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方法文章

高度自发荧光临床样本的迭代漂白扩展多重成像优化工作流程

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DOI：

10.3791/67980

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2025年7月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

本文内容

摘要

将低成本、多功能的光照射技术与手动IBEX方法相结合，可实现对具有显著本底自发荧光的人体组织进行优化成像。本方案详细介绍了如何利用倒置显微镜、广泛可得的试剂以及开源软件，对存档的临床样本获取多重标记的全片图像，并进行图像配准与处理。

摘要

由非结核分枝杆菌（NTM）引起的肺部疾病在全球范围内的发病率正不断上升。尽管NTM所致肺部疾病常表现为支气管扩张、肺部结节和空洞性病变，但针对这些不同肺损伤模式的宿主免疫反应在原位尚未得到充分表征。in situ。本研究旨在通过深入分析NTM肺病患者肺组织中免疫细胞群体的表型特征，以评估NTM所致病理的潜在机制，并与肉芽肿性炎症的金标准——结核性（TB）肺病进行比较。

对播散性非结核分枝杆菌（NTM）、肺部 NTM 或肺结核（TB）疾病患者的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肺组织块进行切片，并采用改良的迭代漂白扩展多重性（IBEX）成像方法进行染色。首先需要优化 IBEX 方法，以解决肺组织切片中显著的内源性荧光问题，该问题源于肺组织固有的高密度胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞，且因 FFPE 保存方式及 FFPE 组织块的存放时间而加剧。在本方案中，我们详细描述了一种光照射处理程序和改良的抗原修复方法，可降低临床存档样本的自发荧光。

此外，我们提供了关于抗体面板设计的指导，包括常见的挑战，如交叉反应性、光照射后表位丢失、相邻荧光染料之间的光谱重叠，以及某些靶标的信噪比较低等问题。为了高效地对整个肺组织切片进行成像，载玻片使用宽场显微镜成像，并利用开源软件进行后期处理以提高图像质量。该工作流程共同解决了关键需求，记录了如何利用广泛可得的仪器和试剂，从难以处理的样本中获得高多重、高分辨率的全片图像。除了临床样本的定量成像外，这些技术还可应用于多种样本类型，以克服内源性和外源性荧光来源的干扰。

引言

结核病（TB）是导致死亡的主要原因之一，每年约有130万人死于结核感染1。尽管非结核分枝杆菌（NTM）引起的肺部感染致死性不及结核病，但近年来由NTM引发的肺部感染及其相关疾病显著增加2。在组织层面，肺部Mycobacterium tuberculosis（Mtb）感染所引发的宿主免疫反应已被广泛研究，其中包括肉芽肿的形成，即淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等组成的异质性聚集结构3。虽然肉芽肿性炎症同样是宿主对NTM感染免疫反应的基本特征，但参与该反应的免疫细胞群体及其空间分布特征仍缺乏深入研究。深入理解免疫病理过程与组织修复过程中组织成分的差异，对于开发治疗手段（例如宿主导向疗法）和预防策略（如疫苗）至关重要。

在本研究中，我们的团队获得了来自结核分枝杆菌（Mtb）或非结核分枝杆菌（NTM）感染患者肺部切除术或尸检过程中采集的稀有存档临床样本。这些样本大多已超过10年，以甲醛固定、石蜡包埋（FFPE）形式保存，因此仅可用于组织学检测。为了克服传统免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）成像在标记数量上的限制，我们采用了迭代漂白扩展多重性 （IBEX）方法，这是一种开源的高通量多重成像技术4,5。由于人肺FFPE样本具有较高的内源性荧光，将IBEX方法拓展应用于此类样本需要进行大量优化，而内源性荧光是多重抗体成像中已被广泛报道的技术障碍6。

