研究文章

Ménière病小鼠模型的建立

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DOI：

10.3791/67981

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2025年6月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Yale School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, University of Cincinnati, 3Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

本研究表明，MT-TGFα 小鼠胃中出现表达痉挛性多肽的肠上皮化生（SPEM）。由于启动子存在渗漏性，无法证实主细胞谱系可追踪至 SPEM。因此，我们进一步构建了可诱导型多西环素小鼠模型（Doxi-TGFα），并证实 SPEM 源自主细胞。

摘要

Menetrier病（MD）是一种罕见的获得性胃部癌前病变，其特征为巨大皱襞、胃酸分泌减少及蛋白质丢失。MD患者胃组织中表皮生长因子受体（EGFR）配体转化生长因子-α（TGFα）的表达升高。使用EGFR中和抗体西妥昔单抗（cetuximab）可使患者迅速获得临床改善并实现组织学缓解。然而，除上述发现外，MD的病因及潜在分子机制仍不明确。金属硫蛋白（MT）-TGFα转基因小鼠是首个可重现MD组织病理学特征的小鼠模型，包括腺窝上皮增生和壁细胞丢失。在该模型中，TGFα的表达由重金属诱导型MT增强子/启动子驱动。既往研究采用在饮水中添加硫酸锌（ZnSO4）或腹腔注射硫酸镉（CdSO4）的方式诱导TGFα表达。然而，我们发现MT-TGFα小鼠在未接受重金属处理的情况下仍可出现表型，提示该启动子存在渗漏表达。此外，我们发现TGFα过表达会抑制Mist1的表达——Mist1是一种对主细胞分化至关重要的转录因子，因而阻碍了利用Mist1-CreERT2小鼠品系对主细胞进行遗传操作。为克服这一问题，我们构建了一种可诱导型小鼠模型（Doxi-TGFα），通过给予多西环素诱导TGFα表达（CMV-rtTA; TetO-TGFα）。尽管Doxi-TGFα小鼠模型的表型较MT-TGFα模型更轻，但仍能重现MD的关键特征，包括腺窝上皮增生和壁细胞丢失。利用Doxi-TGFα小鼠模型，我们发现MD中可诱导出现表达解痉多肽的化生（SPEM），并通过Mist1-CreERT2小鼠品系进行谱系示踪证实SPEM来源于主细胞。MT-TGFα和Doxi-TGFα两种小鼠模型均提供 体内 MD 的模型，可用于研究 MD 发病机制的分子基础及该疾病的治疗方案。Doxi-TGFα 小鼠还将成为研究 TGFα 在其他组织中过表达效应的有用模型。

引言

Menetrier病（MD），又称蛋白丢失性肥厚性胃病，是一种罕见的胃部癌前病变。MD患者的胃部表现出显著的胃小凹上皮增生，导致胃黏液分泌增加，同时壁细胞数量减少，引起胃酸分泌降低。此外，蛋白质选择性地通过胃黏膜丢失，导致低白蛋白血症和外周水肿1,2,3。MD的发病机制长期不明，直到研究发现，在金属硫蛋白（MT）基因增强子/启动子控制下过表达TGFα的转基因小鼠，其胃部可重现MD的表型4,5。MD患者胃组织中也检测到TGFα表达升高，TGFα是表皮生长因子受体（EGFR）的配体。已有报道显示，抗EGFR抗体西妥昔单抗（cetuximab）是首个对MD有效的药物治疗，这一发现证实TGFα过表达导致的EGFR激活在MD发病机制中起重要作用6,7。

此后，MT-TGFα 小鼠品系被用作 MD 的小鼠模型。由于 TGFα 的表达受重金属反应基因——金属硫蛋白增强子/启动子的调控，因此可通过在饮水中添加硫酸锌（ZnSO4）或腹腔注射硫酸镉（CdSO4）来诱导 TGFα 的表达5,8。该 MT-TGFα 小鼠模型已进一步被用于表征 MD 的表型特征。利用此模型已证实，TGFα 可诱导黏液分泌型表面颈黏液细胞的分化，同时抑制分化为盐酸分泌型壁细胞和胃蛋白酶原分泌型主细胞谱系9,10。此外，研究还发现胃体/胃底黏膜出现幽门化改变，且胃腺底部存在表达三叶因子 2（TFF2）的细胞，提示在 MD 中发生了表达解痉多肽的化生（SPEM）8,11。

