迭代漂白的优化工作流程扩展了高度自发荧光临床样品的多重成像

Summary

使用手动 IBEX 方法实施低成本、多功能的光照射技术，可以对具有显着天然自发荧光的人体组织进行最佳成像。该协议详细介绍了如何使用倒置显微镜、广泛可用的试剂以及用于图像对齐和处理的开源软件从存档的临床样本中获得多路复用的全玻片图像。

Abstract

非结核分枝杆菌 （NTM） 引起的肺部疾病患病率在全球范围内一直在增加。尽管 NTM 诱导的肺部疾病通常表现为支气管扩张、肺结节和空洞疾病，但与这些不同的肺损伤模式相关的宿主反应尚未在 原位得到很好的表征。我们试图通过对 NTM 疾病个体肺组织中的免疫细胞群进行深入表型分析来评估 NTM 诱导病理的机制，并与肉芽肿性炎症、结核性 （TB） 肺病的金标准进行比较。

来自播散性 NTM、肺 NTM 或肺结核疾病患者的福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 肺阻滞在迭代漂白扩展多密度 （IBEX） 成像方法的修改版本后进行切片和染色。首先需要优化 IBEX 方法来解决肺切片的显着内源性荧光，这是由于肺组织原生的胶原蛋白、弹性蛋白和红细胞的高密度，而 FFPE 保存和 FFPE 块的年龄会加剧这种情况。在该协议中，我们详细介绍了一种光照射协议和改进的抗原修复方法，该方法可减少临床存档样本的自发荧光。

此外，我们还提供了抗体组合设计的指导，包括交叉反应性、光照射后表位丢失、相邻荧光团之间的光谱重叠以及某些靶标的低信噪比等常见挑战。为了促进整个肺组织切片的高效成像，使用宽场显微镜对载玻片进行成像，并使用开源软件进行后处理以提高图像质量。总之，该工作流程通过记录如何使用广泛可用的仪器和试剂从具有挑战性的样品中获得高度多路复用、高分辨率的全玻片图像，解决了关键需求。除了临床样品的定量成像外，这些技术还可以应用于不同的样品类型，以克服内源性和外源性的荧光源。

Introduction

结核病 （TB） 是导致结核病的主要死因之一，每年约有 130 万人死于结核病感染¹。虽然不如结核病致命，但近年来非结核分枝杆菌 （NTM） 引起的肺部感染和后续疾病显着增加²。在组织水平上，宿主对肺结 核分枝杆菌 （Mtb） 感染的免疫反应已得到充分研究，包括肉芽肿、淋巴细胞异质聚集体、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的形成³。虽然肉芽肿性炎症也是宿主对 NTM 感染免疫的基本特征，但免疫细胞群和这种反应的空间特征仍未得到充分研究。详细了解免疫病理学与伤口愈合的组织成分对于开发治疗（例如，宿主定向疗法）和预防性（即疫苗）治疗策略至关重要。

在这项研究中，我们的团队获得了在 Mtb 或 NTM 感染患者的肺切除术或尸检期间获得的罕见、存档的临床样本。这些样本中的大多数超过 10 年，并以福尔马林固定、石蜡包埋 （FFPE） 样本的形式保存，使其仅限于组织学检测。为了克服传统免疫组织化学 （IHC） 和免疫荧光 （IF） 成像的标志物限制，我们利用了迭代漂白扩展多特性 （IBEX） 方法，这是一种开源、高度多路复用的成像方法 ^4,5。由....