本文提供了利用光照射法降低肺组织FFPE切片自发荧光的详细操作流程7,8。重要的是，此处描述的方法使用了一种价格低廉且广泛可得的光照箱，该装置可推广应用于其他具有高自发荧光的样本制备。除了在成像前降低自发荧光外，本文还提供了抗体面板设计的指导建议，包括将低丰度标记物与高亮度荧光染料配对、评估光照射对抗体标记的影响，以及在自发荧光较强的通道中使用二抗进行信号放大。通常情况下，我们每例组织切片处理5张玻片，每张面积介于37至114 mm2之间。最后，我们展示了如何使用宽场成像仪器获取全切片图像。综上所述，本方案描述了将IBEX技术应用于存档临床样本的具体方法，并进一步提供了针对高自发荧光样本成像过程中常见问题的故障排除指导。

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方案

根据美国国立卫生研究院临床中心病理学实验室的方案 09-H-0172（NCT00943514）“支气管扩张症的自然病程”，收集了存档的尸检和手术切除肺组织切片。该方案 已获得机构审查委员会（IRB）批准，参与者均签署了知情同意书。

1. 自动化抗原修复

注意：脱蜡和抗原修复使用自动化科研染色平台完成（图1）。先前的研究确定，采用双重抗原修复方法可获得最佳的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织免疫标记效果，即先使用pH 6的柠檬酸盐基表位修复液（ER1）处理30分钟，再使用pH 9的EDTA基表位修复液（ER2）处理30分钟9。也可通过手动脱蜡及使用其他已报道方法进行双重抗原修复，结合IBEX成像社区提供的支持，获得相当的结果10,11。

  1. 准备载玻片和自动抗原修复所需的耗材（载玻片盖片、检测系统、pH 6 的柠檬酸盐抗原修复液（ER1）、pH 9 的EDTA抗原修复液（ER2）等）。
  2. 打开仪器，等待其初始化20分钟，将检测臂放入仪器中，并将试剂容器插入机器底部。
  3. 启动软件，点击载玻片设置，选择添加研究项目，并为该研究项目创建一个新的名称。
  4. 选择添加载玻片，并根据需要对载玻片进行标记。
  5. 按照本方案，执行烘烤与脱蜡程序，并结合HIER程序，包括30分钟ER1和30分钟ER2处理。
  6. 打印标签并贴在载玻片表面。从仪器中取出黑色载玻片架，将待处理的载玻片放置于架上，为每张载玻片盖上透明盖片，将载玻片架放回仪器，按下支架下方按钮，启动仪器对载玻片进行条形码扫描。
  7. 选择播放 | 确定，开始自动抗原修复程序，整个过程约持续3小时。

2. 光照前的抗体标记

  1. 抗原修复完成后，将切片浸入 PBS中。
    注意：某些表位对光照射敏感，在LED灯下过夜暴露后会发生降解。敏感表位需通过实验经验确定，一旦发现，应在本步骤进行这些表位的免疫标记。确保抗原修复后切片始终保持湿润。
  2. 从PBS中取出一张切片，使用无绒擦拭纸擦去切片上多余的PBS，注意不要触碰组织。用疏水笔在组织周围画出边界。对所有剩余切片重复此过程。让疏水屏障干燥10分钟。
  3. 通过在每个孔底部加入少量水来制备切片保湿盒。将切片放入切片保湿盒中。用吸水纸吸去组织上的PBS，避免直接接触组织样本。
  4. 向每张切片加入200 µL封闭缓冲液（材料表）。将切片保湿盒放入带有恒温控制机制的非加热科学微波炉中。
  5. 通过执行先前建立的程序进行非特异性抗体封闭4：“2-1-2-1-2-1-2-1-2”程序，其中“2”表示在100 W下持续2 min，“1”表示在0 W下持续1 min。上述程序仅执行一次用于封闭。若无此仪器，可按照先前描述的方法，在37 °C下对组织切片（5–10 µm）封闭1小时5。
  6. 在封闭缓冲液孵育期间，配制第一轮一抗染色液（循环1）（材料表）。 根据材料表准备抗体混合物。轻轻混匀抗体混合液，并用小型离心机在2,680 × g下离心30秒。
    注意：该染色液中含有1:5000稀释的Hoechst，足以满足两轮实验的需要。用户可能需要对Hoechst及其他抗体进行滴定，以获得其组织和成像配置下的最佳结果。
  7. 当微波程序完成后，将切片保湿盒从微波炉中取出，并吸去每张组织上的封闭缓冲液。向每张切片加入200 µL第一轮一抗染色液（循环1） （材料表）。将装有切片的保湿盒重新放回微波炉中，运行一抗孵育程序约30分钟：重复执行两次“2-1-2-1-2-1-2-1-2”程序以完成一抗标记。
    注意：此处200 μL的一抗溶液为估算体积，应使用足够量的溶液覆盖整个组织切片表面。
  8. 一抗标记步骤完成后，通过将切片垂直倾斜、用移液器将PBS滴加到组织上并让其自然流下来的方式，用1,000 µL PBS洗涤每张切片。重复此步骤3–5次。
  9. 吸去多余的PBS，并在湿度盒中用1%多聚甲醛（PFA）于室温固定10分钟。
    注意：PFA固定可能遮蔽表位，阻止抗体与其目标结合。首次建立抗体组合时，我们建议通过比较经或未经固定剂处理的组织切片在免疫标记前的染色模式，评估温和固定（1% PFA，10分钟）的影响。若某抗体对1% PFA固定敏感，则应将该抗体标记步骤安排在固定之前。
  10. 用1,000 µL PBS彻底洗涤切片3–5次。洗涤后保持PBS覆盖组织，直至进行光照射步骤。