在本研究中，我们发现MT-TGFα小鼠无需重金属处理即可表现出木村病（MD）的特征。这些表型包括Mist1表达的丧失，Mist1是一种对主细胞分化至关重要的转录因子，在幽门化生（SPEM）中会丢失。由于Mist1的缺失，无法将Mist1-CreERT212小鼠品系与MT-TGFα小鼠品系联合使用，通过谱系示踪来检测MD中的SPEM是否起源于主细胞。为了克服MT-TGFα小鼠模型的渗漏性问题，我们开发了一种新的MD小鼠模型（CMV-rtTA13; TetO-TGFα14），该模型通过多西环素处理诱导TGFα表达（Doxi-TGFα）。我们证实该小鼠模型同样表现出MD的特征。利用Doxi-TGFα小鼠模型，我们通过使用Mist1-CreERT2小鼠品系进行谱系示踪，证明SPEM起源于主细胞。本研究介绍了两种MD小鼠模型。这两种模型均可用于研究疾病发病机制以及寻找潜在的治疗靶点。当需要精确控制MD表型的起始时间，或需要利用Mist1-CreERT2小鼠品系对主细胞进行遗传修饰时，新的Doxi-TGFα小鼠模型将尤为有价值。

方案

所有动物饲养和操作程序均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国政府关于研究、教学和测试中使用动物的护理与利用原则。

1. 小鼠实验

  1. 小鼠处理
    1. 将2-4月龄的MT-TGFα小鼠（雄性和雌性均可）用含有25 mM ZnSO4 的饮用水处理2周，以诱导TGFα过表达。
    2. 将2-4月龄的CMV-rtTA/+; TetO-TGFα/+（Doxi-TGFα）小鼠（雄性和雌性均可）用含有2 mg/mL多西环素的饮用水处理2周，以诱导TGFα过表达。
    3. 在繁殖笼中放入一只Mist1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+的雄性或雌性小鼠，并加入一只性别的Doxi-TGFα小鼠，用于MD小鼠模型中主细胞的谱系示踪。
    4. 对2-4月龄的Mist1-CreERT2/+; R26-LSL-mTmG/+; CMV-rtTA/+; TetO-TGFα/+小鼠（雄性和雌性均可）进行腹腔注射他莫昔芬（37.5 mg/kg），连续注射7天，交替注射于腹部右下象限和左下象限，避免刺伤内脏器官。同时在饮水中添加多西环素（2 mg/mL）处理2周以诱导TGFα表达。
      注意：需确认他莫昔芬未引起胃部损伤15,16，本实验通过计数经或未经他莫昔芬处理的野生型小鼠中的壁细胞来验证（补充图1）。
  2. 胃组织固定
    1. 在TGFα过表达2周后，通过异氟烷过量麻醉处死小鼠。在化学通风橱内使用干燥器罐，将小鼠置于穿孔平台上，防止其直接接触液态麻醉剂。盖上盖子并观察小鼠，直至其呼吸停止超过60秒，随后进行颈椎脱位。
    2. 使用剪刀和镊子在胃食管交界处剪断，剪除十二指肠（保留约5 mm十二指肠与胃相连），并去除胃周围所有腹膜韧带（图1A）。
    3. 使用连接移液枪头的10 mL注射器从十二指肠端灌注磷酸盐缓冲液（PBS），用手轻轻挤压以清除管腔内容物，重复3次（图1B）。
    4. 使用另一支连接移液枪头的10 mL注射器向胃内注入2 mL 10%福尔马林溶液进行膨胀固定。在胃十二指肠交界处用镊子夹紧5-10秒，同时将枪头从胃中取出（图1C）。
    5. 将膨胀后的胃组织置于盛有10%福尔马林的容器中，在4 °C条件下振荡过夜（图1D）。
      注意：操作福尔马林等有毒物质时应佩戴适当的个人防护装备。
  3. 胃组织石蜡包埋前处理
    1. 使用剃刀片切除十二指肠和前胃部分（图1E）。将胃组织用PBS振荡清洗5分钟，重复3次。
    2. 使用剃刀片将胃切成3-4个厚度均匀的环状组织（3-5 mm）。将胃环包埋于2%琼脂糖中以保持方向一致性。将胃环按从近端到远端的顺序依次排列，确保小弯侧朝向一致（图1F）。
    3. 将包埋在琼脂糖中的胃环放入组织包埋盒中（图1G），送至组织学核心实验室进行石蜡包埋17。

