | Kylin-Bell | TS-100 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Beyotime | ST041 | |
| 干式恒温孵育器 | RUICHENG | DH200 | |
| 电泳仪 | 北京六一生物科技 | DDY-6D | |
| FEN1-IN-4 | TargetMOL | T8545 | |
| IPTG | Takaba | 9030 | |
| 卡那霉素硫酸盐 | Biosharp | BS152 | |
| 实验室离心机 | Thermo | SL 16R | |
| LB 培养基 | Solarbio | L8291 | |
| Ni-NTA His Bind Resin | 7se biotech | PANF001-001C | |
| Odyssey FC | ODYSSEY | LI-COR | |
| SDS-PAGE | Beyotime | P0015L | |
| Trition-x-100 | Shyuanye | S15022 |
参考文献
- Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
- Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Viro....
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