3. 组织光照射

  1. 用于制备光照射箱（图2），获取一个150 W LED灯、一个40 W RGBW泛光LED灯、一个大型塑料容器（容积20加仑［75.71 L］或更大）、新鲜的1×PBS和一个培养皿。
  2. 将培养皿置于150 W灯光的中心位置，并加入1x PBS至完全浸没载玻片。使用足够的体积以确保载玻片完全浸入PBS中。在冷室中进行光照射处理，以最大限度减少光源产生的热量。
  3. 将载玻片从湿盒中取出，放入培养皿中，确保所有载玻片均浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  4. 将40 W灯直接置于培养皿上方，光源朝向玻片。确保40 W灯设置为 红光设置 在放置之前。
  5. 打开150 W和40 W灯。用塑料容器盖覆盖光照射装置。保持 40 W 灯泡 在 红光设置 用于 2 h，然后切换到 绿光设置 通过附带的遥控器继续操作剩余部分 16 h.
    注意：必须在约 4 °C 以防止载玻片组织发生不必要的热变形。 暂停点：光照射可过夜进行，次日早晨继续后续步骤。

4. 光照处理后的抗体标记

  1. 从培养皿中取出载玻片，将其浸入盛有1× PBS的Coplin染色缸、50 mL锥形管或切片染色系统中的容器内。按照推荐稀释比例配制一抗染色液#2（循环1）（材料表）（表1），每张载玻片使用200 µL染色液。
  2. 用无绒擦拭布吸去每张载玻片上多余的PBS，注意在不接触组织的前提下擦干组织周围的区域。将载玻片放入载片保湿盒中。
  3. 轻轻涡旋混匀一抗染色液#2（循环1），然后向每张载玻片加入200 µL，确保完全覆盖整个组织区域。
  4. 将装有载玻片的载片保湿盒放回微波炉中，运行一抗程序约30分钟，具体操作参见步骤2.7。
  5. 在一抗孵育期间，配制二抗染色液#1（循环1）（材料表）。
  6. 微波程序完成后，取出载片保湿盒，用1,000 µL 1× PBS对每张载玻片清洗3–5次。
  7. 用无绒擦拭布吸去每张载玻片上多余的PBS，涡旋混匀二抗染色液后，向每张载玻片加入200 µL。
  8. 将载片保湿盒放入微波炉中，运行二抗程序：采用“2-1-2-1-2-1-2-1-2”程序，其中“2”表示在100 W下加热2分钟，“1”表示在0 W下静置1分钟。该程序仅执行一次，用于二抗标记。
  9. 用1 mL 1× PBS对载玻片进行充分清洗3–5次，并用无绒擦拭布吸去每张载玻片上多余的PBS。
  10. 向每张载玻片的组织上加入含直接偶联抗体的一抗染色液#3（循环1）。按照步骤2.7所述，使用微波法或替代方法（37 °C孵育1小时）进行抗体染色。
  11. 再次用1 mL 1× PBS清洗载玻片3–5次，并小心吸去每张载玻片上多余的PBS。
  12. 直接向每张组织切片上滴加30 µL封片剂，并加盖盖玻片，确保完全覆盖组织区域。检查载玻片是否存在气泡，并通过轻压将气泡推至载玻片边缘。对剩余载玻片重复此操作。
  13. 用无绒擦拭布去除多余的封片剂，并使用光学镜头清洁剂清除盖玻片表面残留物。所有载玻片在室温下静置10–15分钟，随后在显微镜下进行图像采集。