2. 免疫荧光染色

  1. 载玻片制备
    1. 将带有石蜡切片的载玻片置于干燥烘箱或设定为 60 °C 的加热板上，加热至少 1 小时至过夜。冷却至室温后，放入载玻片架中。
  2. 脱蜡、水化与抗原修复
    1. 标记两个载玻片染色缸，分别为 A 和 B，并在每个缸中加入足量的 Trilogy 溶液，确保组织完全浸没。
    2. 将载玻片架放入 A 缸中，然后将两个缸一同放入压力锅中。将压力锅设置为高压状态，持续 15 分钟。待压力锅自然冷却后再打开并取出载玻片。
    3. 立即将载玻片架从 A 缸转移至 B 缸中，浸泡 2 分钟，以确保完全去除载玻片上的石蜡。从 B 缸中取出载玻片，放入去离子水（DI 水）中。
      注意：A 缸可使用已用过一次的 Trilogy 溶液，B 缸必须始终使用新的 Trilogy 溶液。
    4. 将载玻片置于 Tris 缓冲盐水（TBS）中 5 分钟，随后进行封闭步骤。
  3. 封闭非特异性背景染色
    1. 从载玻片架上取下载玻片，轻轻横向轻敲以去除多余的 TBS 液体。
    2. 使用疏水性标记笔在组织周围画出一个封闭区域。加入封闭缓冲液，完全覆盖组织，并在湿盒中室温孵育 30–60 分钟。
  4. 一抗孵育
    1. 选择针对不同宿主物种产生的目标蛋白的一抗，根据生产商推荐的方法用抗体稀释液进行稀释。本研究中使用的抗体包括：H+/K+-ATPase、GIF、Mist118,19 和 CD44v920,21。有关一抗的详细信息见材料表。
    2. 去除封闭缓冲液，加入稀释后的一抗，将载玻片放回湿盒中。4 °C 过夜孵育。
    3. 去除一抗，用 TBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。
  5. 二抗与凝集素
    1. 根据一抗的宿主物种选择相应的二抗。凝集素可与二抗混合，并同时加入。
    2. 根据生产商推荐的方法，用抗体稀释液稀释二抗和凝集素。本研究中所用二抗与凝集素的详细信息见材料表。
    3. 加入二抗、凝集素和 DAPI（1 µg/mL），并将载玻片放回湿盒中。室温避光孵育 1 小时。
    4. 从湿盒中取出载玻片，用 TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  6. 封片与显微镜观察前处理
    1. 从 TBS 中取出一张载玻片，用纸巾横向轻敲载玻片边缘，去除多余液体。
    2. 加入 15–20 µL 封片介质。用手捏住干净盖玻片的边缘，将其一侧对准组织，并使封片介质位于盖玻片与载玻片之间。
    3. 缓慢放下盖玻片，使介质均匀覆盖组织，注意避免产生气泡。
    4. 用擦拭纸吸去盖玻片边缘多余的封片介质。将完成的载玻片置于暗处室温下干燥，然后进行显微镜观察。对剩余载玻片重复此过程。