Protocol

在美国国立卫生研究院临床中心病理学实验室，根据方案 09-H-0172 （NCT00943514），支气管扩张症的自然史收集存档的尸检和手术切除肺组织切片。该方案已获得 IRB 批准，参与者提供了知情同意。

1. 自动抗原修复

注意：使用自动研究染色平台进行脱蜡和抗原修复（图 1）。以前的工作确定，双抗原修复方法包括使用基于柠檬酸盐的 pH 6 表位修复溶液 （ER1） 30 分钟，然后使用基于 EDTA 的 pH 9 表位修复溶液 （ER2） 30 分钟，为 FFPE 组织产生最佳免疫标记结果⁹。使用 IBEX 成像社区提供的其他描述方法和支持使用手动脱蜡和双抗原修复可以获得可比的结果^10,11。

1. 收集载玻片和自动抗原修复备件（载玻片盖、研究检测系统、基于柠檬酸盐的 pH 6 表位修复溶液 （ER1）、基于 EDTA 的 pH 9 表位修复溶液 （ER2） 等）。
2. 打开仪器，让它初始化 20 分钟，将研究检测臂放入仪器中，然后将试剂容器插入机器底部。
3. 打开软件....

Results

设计基于多重抗体的成像组合需要大量的时间、精力和资源¹²。如此处所述，在为来自高度自发荧光组织的存档 FFPE 样品设计面板时，这些挑战尤为明显（图 1）。为了克服这些挑战，我们首先确定了与我们的染料灭活方案兼容的最亮荧光团（表 1）。例如，据报道，Alexa Fluor Plus 二抗在免疫荧光检测中的信噪比是 Alexa Fluor 二抗的 4 倍（来源：AF Plus 产品数据表）。其次，我们将明亮的荧光团与低表达的标记物配对，并尽可能使用一抗和二抗或链霉亲和素-生物素的间接免疫标记来放大信号（表 1）。第三，光照射后（图 3A）和在较长波长下成像时（图 3B）自发荧光减弱。因此，我们将靶向高表达结构标志物 α 平滑肌肌动蛋白 （α-SMA） 和泛细胞角蛋白 （PanCK） 的直接偶联抗体放置在近红外通道 （750 nm） 中，并采用信号放.......

Discussion

肺结核的临床肺部病理学特征是坏死性肉芽肿性炎症。NTM 肺部病理学主要发生在两个不同的患者群体中，具有两种不同的病理模式：免疫功能正常的个体以肉芽肿性炎症为特征的孤立性肺损伤伴细支气管闭塞和空腔形成，或免疫缺陷个体影响肺部和其他器官的弥漫性结节性疾病 13,14,15,16.在比较这三种不同形式的分枝杆菌肺病理学时，对于局部炎症的免疫细胞组成、细胞间相互作用的空间背景以及损伤部位突出的炎症细胞因子与调节细胞因子产生的差异或相似性知之甚少。我们在罕见的历史人福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 尸检和手术切除肺组织块上采用了 IBEX 技术。这项技术使我们能够在组织内空间上表征各种形式的肺部病理学⁵。