5. 显微镜设置与图像采集

  1. 打开宽场显微镜和LED8光源；启动软件。选择物镜（此处为20倍/0.8数值孔径的干式物镜）。在配置选项卡中将相机设置为16位模式。根据抗体面板中所含的荧光染料选择所需的成像通道（详见表1以获取进一步指导）。
    注意：以下步骤针对所引用的显微镜进行说明。也可使用具有类似光源、用于多种荧光染料激发和发射的滤光片组以及精密载物台的等效宽场显微镜。
  2. 成像前立即使用镜头清洁剂和镜头纸清洁盖玻片。目视检查盖玻片表面，并在成像前清除任何灰尘或纤维。将玻片牢固地放置在载物台插槽的左上角（或等效位置），以确保组织在XY平面上位置一致（这对于循环图像的对齐至关重要）。
  3. 通过为抗体面板中包含的每种荧光染料创建对应的通道来设置采集参数。为每种荧光染料选择相应的滤光片组和LED。调节每个LED的强度以及每个通道的曝光时间。具体使用的成像参数见表1。
  4. 在开始图像采集前，选择Hoechst通道并开启联动阴影校正（Linked Shading）。使用联动阴影校正向导为所选物镜设置该功能。
    注意：本方案详细描述了如何通过大范围拼接扫描实现全玻片成像。联动阴影校正或阴影校正是克服拼接图像中照明不均所必需的。
  5. 在软件中点击实时（Live）按钮以查看Hoechst通道图像。使用粗调焦旋钮将组织切片调至焦点。
  6. 依次选择每个荧光通道，评估该循环中所有荧光标记抗体在组织切片上的预期染色模式。
  7. 在软件中选择导航器（Navigator）。使用Navigator中的Hoechst通道和螺旋扫描功能，对需要成像的整个组织区域或感兴趣区域进行映射。若单张玻片包含多个组织切片，需重复此步骤，使用Navigator创建完整的组织映射图。
  8. 使用Navigator中的多边形、魔棒或其他感兴趣区域（ROI）选择工具确定需要成像的ROI。仔细绘制组织轮廓，以尽可能减少覆盖目标ROI所需的图像瓦片数量。删除多余的瓦片以缩短总采集时间。
  9. 创建ROI后，复查并调整各通道设置，以最小化饱和像素并优化信噪比。在图像显示窗口中选择热图查找表（heatmap lookup table）。颜色表示像素的填充水平，红色、橙色、黄色和白色显示强度变化较明显；蓝色像素表示已饱和。为避免信息丢失和图像质量下降，应降低曝光时间以尽量减少饱和（蓝色）像素的数量。
  10. 在Navigator中使用焦点图工具（Focus Map tool）创建组织的拓扑焦点图。对于大范围瓦片扫描或不平整样品，每隔3-4个视野（FOV）设置一个焦点图点。
    注意：此步骤对于实现全玻片成像所需的大范围瓦片扫描至关重要。通常，图像质量随所选焦点图点数量的增加而提高；但此过程可能非常耗时，尤其在进行大范围瓦片扫描时。
    1. 按照显微镜扫描顺序创建焦点图点。为匹配所引用显微镜的瓦片扫描路径，请沿蛇形路径设置焦点图点，使其与显微镜的实际扫描路径一致。
    2. 使用手动对焦设置第一个焦点图点，其余点使用自动对焦。需全程观察，确保每个焦点图点均达到最佳对焦状态。根据需要手动调整焦点图点。对于不平整或较大的组织，应增加每个焦点图点的搜索范围。
  11. 使用以下参数设置图像处理：小体积计算清除（SVCC），折射率（RI）设置为与封片介质匹配（此处为1.4）；强度设为98%；对于膜标记物，特征尺寸设为2,000 nm，对于核标记物则设为3,000 nm。在图像采集过程中同步运行计算清除协议。
  12. 开始瓦片扫描。记录瓦片编号，并在整个循环过程中保持ROI不变。
  13. 图像采集完成后，在处理（Process）选项卡中使用马赛克合并（Mosaic Merge）功能合并经过计算清除的图像，并选择平滑（Smooth）选项。目视检查每幅图像是否存在拼接错误，若发现拼接问题，则使用新参数重新执行马赛克合并。
    注意：图像对齐不良将导致无法对迭代采集的图像进行正确配准。
  14. 如有需要，可使用染料分离模块（Dye Separation module）对通道间的光谱溢出进行校正，方法如先前所述5。