结果

成年野生型（WT）和 MT-TGFα 小鼠在处死前连续2周饮用含硫酸锌的水（25 mM ZnSO4）。WT 小鼠的胃在大体和组织学上均表现正常。相比之下，MT-TGFα 小鼠的胃大体明显增厚（图2A）。显微镜下，这些胃组织显示出显著的胃小凹上皮增生，并伴有壁细胞和主细胞的丧失（图2B- D），重现了巨大肥厚性胃炎（Ménétrier病，MD）的组织学特征。主细胞的丢失可能通过两种不同方式发生：主细胞死亡，或由主细胞来源的分泌痉挛性多肽的化生（SPEM）。为了区分这两种可能性，我们通过将Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG小鼠与MT-TGFα小鼠杂交，对主细胞进行谱系示踪。首先给予低剂量他莫昔芬（37.5 mg/kg，腹腔注射，连续7天）标记主细胞中的GFP，随后在饮水中添加ZnSO4以诱导TGFα过表达。我们在MT-TGFα小鼠中仅观察到极少数GFP标记的细胞（数据未显示）。此外，在有或无ZnSO4处理的情况下，MT-TGFα小鼠在大体形态和组织学上均未见明显差异 (图3A-C）。这一发现的可能解释是，TGFα可能降低了Mist1的表达，而Mist1是主细胞所必需的一种转录因子18，并削弱了Mist1-CreERT2等位基因的有效性。事实上，在未接受ZnSO4处理的MT-TGFα小鼠中，Mist1的免疫组织化学染色信号已消失（图3D).

为了克服MT-TGFα小鼠模型的渗漏性问题，我们采用了多西环素诱导的Doxi-TGFα转基因模型。该模型通过将TetO-TGFα小鼠14与CMV-rtTA小鼠品系13杂交获得；此前已有报道指出rtTA在胃中表达。我们证实，在该新型MD小鼠模型中，经过2周的多西环素处理可诱导出颈黏液细胞增生以及壁细胞和主细胞数量减少（图4A-C）。与MT-TGFα小鼠的组织形态学特征相比，Doxi-TGFα小鼠表现出较轻的黏膜增厚和颈黏液细胞增生，以及壁细胞减少程度较轻（补充图2）。尽管如此，我们仍利用Mist1-CreERT2小鼠品系对主细胞进行谱系示踪，并证实主细胞谱系也可被GSII和CD44v920,21标记，从而确认TGFα过表达可诱导主细胞转化为SPEM（图4D）。

本研究表明，MT-TGFα 小鼠模型在未进行重金属处理的情况下，仍能模拟出木村病（MD）的组织病理学特征，这可能是由于启动子/增强子本身存在渗漏性，和/或无法完全避免重金属暴露所致（图3 和 补充图2）。由于 TGFα 会抑制 Mist1 的表达，因此 Mist1-CreERT2 小鼠品系无法用于 MT-TGFα 小鼠模型中。我们构建了一种新的 MD 小鼠模型，其 TGFα 表达可通过多西环素处理来诱导。利用这一新型的 Doxi-TGFα MD 小鼠模型，我们证实了 TGFα 的过表达可诱导主细胞来源的 SPEM（幽门腺化生）。当需要精确控制 TGFα 表达，或需利用 Mist1-CreERT2 小鼠品系对主细胞进行遗传学操作时，该 Doxi-TGFα MD 小鼠模型将具有重要应用价值。

数据可用性：

所有原始数据均可作为补充文件获取。

胃解剖过程；福尔马林固定；包埋；组织学制备示意图。
图1：胃组织固定与包埋制备流程图。（A）沿十二指肠短段（3–5 mm）一并切除胃组织。（B）使用带移液器头的注射器从十二指肠注入PBS，并用手指轻轻挤压3次，以清除管腔内容物。（C）通过十二指肠用注射器向胃内注入福尔马林，并夹闭胃十二指肠交界处以保留固定液。（D）将胃组织完全浸入福尔马林中，在4 °C条件下振荡过夜固定。（E）使用剃刀片切除前胃和十二指肠部分，并用PBS冲洗。（F）将胃体和幽门部以横截面方式切成3–4个环状组织片，将其嵌入2%琼脂糖中以维持胃组织环的空间取向。（G）将琼脂糖包埋的组织置于包埋盒中。请点击此处查看该图的放大版本。

硫酸锌对胃组织的影响；组织学图像、免疫染色、细胞分析图表
图2ZnSO₄处理的MT-TGFα小鼠的大体及显微表型 (AMT-TGFα小鼠（右）的胃壁比对照组小鼠（左）更厚。BMT-TGFα小鼠的胃组织（右侧）显示明显的胃小凹上皮增生及壁细胞缺失。黄色箭头指示壁细胞，绿色箭头指示胃小凹细胞。比例尺表示 100 µm. (C免疫荧光染色证实，MT-TGFα小鼠胃（右）中表面黏液细胞（UEA1阳性）和幽门型化生细胞（GIF与GSII双阳性）数量增加，而壁细胞（H+/+-ATPase 阳性）和主细胞（GIF 单阳性）较对照组小鼠胃组织（左）增多。比例尺表示 100 µm. (D) 对经 ZnSO4 处理的野生型（WT）小鼠（n = 5）和 MT-TGFα 小鼠（n = 3）中不同上皮细胞类型及黏膜厚度进行定量分析。误差线表示标准差（**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001). 请点击此处以查看此图的放大版本。