使 IBEX 方.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% 海卫一-X-100	西格玛-奥尔德里奇	T8787型	封闭缓冲液溶液
1% BSA	西格玛-奥尔德里奇	A4503	封闭缓冲液溶液
1% 人 BD Fc 块	BD生物科学	564220	封闭缓冲液所需的 Fc 块
150 W LED 灯	亚马逊河	B07VH3CVSF	用于组织光照射的 LED 光源
1x PBS	吉布科	10010-023	用于封闭缓冲液和洗涤步骤的溶液
20 加仑储存容器	亚马逊河	B001B1C4G0	光照射过程容器
40 W RGBW 泛光 LED 灯	亚马逊河	B08QFPJSMD	用于组织光照射的 RGB 光源
Ag85B	阿布卡姆	ab43019/NA	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
α-平滑肌肌动蛋白 DyLight 755	诺武斯生物制品	NBP2-345221R/NA	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
亲和素/生物素封闭试剂盒	阿布卡姆	AB64212	亲和素和生物素阻断溶液
BD Cytofix/Cytoperm	BD生物科学	554714	固定解决方案
BOND 脱蜡液	徕卡生物系统	NC0221076	脱蜡溶液
BOND 表位修复解决方案 1	徕卡生物系统	NC0235529	柠檬酸盐基 pH 6 表位修复溶液 （ER1）
BOND 表位修复解决方案 2	徕卡生物系统	NC0235530	基于EDTA的pH 9表位修复溶液（ER2）
BOND研究检测系统	徕卡生物系统	NC0396648	自动化研究染色试剂
BOND RX 研究染色剂	徕卡生物系统	那	自动化研究染色平台
BOND 清洗液	徕卡生物系统	NC0221077	洗涤缓冲液
CD15	BD生物科学	347420/AB_400298	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
CD20 eFluor 660 （电子福光 660）	赛默飞世尔科技	50-0202-82/AB_11150959	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
CD4 Alexa Fluor 488	R&D 系统	FAB8165G/AB_2728839	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
CD45 藻红蛋白 （PE）	诺武斯生物制品	NBP2-34528聚乙烯/NA	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
CD68 iFluor 594	卡普里科生物技术	1064135/AB_2892745	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
驴防山羊 IgG Alexa Fluor Plus 488	赛默飞世尔科技	A32814/AB_2762838	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
驴抗小鼠 IgG Alexa Fluor Plus AF647	赛默飞世尔科技	A32787/ AB_2762830	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
驴抗小鼠 IgM Alexa Fluor 488	杰克逊免疫研究	715-545-020/AB_2340844	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
驴防兔 IgG Alexa Fluor Plus AF555	赛默飞世尔科技	A32794/AB_2762834	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
EasyDip 染色系统	新人供应	5300套件	载玻片染色系统
荧光套料-G	赛默飞世尔科技	00-4958-02	封片介质
霍克斯特	生物群	40046	用于 IBEX 成像的核染色剂。见表 1。
Imaris 文件转换器 x64 10.2.0	伊马里斯牛津仪器		免费文件转换器
ImarisViewer 软件 x64 10.2.0	伊马里斯牛津仪器		免费图像处理软件
ImmEdge 笔	载体实验室	H-4000型	疏水阻隔笔
硼氢化锂（1 克）	STREM 化学品	93-0397	用于染料灭活的化学品，购买这种化学品的小等分试样（1克）
Lumican 生物素	R&D 系统	BAF2846	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
微盖眼镜	大众	48393-241	载玻片盖板
泛细胞角蛋白 Alexa Fluor 750	诺武斯生物制品	NBP2-33200AF750/AB_2868569	用于 IBEX 成像的抗体。见表 1。
PELCO BioWave Pro 微波系统	泰德·佩拉公司	36500-230	不加热科学微波
PELCO 稳定温度专业版	泰德·佩拉公司	50062	科学微波的全自动温度控制
简单ITK	开源软件		注册和通道处理软件
链霉亲和素 Alexa Fluor 594	赛默飞世尔科技	S11227	用于IBEX成像的标记试剂。见表 1。