6. 染料失活、抗体标记和图像采集的循环

  1. 图像采集完成后，将载玻片浸入盛有无菌1x PBS的50 mL锥形管中，直至盖玻片脱落。若盖玻片未脱落，可将PBS直接冲洗载玻片，或使用镊子轻轻取下盖玻片。
  2. 制备硼氢化锂（LiBH₄）4) 溶液，将 3-5 mg 粉末称取于塑料称量舟中。加入二水2O 以1:1的比例直接加入粉末中（例如，3.2 mg LiBH4 和 3.2 mL 的 diH₂O2O）并用移液器混匀溶液。使用注射器将溶液通过一个 0.2 µm 过滤至50 mL锥形管中，记录溶液的浓度及配制的确切时间。室温孵育3-5分钟，直至溶液中出现大量气泡。
    注意：建议在配制后4小时内使用染料失活溶液。注意：以下步骤需在化学通风橱中进行，并使用适当的个人防护装备（PPE）。该反应可能产生易燃的氢气。操作时应使用少量 LiBH4 (<10 mg）时始终如此。如需进一步指导，请观看有关如何制备 LiBH 的教程视频4 安全地存储在 IBEX 知识库中10,11.
    替换 LiBH4 使用4周后，由于反复接触空气导致漂白效果下降，应丢弃试剂瓶。 我们建议购买小份量的 LiBH4 （1 克）
  3. 将每张载玻片从1x PBS中取出，用无绒布吸去多余的PBS，然后放入载玻片湿盒中。
  4. 对每张未加盖玻片的载玻片用 LiBH 处理4 用移液器将足量溶液直接加到载玻片上，确保覆盖组织，孵育30分钟。移除旧的LiBH4 从每张载玻片上移除溶液，并更换为新的 LiBH 溶液 aliquot4 在10分钟和20分钟时，来自同一LiBH4 储存液
  5. 用 1× PBS 将载玻片彻底清洗 3 至 5 次。每次更换 PBS 时快速置换液体，使载玻片浸泡 1 分钟。
  6. 为进行背景减除成像，按照步骤4.12–4.13所述，在每张载玻片上放置新的盖玻片，并采集染料失活后的组织图像。为背景减除图像创建一个新项目，并重复步骤5.2–5.14以完成图像采集。成像时采用与第一轮图像相同的图块数量、通道、通道设置及视野（FOV）。保持焦点图（Focus Map）点位于相同的视野内，但针对此新图像使用自动对焦功能调整每个焦点图点。
    注意：使用包含重复的定位标记（Hoechst）的通道来识别“实时”图像（例如，背景减除图像）与前一张图像（循环1）中均存在的独特结构（细胞核形态）。
  7. 为尽量减少第二轮抗体循环中生物素化抗体产生的非特异性荧光信号，需进行亲和素和生物素封闭。
    1. 吸去多余的 PBS，每张切片加入亲和素阻断液，室温孵育 15 分钟。
    2. 用1×PBS洗涤切片3至5次，洗涤完成后用吸水纸吸去多余的PBS。
    3. 室温下将生物素阻断液加入每张载玻片，孵育15分钟，然后按照步骤6.7.2的方法用1×PBS洗涤3–5次。
  8. 制备新的不含BSA的封闭缓冲液（循环2）（材料表） 
    一抗染色溶液 #4（循环 2）和二抗染色溶液 #2（循环 2）
    注意：这些溶液不需要牛血清白蛋白，因为 BSA 可能会影响亲和素/生物素封闭步骤。
  9. 在抗体染色溶液#4（循环2）中，按照制造商推荐的浓度稀释一抗。 轻轻涡旋此溶液，并将其加入湿度 chamber 内的每张载玻片上，确保组织完全被一抗溶液覆盖。将装有载玻片的湿盒放入微波炉中，按照步骤 2.7–2.8 中所述运行一抗程序，持续约 30 分钟。
  10. 使用二抗染色溶液#2（循环2）进行二抗标记，具体步骤见4.6-4.9。染色完成后，按照步骤4.12-4.13所述方法，在每张载玻片上放置新的盖玻片。将载玻片重新放回显微镜载物台上，并调整位置，使其处于与先前图像相同的XY平面。
    注意：使用包含重复定位标记（Hoechst）的通道来识别“实时”图像（例如第2轮）与前一轮图像（第1轮）中均存在的独特结构（细胞核形态）。
  11. 为第2轮图像创建一个新项目，并重复步骤5.2–5.14以获取第2轮图像。使用与第1轮图像相同的图块数量、通道、通道设置和视野（FOV）进行成像。保持焦点图（Focus Map）点位于相同的视野内，但使用自动对焦功能为该新图像调整每个焦点图点。获取第2轮图像后，继续进行图像对齐，或重复第6节中的步骤以使用直接偶联抗体进行更多轮次的成像。注意：使用包含重复定位标记（Hoechst）的通道来识别“实时”图像（例如第2轮图像）与前一轮图像（如第1轮图像）中均存在的独特结构（如细胞核形态）。由于IBEX方法无法去除抗体，因此额外的成像轮次需要使用直接偶联抗体。