小鼠胃组织的组织学分析与细胞定量，ZnSO4处理，图表；DAPI，GSII。
图3：MT-TGFα小鼠在未接受重金属处理的情况下出现胃部表型。 (A) 未经重金属处理的MT-TGFα小鼠胃组织（右侧）显示明显的颈黏液细胞增生以及壁细胞缺失。黄色箭头指示壁细胞，绿色箭头指示颈黏液细胞。比例尺为100 µm。(B) 免疫荧光染色证实，与对照组小鼠胃组织（左侧）相比，未经重金属处理的MT-TGFα小鼠胃组织（右侧）中颈黏液细胞（UEA1阳性）和幽门化生细胞（SPEM细胞，GIF与GSII双阳性）数量增加，而壁细胞（H+/K+-ATPase阳性）和主细胞（GIF单阳性）数量减少。比例尺为100 µm。(C) 对未接受ZnSO4处理的野生型小鼠（n = 5）和接受ZnSO4处理的MT-TGFα小鼠（n = 3）中不同上皮细胞类型及黏膜厚度的定量分析。误差线表示标准差（***p < 0.001，****p < 0.0001）。(D) MT-TGFα小鼠胃组织（右侧）显示Mist1表达缺失，而Mist1通常在主细胞中表达（左侧）。GSII是黏液颈细胞的标志物。比例尺为100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

组织学分析；免疫荧光显微镜；胃黏膜；野生型与Dox-TGFα比较。
图4：强力霉素诱导型TGFα小鼠模型（Doxi-TGFα）可重现Ménétrier病的表型，且该小鼠模型中证实了SPEM的形成。（A）CMV-rtTA; TetO-TGFα小鼠（Doxi-TGFα；右侧）的胃组织显示明显的颈黏液细胞增生以及壁细胞数量减少。黄色箭头指示壁细胞，绿色箭头指示颈黏液细胞。比例尺为100 µm。（B）免疫荧光染色证实，与对照组小鼠胃组织（左侧）相比，Doxi-TGFα小鼠胃组织（右侧）中颈黏液细胞（UEA1阳性）和SPEM细胞（GIF与GSII双阳性）数量增加，而壁细胞（H+/K+-ATP酶阳性）和主细胞（GIF单阳性）数量减少。比例尺为100 µm。（C）野生型小鼠（n = 5）与Doxi-TGFα小鼠（n = 5）中不同上皮细胞类型数量及黏膜厚度的定量分析。误差线表示标准差（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。（D）利用Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG小鼠品系对主细胞（GFP阳性）进行谱系示踪，结果显示在Doxi-TGFα小鼠胃组织中，GFP阳性细胞也呈GSII和CD44v9阳性，证实SPEM由主细胞转化而来；而对照组胃组织（左侧）中几乎无GFP阳性细胞同时表达GSII或CD44v9。比例尺为100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：低剂量他莫昔芬（TMX）处理不会引起胃黏膜损伤。连续七天的低剂量TMX处理（37.5 mg/kg）不会导致胃黏膜损伤，表现为壁细胞数量保持稳定。（A）未接受TMX处理（左图）和接受TMX处理（右图）的小鼠胃组织代表性H&E染色图像。比例尺为100 µm。（B）野生型小鼠（n = 5）与接受TMX处理的野生型小鼠（n = 5）每胃单位壁细胞数量的定量分析。请点击此处下载该文件。

补充图2：不同 Menetrier 病（MD）小鼠模型间表型的比较 (A) 添加ZnSO4的MT-TGFα，未添加ZnSO4的MT-TGFα 处理，Doxi-TGFα MD 小鼠模型表现出胃小凹增生、壁细胞和主细胞丢失、痉挛性多肽表达性肠化生（SPEM）细胞（GIF 与 GSII 共定位细胞）增加以及黏膜增厚。MT-TGFα 模型中，有或无 ZnSO4 处理组之间未见表型差异。Doxi-TGFα 小鼠模型的表型较 MT-TGFα 小鼠模型更轻。 请点击此处下载此文件。