宽视场显微镜	徕卡显微系统	那	带有 LED8 光源和 LAS X 软件的 Leica Microsystems THUNDER 成像仪 （3.7.1.21655）。对于荧光成像，使用带有外部滤光片轮（PN：11536075）的定制四波段滤光片和两个额外的单波段滤光片（PN：8118215）对每次通过的七个染料通道进行成像。滤波器激发线、二向色线和发射线为（1）四波段立方体：391/32、479/33、554/24、638/31处为二向色，无激发或发射滤光片;（2）外置滤轮位置1：434/32，位置2：520/40，位置3：585/20，位置4：720/60，位置5：直通;（3）单频段1—585/22激发，594二向色，625/30发射;（4）单频段2—635/20 激发，647 二向色，667/30 发射。
蔡司光学镜片清洁剂	亚马逊河	B00GPVQVCO	显微镜物镜清洗机
抗体
Ag85B	阿布卡姆	AB43019	多克隆兔 IgG，周期 1
α-平滑肌肌动蛋白 DyLight 755	诺武斯生物制品	NBP2-345221R	1A4/asm-1，循环 1
CD4 Alexa Fluor 488	R&D 系统	FAB8165G	多克隆山羊 IgG，周期 1
CD8 Alexa Fluor 647	生物传奇	372906	C8/144B，循环 1
CD68 iFluor 594	卡普里科生物技术	1064135	KP1，周期 1
驴防山羊 IgG Alexa Fluor Plus 488	赛默飞世尔科技	A32814	多克隆驴，周期 1
驴抗小鼠 IgG Alexa Fluor Plus AF647	赛默飞世尔科技	A32787	多克隆驴，周期 1
驴防兔 IgG Alexa Fluor Plus AF555	赛默飞世尔科技	A32794	多克隆驴，周期 1
霍克斯特	生物群	40046	核标签，周期 1
CD15	BD生物科学	347420	MMA，第 2 周期
CD20 eFluor 660 （电子福光 660）	赛默飞世尔科技	50-0202-82	L26，周期 2
CD45 藻红蛋白 （PE）	诺武斯生物制品	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26，循环 2
驴抗小鼠 IgM Alexa Fluor 488	杰克逊免疫研究	715-545-020	多克隆驴，周期 2
Lumican 生物素	R&D 系统	BAF2846	多克隆山羊 IgG，第 2 周期
泛细胞角蛋白 Alexa Fluor 750	诺武斯生物制品	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3，循环 2
链霉亲和素 Alexa Fluor 594	赛默飞世尔科技	S11227	不适用，周期 2
霍克斯特	生物群	40046	第 2 周期
解决方案
封闭缓冲液（第 1 周期）
海卫一-X-100	西格玛-奥尔德里奇	T8787型	0.3%（按体积计）
BSA的	西格玛-奥尔德里奇	A4503	1%（按体积计）
人BD Fc阻滞	BD生物科学	564220	1%（按体积计）
1x PBS	吉布科	10010-023	97.7%（按体积计）
<强>一抗染色液 #1（第 1 周期）
封闭缓冲液（循环 1）	见上文		添加抗体后加满体积
霍克斯特	生物群	40046	1:5000
CD8 AF647	生物传奇	372906	1:10
<强>一抗染色液 #2（第 1 周期）
封闭缓冲液（循环 1）	见上文		添加抗体后加满体积
CD4 AF488型	R&D 系统	FAB8165G	1:10
Ag85B	阿布卡姆	ab43019/NA	1:100
<强>二抗染色液 #1（第 1 周期）
封闭缓冲液（循环 1）	见上文		添加抗体后加满体积
驴防山羊 AF Plus 488	赛默飞世尔科技	A32814/AB_2762838	1:100
驴防兔AF Plus 555	赛默飞世尔科技	A32794/AB_2762834	1:100
驴防鼠 AF Plus 647	赛默飞世尔科技	A32787/AB_2762830	1:50
<强>一抗染色液 #3（第 1 周期）
封闭缓冲液（循环 1）	见上文		添加抗体后加满体积
CD68 iF594	卡普里科生物技术	1064135	1:10
a-SMA DL755	诺武斯生物制品	NBP2-345221R/NA	1:30
不含BSA的封闭缓冲液（第2周期）
海卫一-X-100	西格玛-奥尔德里奇	T8787型	0.3%（按体积计）
人BD Fc阻滞	BD生物科学	564220	1%（按体积计）
1x PBS	吉布科	10010-023	98.7%（按体积计）
<强>一抗染色液 #4（第 2 周期）
不含 BSA 的封闭缓冲液（第 2 周期）	见上文		添加抗体后加满体积
CD15	BD生物科学	347420	1:30
Lumican 生物素	R&D 系统	BAF2846	1:100
CD45 聚乙烯	诺武斯生物制品	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660 （电子福光 660）	赛默飞世尔科技	50-0202-82	1:10
泛细胞角蛋白 AF750	诺武斯生物制品	NBP2-33200AF750	1:10
<强>二抗染色液 #2（第 2 周期）
不含 BSA 的封闭缓冲液（第 2 周期）	见上文		添加抗体后加满体积
驴抗小鼠 IgM AF488	杰克逊免疫研究	715-545-020/AB_2340844	1:100
链帕亲和素 AF594	赛默飞世尔科技	S11227	1:200