7. 图像配准

  1. 将显微镜输出的原始图像.lif文件使用免费的文件转换器转换为.ims文件，并按照先前所述方法利用开源软件进行图像处理5 并在IBEX知识库的视频中进行了详细说明10,11.
  2. 每个成像周期中，编辑文件并应用任何所需的处理步骤（例如，通道命名、通道伪彩着色）。
    1. 使用为 SimpleITK 创建的通道算术函数进行背景扣除和通道阈值设定，以降低自发荧光信号 (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html)
      注意：我们在将各图像（例如，循环1、循环2）对齐为一幅复合图像之前，先对每幅图像执行这些步骤。这是因为处理较小的单个图像比处理较大的合并图像更为方便。
  3. 制定一致的命名策略以使用配准软件。使用“前缀-分隔符-后缀”格式（例如“Cycle1 CD8_AF647”）对通道进行命名，以空格作为分隔符，表示在第一轮中使用抗CD8 AF647抗体的通道。
    注：详见帮助文件扩展以获取更多信息： https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html
  4. 在所有通道均被正确命名后，启动配准软件，点击 Imaris 扩展 | SimpleITK | 仿射变换.
  5. 使用每个循环的.ims文件进行上传 浏览 文件名旁边的按钮。输入 通道名称前缀分隔符字符. 如果按照上述示例操作，请输入一个空格，然后单击 下一步.
  6. 选择 成像对齐通道 用作各循环间共同的基准标记（例如 Hoechst）。
  7. 选择 固定图像，用于对齐其他图像的参考图像。
    注意：我们建议注册迭代图像的第2个循环。
  8. 选择“输出文件”的目标目录。 开始在分辨率下进行配准 该选项默认将设置为最高分辨率，以实现尽可能最佳的图像配准。若计算能力有限，可降低此参数。
    注意：对于此处描述的数据（每幅图像 12-15 GB），我们采用了最高 5 的分辨率。
  9. 点击 注册 开始。注册完成后，等待 重采样并保存合并图像 按钮出现后，单击该按钮，并等待进度条完成。
  10. 在处理软件中打开已完成的输出文件。包含所有循环和通道信息的配准图像将可供分析或发表使用。