讨论

Menetrier病（MD）是一种罕见的胃癌前病变，由TGFα过表达引起1,2,3。迄今为止，唯一用于MD研究的小鼠模型是金属硫蛋白基因增强子/启动子（MT-TGFα）驱动TGFα过表达的转基因小鼠4,5。由于金属硫蛋白基因对重金属具有响应性，因此通常通过在饮水中添加硫酸锌或注射硫酸镉来诱导该小鼠模型中TGFα的表达5,8。MD的一个典型表型特征是胃腺底部的主细胞被黏液细胞取代，这些黏液细胞同时表达颈黏液细胞和幽门黏液细胞的标志物。这种现象可能由主细胞死亡或主细胞重编程为表达解痉多肽的化生（SPEM）所致8,11。这可通过在MD小鼠模型中对主细胞进行谱系示踪加以验证。我们尝试利用Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG小鼠对主细胞进行谱系示踪，其中Mist1阳性的主细胞被标记为膜定位的GFP。然而，在MT-TGFα小鼠中仅观察到少量GFP标记的细胞。这提示可能是由于TGFα过表达导致大多数GFP标记的主细胞死亡，或者主细胞中GFP标记效率过低。已有报道表明TGFα过表达并未显著增加细胞死亡8，因此我们进一步考察了在未进行重金属处理的情况下MT-TGFα小鼠中Mist1表达缺失的可能性。令人意外的是，即使未进行重金属处理，MT-TGFα小鼠仍表现出完整的表型，包括胃小凹增生以及壁细胞和主细胞的丢失。我们还证实，即使在未接受重金属处理的情况下，MT-TGFα小鼠中的Mist1表达也已丧失。先前已有报道指出，由于无法完全避免环境中重金属的暴露，MT-TGFα小鼠中TGFα的表达并未受到严格调控；然而，重金属处理可显著增强TGFα的表达8。此前尚未对未接受重金属处理的MT-TGFα小鼠进行全面的表型评估。本研究表明，MT-TGFα小鼠在无重金属诱导的情况下即可出现完全的表型表现。

由于在MT-TGFα小鼠中，即使在重金属处理之前Mist1的表达已经丢失，因此仍需要另一种小鼠模型，其中TGFα的表达可被特异性调控，从而确保在未诱导TGFα过表达时不会出现表型。我们建立了一种新型的MD小鼠模型，该模型通过多西环素处理（Doxi-TGFα）诱导TGFα表达。我们证实该小鼠模型可诱导颈黏膜增生以及壁细胞和主细胞的丢失，这些正是MD的主要表型。在此小鼠模型中，我们利用Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG小鼠对主细胞进行了谱系示踪，发现部分GFP标记的细胞也表达GSII和CD44v9，证实了该新型MD小鼠模型中存在SPEM。这是首次报道证实SPEM可在TGFα过表达的胃组织中发生。SPEM是一种更为常见的胃癌前病变，这可能是MD患者胃癌发生率升高的原因22，23。

使用 Mist1-CreERT2 小鼠品系的一个注意事项是，已有报道指出 Mist1 也可在胃干细胞中表达24。我们发现，低剂量（37.5 mg/kg）他莫昔芬处理可诱导 Cre 激活，更特异性地发生在主细胞中，即使在多西环素处理前的较早时间点，颈区的激活也极少。类似的结果此前已有报道25。利用 Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG 小鼠进行谱系示踪显示，GFP 阳性细胞靠近 GFP 与 SPEM 标记物（GSII 和 CD44v9）双阳性细胞，主要定位于主细胞所在的腺体基底部（图 4C）。如果这些 GFP 与 SPEM 标记物双阳性细胞来源于干细胞，则应观察到更多 GFP 阳性细胞向位于颈区的干细胞位置分布。另一种方法是，可将多西环素诱导型 GIF-rtTA 小鼠品系26 或 GPR30-rtTA 小鼠品系27 与 MT-TGFα 小鼠联用，以实现对主细胞的遗传修饰或谱系示踪。然而，在未接受 ZnSO4 处理的 MT-TGFα 小鼠中，GIF 阳性细胞减少（图 3B、C），而 GPR30 阳性细胞在 SPEM 中丢失，该现象也出现在未接受 ZnSO4 处理的 MT-TGFα 小鼠中。因此，与 Doxi-TGFα 小鼠和 Mist1-CreERT2 小鼠杂交相比，这些方法效率较低。