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结果

设计基于多重抗体的成像面板需要耗费大量时间、精力和资源12。当针对本研究中所述的高自发荧光组织的存档FFPE样本设计面板时，这些挑战尤为突出（图1）。为克服这些挑战，我们首先筛选出与我们的染料失活方案兼容的最亮荧光染料（表1）。例如，据报告，Alexa Fluor Plus二抗在免疫荧光检测中的信噪比比其Alexa Fluor对应物高出4倍（来源：AF Plus产品数据表）。其次，我们将高亮度荧光染料与低表达标记物配对，并在可能的情况下，通过一抗与二抗或链霉亲和素-生物素系统进行间接免疫标记以增强信号（表1）。第三，自发荧光在光照射后会降低（图3A），且在较长波长下成像时也会减弱（图3B）。基于此，我们将直接偶联抗体用于检测高表达的结构标记物——α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和广谱细胞角蛋白（PanCK），并将其置于近红外通道（750 nm）；...

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讨论

肺结核的临床肺部病理特征为坏死性肉芽肿性炎症。非结核分枝杆菌（NTM）肺部病理主要发生在两类不同的患者群体中，并呈现两种独立的病理模式：在免疫功能正常的个体中，表现为以肉芽肿性炎症、细支气管闭塞和空洞形成为特征的孤立性肺损伤；在免疫功能低下个体中，则表现为累及肺部及其他器官的弥漫性结节性疾病13,14,15,16。在比较这三种不同类型的分枝杆菌肺部病理时，目前对局部炎症中免疫细胞组成的异同、细胞间相互作用的空间背景，以及损伤部位促炎性与调节性细胞因子产生的特征仍知之甚少。我们对罕见的人类历史存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肺组织尸检及手术切除样本应用了IBEX技术，该技术使我们能够在组织空间内对多种肺部病理形式进行表征5。

将IBEX方案应用于这些人类肺组织切片时遇到了诸多挑战...