本研究表明，MT-TGFα小鼠在未接受重金属处理的情况下，胃组织中即可出现完全的表型改变。我们还发现其中一种表型表现为Mist1表达的丢失，这限制了Mist1-CreERT2; R26-LSL-mTmG小鼠品系在主细胞谱系示踪中的应用。我们构建了一种新型的壁细胞丢失（MD）小鼠模型Doxi-TGFα，并首次利用该模型证实SPEM可在MD中发生。这一新型MD小鼠模型在需要精确控制MD表型发展进程以及需利用Mist1-CreERT2小鼠品系对主细胞进行遗传修饰时具有重要应用价值。MD表型由TGFα过表达引发的EGFR信号通路激活所诱导。然而，目前尚不清楚在哪些细胞类型中发生的EGFR激活导致了所观察到的表型。利用Doxi-TGFα小鼠模型，我们目前正在研究EGFR信号在不同类型细胞（包括利用Mist1-CreERT2小鼠品系标记的主细胞）中的作用。

披露

所有作者均无利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（资助号：K08 DK124686，授予 WJH）资助。感谢 Gina Della Porta 和 Sarah E. Glass 对稿件的编辑工作。

作者贡献：
TTG 进行了实验，生成了图表，撰写了手稿，并对手稿进行了修改。JDP 进行了实验，生成了图表，撰写了手稿，并对手稿进行了修改。SKM 提供了 TetO-TGFα 小鼠品系，并对手稿进行了修改。RJC 设计了实验，并对手稿进行了修改。WJH 设计了实验，进行了实验，分析了解释数据，检索了文献，撰写了手稿，并对手稿进行了修改。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠抗 H+/K+-ATPase 抗体Eunyoung Choi 博士惠赠不适用稀释比例：1:10000
抗体稀释液Abcam559148
抗兔 GFP 抗体Life Technologies CorporationA11122稀释比例：1:500
带电荷载玻片Fisher22-178-277
盖玻片Globe Scientific1411-10
驴抗小鼠 594InvitrogenA12102稀释比例：1:500
驴抗兔 488InvitrogenA21206稀释比例：1:500
驴抗兔 594InvitrogenA21207稀释比例：1:500
驴抗大鼠 594InvitrogenA21209稀释比例：1:500
盐酸多西环素TCID4116
Flouromount-GThermo Fisher00-4958-02
GSII 488InvitrogenL21415稀释比例：1:500
疏水性标记笔Electron Microscopy Sciences71312
培养箱LabnetI 5110
MIST1/bHLHa15 (D7N4B) XP 兔单克隆抗体Cell Signaling14896S稀释比例：1:200
压力锅（6QT）CuisinartCPC-600N1
蛋白封闭剂AbcamAB64226
兔抗 GIF 抗体MyBioSourceMBS2028736稀释比例：1:200
大鼠抗 CD44v9 单克隆抗体Cosmo BioLKG-M002稀释比例：1:20000
染色缸SimportM906-12AS
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648
TrilogySigma922P-10-RUO
UEA1 Dylight 649Vector LaboratoriesDL-1068稀释比例：1:500

参考文献

  1. Huh, W. J., Coffey, R. J., Washington, M. K. Menetrier's disease: Its mimickers and pathogenesis. J Pathol Transl Med. 50 (1), 10-16 (2016).
  2. Tanksley, J. Jr, Tanksley, J. Pierre menetrier and his disease. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123, discussion 133-124 126-133 (2012).
  3. Rich, A., et al. Distinguishing menetrier's disease from its mimics. Gut. 59 (12), 1617-1624 (2010).
  4. Takagi, H., Jhappan, C., Sharp, R., Merlino, G. Hypertrophic gastropathy resembling menetrier's disease in transgenic mice overexpressing transforming growth factor alpha in the stomach. J Clin Invest. 90 (3), 1161-1167 (1992).
  5. Dempsey, P. J., et al. Possible role of transforming growth factor alpha in the pathogenesis of menetrier's disease: Supportive evidence form humans and transgenic mice. Gastroenterology. 103 (6), 1950-1963 (1992).
  6. Fiske, W. H., et al. Efficacy of cetuximab in the treatment of menetrier's disease. Sci Transl Med. 1 (8), 8ra18(2009).
  7. Burdick, J. S., et al. Treatment of menetrier's disease with a monoclonal antibody against the epidermal growth factor receptor. N Engl J Med. 343 (23), 1697-1701 (2000).
  8. Goldenring, J. R., et al. Overexpression of transforming growth factor-alpha alters differentiation of gastric cell lineages. Dig Dis Sci. 41 (4), 773-784 (1996).
  9. Sharp, R., et al. Transforming growth factor alpha disrupts the normal program of cellular differentiation in the gastric mucosa of transgenic mice. Development. 121 (1), 149-161 (1995).
  10. Bockman, D. E., Sharp, R., Merlino, G. Regulation of terminal differentiation of zymogenic cells by transforming growth factor alpha in transgenic mice. Gastroenterology. 108 (2), 447-454 (1995).
  11. Nomura, S., et al. Evidence for repatterning of the gastric fundic epithelium associated with menetrier's disease and tgfalpha overexpression. Gastroenterology. 128 (5), 1292-1305 (2005).
  12. Shi, G., et al. Loss of the acinar-restricted transcription factor mist1 accelerates kras-induced pancreatic intraepithelial neoplasia. Gastroenterology. 136 (4), 1368-1378 (2009).
  13. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10933-10938 (1996).
  14. Hardie, W. D., et al. Conditional expression of transforming growth factor-alpha in adult mouse lung causes pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L741-L749 (2004).
  15. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (3), 365-367 (2019).
  16. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24.e7 (2012).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  18. Ramsey, V. G., et al. The maturation of mucus-secreting gastric epithelial progenitors into digestive-enzyme secreting zymogenic cells requires mist1. Development. 134 (1), 211-222 (2007).
  19. Huh, W. J., et al. Xbp1 controls maturation of gastric zymogenic cells by induction of mist1 and expansion of the rough endoplasmic reticulum. Gastroenterology. 139 (6), 2038-2049 (2010).
  20. Engevik, A. C., et al. The development of spasmolytic polypeptide/tff2-expressing metaplasia (spem) during gastric repair is absent in the aged stomach. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (5), 605-624 (2016).
  21. Wada, T., et al. Functional role of cd44v-xct system in the development of spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia. Cancer Sci. 104 (10), 1323-1329 (2013).
  22. Halldorsdottir, A. M., et al. Spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia (spem) associated with gastric cancer in iceland. Dig Dis Sci. 48 (3), 431-441 (2003).
  23. Yamaguchi, H., Goldenring, J. R., Kaminishi, M., Lee, J. R. Identification of spasmolytic polypeptide expressing metaplasia (spem) in remnant gastric cancer and surveillance postgastrectomy biopsies. Dig Dis Sci. 47 (3), 573-578 (2002).
  24. Hayakawa, Y., et al. Mist1 expressing gastric stem cells maintain the normal and neoplastic gastric epithelium and are supported by a perivascular stem cell niche. Cancer Cell. 28 (6), 800-814 (2015).
  25. Saenz, J. B., Vargas, N., Cho, C. J., Mills, J. C. Regulation of the double-stranded rna response through adar1 licenses metaplastic reprogramming in gastric epithelium. JCI Insight. 7 (3), e153511(2022).
  26. Caldwell, B., Meyer, A. R., Weis, J. A., Engevik, A. C., Choi, E. Chief cell plasticity is the origin of metaplasia following acute injury in the stomach mucosa. Gut. 71 (6), 1068-1077 (2022).
  27. Hata, M., et al. Gpr30-expressing gastric chief cells do not dedifferentiate but are eliminated via pdk-dependent cell competition during development of metaplasia. Gastroenterology. 158 (6), 1650-1666.e15 (2020).

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