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披露

A.J.R. 就职于 Leica Microsystems, Inc. 其他作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由美国国家过敏与传染病研究所（DIR/NIAID）、国家癌症研究所（NCI）和国家心肺血液研究所（NHLBI）的院内研究计划资助。图1 使用 BioRender 软件在 NIH 机构许可协议下制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787封闭缓冲液配制溶液
1% BSASigma-AldrichA4503封闭缓冲液配制溶液
1% Human BD Fc BlockBD Biosciences564220封闭缓冲液所需 Fc 封闭剂
150 W LED lampAmazonB07VH3CVSF组织光辐照用 LED 光源
1x PBS Gibco10010-023封闭缓冲液及洗涤步骤用溶液
20 Gallon Storage ContainerAmazonB001B1C4G0光辐照过程用容器
40 W RGBW flood LED lamp AmazonB08QFPJSMD组织光辐照用 RGB 光源
Ag85BAbcamab43019/NAIBEX 成像抗体。见表1。
Alpha-smooth muscle actin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAIBEX 成像抗体。见表1。
Avidin/Biotin Blocking KitAbcamab64212亲和素与生物素封闭溶液
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714固定溶液
BOND Dewax SolutionLeica BiosystemsNC0221076脱蜡溶液
BOND Epitope Retrieval Solution 1Leica BiosystemsNC0235529柠檬酸盐缓冲液（pH 6）抗原修复溶液（ER1）
BOND Epitope Retrieval Solution 2Leica BiosystemsNC0235530EDTA 缓冲液（pH 9）抗原修复溶液（ER2）
BOND Research Detection SystemLeica BiosystemsNC0396648自动化科研染色试剂
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNA自动化科研染色平台
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077洗涤缓冲液
CD15BD Biosciences347420/AB_400298IBEX 成像抗体。见表1。
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959IBEX 成像抗体。见表1。
CD4 Alexa Fluor 488R&D SystemsFAB8165G/AB_2728839IBEX 成像抗体。见表1。
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAIBEX 成像抗体。见表1。
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745IBEX 成像抗体。见表1。
Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838IBEX 成像抗体。见表1。
Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830IBEX 成像抗体。见表1。
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844IBEX 成像抗体。见表1。
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834IBEX 成像抗体。见表1。
EasyDip Staining SystemNewcomer Supply5300KIT玻片染色系统
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02封片介质
HoechstBiotium40046IBEX 成像用核染色剂。见表1。
Imaris File Converter x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments免费文件转换软件
ImarisViewer software x64 10.2.0Imaris Oxford Instruments免费图像处理软件
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000疏水屏障笔
Lithium Borohydride (1 gram)STREM Chemicals93-0397染料失活用化学品，建议购买小份量（1 克）
Lumican BiotinR&D SystemsBAF2846IBEX 成像抗体。见表1。
Micro Cover GlassesVWR48393-241盖玻片
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX 成像抗体。见表1。
PELCO BioWave Pro Microwave SystemTed Pella Inc36500-230非加热型科研微波系统
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062科研微波系统全自动温控装置
SimpleITKOpen source software图像配准与通道处理软件
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227IBEX 成像标记试剂。见表1。
Widefield MicroscopeLeica MicrosystemsNALeica Microsystems THUNDER 成像系统，配备 LED8 光源及 LAS X 软件（3.7.1.21655）。荧光成像时使用定制四通道滤光片及外置滤光轮（PN: 11536075），并加装两个单通道滤光片（PN: 8118215），实现每轮成像采集七个染料通道。滤光片激发、二向色镜及发射波长如下：（1）四通道滤光立方体：二向色镜波长为 391/32、479/33、554/24、638/31，无激发或发射滤光片；（2）外置滤光轮位置1：434/32，位置2：520/40，位置3：585/20，位置4：720/60，位置5：透射；（3）单通道1—激发585/22，二向色镜594，发射625/30；（4）单通道2—激发635/20，二向色镜647，发射667/30。
Zeiss Optical Lens CleanerAmazonB00GPVQVCO显微镜物镜清洁剂
抗体
Ag85BAbcamab43019多克隆兔IgG，第1轮
Alpha-smooth muscle actin DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1，第1轮
CD4 Alexa Fluor 488R&D SystemsFAB8165G多克隆山羊IgG，第1轮
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B，第1轮
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1，第1轮
Donkey anti-goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814多克隆驴IgG，第1轮
Donkey anti-mouse IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787多克隆驴IgG，第1轮
Donkey anti-rabbit IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794多克隆驴IgG，第1轮
HoechstBiotium40046核标记，第1轮
CD15BD Biosciences347420MMA，第2轮
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26，第2轮
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26，第2轮
Donkey anti-mouse IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020多克隆驴IgG，第2轮
Lumican BiotinR&D SystemsBAF2846多克隆山羊IgG，第2轮
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3，第2轮
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N/A，第2轮
HoechstBiotium40046第2轮
溶液
封闭缓冲液（第1轮）
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787体积比0.3%
BSASigma-AldrichA4503体积比1%
Human BD Fc BlockBD Biosciences564220体积比1%
1x PBS Gibco10010-023体积比97.7%
一抗染色溶液 #1（第1轮）
封闭缓冲液（第1轮）见上文加入抗体后补足体积
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
一抗染色溶液 #2（第1轮）
封闭缓冲液（第1轮）见上文加入抗体后补足体积
CD4 AF488R&D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
二抗染色溶液 #1（第1轮）
封闭缓冲液（第1轮）见上文加入抗体后补足体积
Donkey Anti-Goat AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
Donkey anti-Rabbit AF Plus 555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_27628341:100
Donkey anti-Mouse AF Plus 647Thermo Fisher ScientificA32787/AB_27628301:50
一抗染色溶液 #3（第1轮）
封闭缓冲液（第1轮）见上文加入抗体后补足体积
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
无BSA封闭缓冲液（第2轮） 
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787体积比0.3%
Human BD Fc BlockBD Biosciences564220体积比1%
1x PBS Gibco10010-023体积比98.7%
一抗染色溶液 #4（第2轮）
无BSA封闭缓冲液（第2轮）见上文加入抗体后补足体积
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR&D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
二抗染色溶液 #2（第2轮）
无BSA封闭缓冲液（第2轮）见上文加入抗体后补足体积
Donkey anti-Mouse IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200

参考文献

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